阅读说明：本技术 一种l-丝氨酸转运蛋白及其应用 (L-serine transport protein and application thereof ) 是由 许正宏 高宇洁 史劲松 张晓梅 颜文斌 杨玲 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种L-丝氨酸转运蛋白及其应用,属于生物工程技术领域。本发明在研究氨基酸转运蛋白基础上,发现了一种来源于谷氨酸棒杆菌的NCgl2054蛋白,其具有转运L-丝氨酸功能。通过基因工程手段,将NCgl2054蛋白在产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ΔSSA实现过表达,能够将L-丝氨酸的产量提高至29.9g/L。这为代谢工程改造菌株提高L-丝氨酸产量提供了新思路。(The invention discloses an L-serine transport protein and application thereof, belonging to the technical field of biological engineering. On the basis of researching amino acid transport protein, the invention discovers NCgl2054 protein derived from corynebacterium glutamicum, which has the function of transporting L-serine. The NCgl2054 protein is over-expressed in the L-serine-producing Corynebacterium glutamicum delta SSA by a genetic engineering means, so that the yield of the L-serine can be improved to 29.9 g/L. The method provides a new idea for improving the L-serine yield by metabolic engineering strain.)

一种L-丝氨酸转运蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种L-丝氨酸转运蛋白及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-丝氨酸是一种非必需氨基酸，在医药、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。谷氨酸棒杆菌是食品安全级菌株，广泛应用于L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸等氨基酸的生产。然而一般的谷氨酸棒杆菌却不能利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸。

目前国内外对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的研究集中在其合成和降解途径的分子改造，Stolz等以不产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，构建的重组菌以葡萄糖和果糖为混合碳源时L-丝氨酸产量36.2g/L(引自文献：Peters-Wendisch P,Stolz M,Etterich H,et al.Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for L-Serine Production[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(11):7139-7144.)。来书娟等在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中加强表达3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，增加了L-丝氨酸前体3-磷酸甘油酸的合成，提高了L-丝氨酸的产量(引自文献：来书娟,张芸,刘树文,等.产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造和代谢流分析[J].中国科学:生命科学,2012,42(4):295-303.)。

发明人前期从自然界中筛选得到一株能利用糖质原料发酵产L-丝氨酸的野生型谷氨酸棒杆菌SYPS-062，以它为出发菌株通过多轮化学诱变获得突变株C.glutamicumSYPS-062-33a。该突变株L-丝氨酸产量提高65％，达到11.0g/L，副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的积累量也明显提高。进一步在突变株上解除L-丝氨酸合成途径关键酶反馈抑制，敲除降解途径，阻断和弱化副产物积累途径，所获得重组菌C.glutamicum SYPS-062 33aΔSSA(缩写为ΔSSA)(CGMCC NO.8668)其L-丝氨酸摇瓶产量可以达到26.25g/L，是野生型菌株的3.9倍。

尽管代谢工程改造L-丝氨酸合成和降解途径的基因取得很好的效果，但是为了适用工业规模的生产，目前L-丝氨酸的产量仍需要提高。氨基酸的转运出胞是其在培养基中积累的重要前提，所以为了实现氨基酸大量生产，转运系统受到越来越多的关注。近几十年，在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中，人们鉴定了许多氨基酸转运出胞蛋白，并利用代谢工程将其用于提高氨基酸的产量，例如赖氨酸转运蛋白LysE、苏氨酸转运蛋白ThrE、半胱氨酸转运蛋白EamA、蛋氨酸转运蛋白BrnFE等，但是仅有报道苏氨酸转运蛋白ThrE可以转运丝氨酸。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种L-丝氨酸转运蛋白NCgl2054，含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码上述L-丝氨酸转运蛋白NCgl2054的基因。

在本发明的一种实施方式中，上述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的质粒或载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括但不限于pXMJ19质粒载体、pDXW系列载体、pET系列载体或pPICZ系列载体。

本发明的第四个目的是提供表达上述L-丝氨酸转运蛋白NCgl2054的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括但不限于大肠杆菌、棒杆菌、芽孢杆菌、酵母菌或丝状真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主为谷氨酸棒杆菌ΔSSA。

所述谷氨酸棒杆菌ΔSSA的构建方法公开于文献：罗玉常.产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌SYPS-062的代谢工程[D].江南大学,2012.中。

本发明的第五个目的是提供一种提高丝氨酸产量的方法，是先在谷氨酸棒杆菌ΔSSA中过表达丝氨酸转运蛋白NCgl2054，得到过表达丝氨酸转运蛋白NCgl2054的基因工程菌，再应用该基因工程菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的培养基包括蔗糖90-110g/L，硫酸铵20-40g/L，碳酸钙50-70g/L，MgSO4·7H₂O 0.5-1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01-0.05g/L，MnSO4·H₂O0.01-0.05g/L，原儿茶酸20-40mg/L，生物素40-60μg/L，硫胺素400-500μg/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为于28-32℃，100-140rpm条件下发酵60-150h。

本发明的第六个目的是提供上述L-丝氨酸转运蛋白NCgl2054在制药、食品或化妆品领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供一种新型L-丝氨酸转运蛋白NCgl2054，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，全长936个核苷酸，编码312个氨基酸。通过基因工程手段，将NCgl2054蛋白在产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌ΔSSA实现过表达，能够将L-丝氨酸的产量提高至29.9g/L。这为代谢工程改造菌株提高L-丝氨酸产量提供了新思路。

附图说明

图1是thrE敲除和过表达重组菌发酵特性评价，其中，A：重组菌ΔSSAΔthrE；B：重组菌ΔSSA-thrE。

图2是敲除NCgl2054基因重组菌ΔSSAΔ2054发酵特性评价。

图3是过表达NCgl2054基因重组菌ΔSSA-2054发酵特性评价。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

(一)培养基

种子培养基：脑心浸液37g/L；葡萄糖20g/L；(NH₄)₂SO₄ 10g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5g/L；K₂HPO₄ 0.2g/L；NaH₂PO₄ 0.3g/L。

CGXⅡ基本培养基：葡萄糖40g/L，尿素5g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄0.25g/L，MOPS 42g/L，CaCl₂ 10mg/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，ZnSO₄ 1mg/L，CuSO₄ 0.2mg/L，NiCl₂·6H₂O 0.02mg/L，生物素0.2mg/L，原儿茶酸0.03g/L。

发酵培养基：蔗糖100g/L，硫酸铵30g/L，碳酸钙60g/L，MgSO4·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02g/L，MnSO4·H₂O 0.02g/L，原儿茶酸30mg/L，生物素50μg/L，硫胺素450μg/L，调节初始pH为7.0。

(二)谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法

步骤一：利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

步骤二：以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，设计基因敲除特异的引物分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段；

步骤三：将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌。

(三)谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因过表达的方法

步骤一：利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCC NO.8668)的基因组；

步骤二：以ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物扩增得到基因片段；

步骤三：将目的基因片段与表达质粒pDXW-10连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌。

(四)重组谷氨酸棒杆菌发酵培养方法

将重组谷氨酸棒杆菌接种于种子平板上分三区划线，培养3d后，挑取单菌落于种子平板上密集划线，培养3d后，将平板上的菌接种于20mL种子液中，30℃、120rpm过夜培养约12-16h，至OD₅₆₂为25，加入到25mL发酵培养基中使OD₅₆₂为1，30℃、120rpm培养5d，每12h测其OD₅₆₂和氨基酸浓度。

(五)L-丝氨酸转运蛋白功能的验证

氨基酸二肽的添加是氨基酸转运蛋白功能验证常用的实验方法。为了对L-丝氨酸的转运蛋白进行验证，在南京肽业公司合成了L-丝氨酸二肽(L-ser-ser)用于L-丝氨酸转运实验。将谷氨酸棒杆菌于固体种子平板上活化，后接种至液体种子培养基中过夜培养，长至对数生长期。收集对数生长期的菌体，使用CGXⅡ基本培养基洗涤2次，接种到CGXⅡ基本培养基中，加入3mM L-ser-ser二肽，30℃预培养2h。收集预培养的菌体，使用预冷的CGXⅡ基本培养基洗涤2次。按初始OD₅₆₂＝8-10将菌体接种到50mL CGXⅡ基本培养基中，加入L-ser-ser二肽开始转运实验，使得终浓度为3mM。每隔15min取样1mL，取样立即离心，取出上清保存至-80℃冰箱，至120h后终止反应，随后高效液相色谱法测定胞外的L-丝氨酸浓度。

(六)高效液相色谱法测定L-丝氨酸浓度

1.溶液配制

三乙胺乙腈：取0.7mL的三乙胺添加到4.3mL的乙腈中。

异硫氰酸苯酯乙腈(PITC)溶液：取异硫氰酸苯酯25μL添加到2mL的乙腈中。

流动相A：称15.2g无水乙酸钠，水1850mL,溶解后用冰醋酸调pH至6.5，加入140mL乙腈，混匀后用0.45μm有机滤膜过滤。

流动相B：80％的乙腈。

2.氨基酸样品衍生

取氨基酸标准样品及稀释过的发酵液样品200μL，每管中加入20μL正亮氨酸内标溶液。随后，分别加入100μL的三乙胺乙腈和异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀后室温静置1h，加入正己烷400μL,剧烈震荡混匀后静置10min,取下层溶液200μL，加入800μL超纯水稀释后，用0.45μm有机滤膜过滤后上样。

3.HPLC反应条件

色谱柱：Venusil AA，4.6×250nm，5μm；紫吸收波长：254nm；柱温：40℃；流速：1mL/min；进样体积：10μL。流动相梯度洗脱，洗脱程序为:0-4min，100％流动相A:4-16min，97％流动相A：16-17min，89％流动相A：17-32min，79％流动相A；32-34min，66％流动相A；34-38min，0％流动相A；38.01min，100％流动相A。

实施例1 L-苏氨酸转运蛋白ThrE对ΔSSA产L-丝氨酸的影响

ThrE是谷氨酸棒杆菌中L-苏氨酸的转运蛋白。因为L-苏氨酸和L-丝氨酸在化学结构上具有相似性，文献报道ThrE也有转运丝氨酸的作用，所以本实施例说明ThrE对谷氨酸棒杆菌ΔSSA产L-丝氨酸的影响。

1、按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中基因敲除的方法实现thrE的敲除。

(1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCCNO.8668)的基因组；

(2)利用特异性引物thrE-1:5’-GCTCTAGACATCAATCTGGTCAACGAA和thrE-2:5’-GACATGGAGATGAGCTAAGAATGCGGCCACGAAGGGTC扩增目的基因的左同源臂；利用特异性引物thrE-3:5’-CTTAGCTCATCTCCATGTCTCAACCCATACCGTGCATT和thrE-4:5’-CCCAAGCTTATCATCCATATAAGATCCG扩增目的基因的右同源臂，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段；

(3)将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌ΔSSAΔthrE。

2、按照谷氨酸棒杆菌ΔSSA中过表达的方法实现thrE的过表达。

(1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCCNO.8668)的基因组；

(2)以谷氨酸棒杆菌ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物thrE-F：5’-GAAGATCTAGAAGGAGATATACCATGTTGAGTTTTGCGACCCT和thrE-R：5’-CCCAAGCTTTTACCTTTTATTACCGAATC)扩增得到基因片段；

(3)将目的基因片段与表达质粒pDXW-10连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌。

在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔthrE、ΔSSA-thrE的发酵特性，用于说明其对ΔSSA产L-丝氨酸的影响。从图1A中可以看出，敲除L-苏氨酸的转运蛋白ThrE，对菌株生长和L-丝氨酸的产量未造成显著的影响；从图1B中可以发现，过表达ThrE后，L-丝氨酸产量并未提高，说明L-苏氨酸转运蛋白ThrE对于提高L-丝氨酸产量没有显著影响。

实施例2敲除NCgl2054基因对ΔSSA产L-丝氨酸的影响

通过菌株谷氨酸棒杆菌ΔSSA与ATCC13032的转录组测序对比发现，NCgl2089、NCgl2662、NCgl2054转录水平均有上调，猜测上述基因与L-丝氨酸的转运出胞有关。

敲除NCgl2054基因的步骤如下：

(1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCCNO.8668)的基因组；

(2)利用特异性引物NCgl2054-1:GGTACCCGGGGATCCTCTAGATAGCCCTAGTTCCATGATTGAGATC和NCgl2054-2:CTAGCTTCATATTTGTGGGCAAAATGGCG扩增目的基因的左同源臂；利用特异性引物NCgl2054-3:GCCCACAAATATGAAGCTAGATTCCATTGATCGC和NCgl2054-4:ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCCTTCACTAGATGAAAAAGATTCA TG扩增目的基因的右同源臂，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的同源臂片段；

(3)将同源臂片段连接到谷氨酸棒杆菌敲除质粒pk18mobsacB，构建得到重组敲除质粒，并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素和10％蔗糖平板进行筛选，然后通过PCR验证，得到基因敲除的重组菌ΔSSAΔ2054。

在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔ2054的发酵特性，结果见图2。从图2中可以看出，敲除NCgl2054后，L-丝氨酸的产量却发生显著的下降。发酵120h，重组菌ΔSSAΔ2054的L-丝氨酸积累量为21.08g/L，与出发菌株ΔSSA相比下降了19.2％，说明NCgl2054是L-丝氨酸一个极其重要的转运蛋白。

实施例3过表达NCgl2054基因对ΔSSA产L-丝氨酸的影响

将L-丝氨酸转运蛋白运用于谷氨酸棒杆菌ΔSSA中，构建过表达NCgl2054的重组菌ΔSSA-2054。

过表达NCgl2054基因的步骤如下：

(1)利用上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒提取谷氨酸棒杆菌ΔSSA(CGMCCNO.8668)的基因组；

(2)以谷氨酸棒杆菌ΔSSA的基因组作为模板，使用Takara公司的高保真酶，以及基因特异的引物NCgl2054-F:5’-CGCCTCGAGGGATCCAGATCTTTGTGATTCACGCAGGGGC和NCgl2054-R:5’-CATCCGCCAAAACAGAAGCTTTACTGCACAATAGCCTAGTTGAGGTG扩增得到基因片段；

(3)将目的基因片段与表达质粒pDXW-10连接，构建过表达重组质粒并将其电转入ΔSSA感受态中，利用卡那霉素筛选重组菌，并提取质粒进行验证，得到正确的重组菌ΔSSA-2054。

在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSA-NCgl2054的发酵特性，结果见图3。从图3中可以看出，过表达NCgl2054后，L-丝氨酸积累量为29.9g/L，比出发菌株ΔSSA提高了14.8％，说明成功地将NCgl2054应用于提高L-丝氨酸产量。

对比例1

按照本申请提供的基因敲除方法敲除谷氨酸棒杆菌ΔSSA中编码NCgl2662蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，得到重组菌ΔSSAΔ2662。

在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔ2662的发酵特性，结果表明，敲除NCgl2662蛋白后，发酵敲除菌株120h，重组菌ΔSSAΔ2662的L-丝氨酸积累量为27.6g/L，与出发菌株ΔSSA相比，L-丝氨酸积累量提升5％，对菌株生长与L-丝氨酸产量并未产生显著影响。

对比例2

按照本申请提供的基因敲除方法敲除谷氨酸棒杆菌ΔSSA中编码NCgl2089蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，得到重组菌ΔSSAΔ2089。

在以100g/L蔗糖为底物的发酵培养基中评价重组菌ΔSSAΔ2089的发酵特性，结果表明，敲除NCgl2089蛋白后，发酵敲除菌株120h，重组菌ΔSSAΔ2089的L-丝氨酸积累量为26.14g/L，与出发菌株ΔSSA相比，L-丝氨酸积累量提升0.38％，对菌株生长与L-丝氨酸产量并未产生显著影响。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种L-丝氨酸转运蛋白及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttgtgattca cgcaggggct tgaggattaa gaacggaacc gcccggagcg caaaagtaat 60

gactgcacat actgcgacaa caaggagaat ataggagaaa tcagttgtca tttagcagcc 120

tttcccaaga agaagtaccg gatggtcaac agacccaaga agatcagcag cgccgcaaat 180

agggcctgac ctggaattac cacaagagca atggtgaagc tcaagcctgc gagcagcaga 240

gaaggcatct gctttttcgt tcggcaggaa tccaaagtca gcgtgacaaa gagagcgcaa 300

agggcgaact cgaggccctt aatttcaaaa ggaatcaact ctgcgatcgc cactccggtg 360

agaccgccga atacccagta ggagtgaaac gctatttgca ttgagataag tcgccacgcc 420

gaccagcctg cgggcctggc cgcagtgact gcgtaggctt cgtcgataag cgcgaaaacc 480

gaatagaaac gggcaatggg gtttttgacc acatgcagcg ggaatgaaaa cgcatagaat 540

acgtggcgga agttcaccag caatgtggtg agcgcgatgg cgcccagggg cgctgcgcca 600

acaacgaggg cgatgaccag catttcggtg gagcccgcga aaatcaggcc ggaaaacagt 660

ggggctgccc accattcgta gccgtattga ataaccaaga gaccaaacgc aataccaatc 720

gggtacatgc ccaaacctgc agcaagggag gtttttagac cttgcgcgat ttcgtagcgc 780

cgataacctt tatcacctgg tcccagggct gccttggatg gcgacacctc caggcttgaa 840

tgaatctctt gcgttttttg cacactacaa tcatcacaca attgccggat agttttgttg 900

ccagtttgca cacctcaact aggctattgt gcagta 936

<210> 2

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Leu Phe Thr Gln Gly Leu Glu Asp Glu Arg Asn Arg Pro Glu Arg Lys

1 5 10 15

Ser Asn Asp Cys Thr Tyr Cys Asp Asn Lys Glu Asn Ile Gly Glu Ile

20 25 30

Ser Cys His Leu Ala Ala Phe Pro Lys Lys Lys Tyr Arg Met Val Asn

35 40 45

Arg Pro Lys Lys Ile Ser Ser Ala Ala Asn Arg Ala Pro Gly Ile Thr

50 55 60

Thr Arg Ala Met Val Lys Leu Lys Pro Ala Ser Ser Arg Glu Gly Ile

65 70 75 80

Cys Phe Phe Val Arg Gln Glu Ser Lys Val Ser Val Thr Lys Arg Ala

85 90 95

Gln Arg Ala Asn Ser Arg Pro Leu Ile Ser Lys Gly Ile Asn Ser Ala

100 105 110

Ile Ala Thr Pro Val Arg Pro Pro Asn Thr Gln Glu Asn Ala Ile Cys

115 120 125

Ile Glu Ile Ser Arg His Ala Asp Gln Pro Ala Gly Leu Ala Ala Val

130 135 140

Thr Ala Ala Ser Ser Ile Ser Ala Lys Thr Glu Lys Arg Ala Met Gly

145 150 155 160

Phe Leu Thr Thr Cys Ser Gly Asn Glu Asn Ala Asn Thr Trp Arg Lys

165 170 175

Phe Thr Ser Asn Val Val Ser Ala Met Ala Pro Arg Gly Ala Ala Pro

180 185 190

Thr Thr Arg Ala Met Thr Ser Ile Ser Val Glu Pro Ala Lys Ile Arg

195 200 205

Pro Glu Asn Ser Gly Ala Ala His His Ser Pro Tyr Ile Thr Lys Arg

210 215 220

Pro Asn Ala Ile Pro Ile Gly Tyr Met Pro Lys Pro Ala Ala Arg Glu

225 230 235 240

Val Phe Arg Pro Cys Ala Ile Ser Arg Arg Pro Leu Ser Pro Gly Pro

245 250 255

Arg Ala Ala Leu Asp Gly Asp Thr Ser Arg Leu Glu Ile Ser Cys Val

260 265 270

Phe Cys Thr Leu Gln Ser Ser His Asn Cys Arg Ile Val Leu Leu Pro

275 280 285

Val Cys Thr Pro Gln Leu Gly Tyr Cys Ala Val

290 295

<210> 3

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctaaaacgtt agtctcccga aaccttgatt aataccctca cggctaattg ttataacctc 60

gttaaatttt tatgtctact ctgctgtctc tcctgaaagc gcaaaaaatc gtgatcccca 120

accacaacac tgcacaccca aagttaatga gcgcagggtg gaagatcacc gggtcactca 180

ctggtgtagt ccacacgagg taactgatga aaaacagggc agcaattgcc actgaagcca 240

gcacctcaga ggtggtggtg tgcctgagag aaatcccgat gatgtacaaa taaggcgata 300

ccacggcaaa cactgcccca atacctaaag cccaccagcc ggaagctccg ccggagtcaa 360

gctgcgggcc aacagctacc gccgcgtatc cgatcaagat gacaccgatg gcaagcagga 420

tcgtagaaac ccacgaaatg ctgccccgat gcgttcccag catgttaagc ctctgcggaa 480

tttcctggat gaaccttgat cgccgcggca gccaaagtgg cg 522

<210> 4

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

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tcgagccata aagcgatcta agcccgccac agaaagggtg atatccagcc cactgcttgc 120

tcttgatcta atagtggaga attgggaaag ttcagccgcc cactccgctg cctcatctcc 180

caccaattgg agctgatccc aagcactctt aggcttccgc tttctggcag ctacggcgct 240

tcccgccacc accgcaccgg ccgttcggag agcggattga taggacatct ctagagccag 300

cagaagatca ccttcgccgc ggtaggtatg tgcctgctct aaaaggatgt gcgccttgga 360

gaaaaactgg gccctttttc ctcccactct ctcaaacctc gttgttgctg aaattacgtc 420

acccat 426

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

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cccaagctta tcatccatat aagatccg 28

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gaagatctag aaggagatat accatgttga gttttgcgac cct 43

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cccaagcttt taccttttat taccgaatc 29

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ggtacccggg gatcctctag atagccctag ttccatgatt gagatc 46

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ctagcttcat atttgtgggc aaaatggcg 29

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gcccacaaat atgaagctag attccattga tcgc 34

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

acgacggcca gtgccaagct ttccttcact agatgaaaaa gattcatg 48

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cgcctcgagg gatccagatc tttgtgattc acgcaggggc 40

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

catccgccaa aacagaagct ttactgcaca atagcctagt tgaggtg 47