一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途
阅读说明：本技术 一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途 (Site-directed mutagenesis carrier protein and application thereof in preparation of vaccine ) 是由 王浩猛 晏巧玲 巢守柏 毛慧华 朱涛 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的应用,其中所述的载体蛋白选自白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、细菌的外膜蛋白质和细菌表达蛋白中的一种或两种以上形成的融合蛋白,其中所述载体蛋白上至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸,所述非天然氨基酸含有叠氮基或炔基端基。本发明所述的定点突变的载体蛋白与多糖抗原相互反应过程中,形成共价键,同时结合物呈现连珠式状态,可有效避免载体蛋白与多糖抗原发生过度交联,结合物粒径分布显著均匀可控,为提高多糖蛋白结合疫苗质量提供了有效的手段。(The invention relates to a site-directed mutant carrier protein and application thereof in preparing vaccines, wherein the carrier protein is selected from one or more fusion proteins formed by diphtheria toxoid, a non-toxic mutant of diphtheria toxin, bacterial outer membrane protein and bacterial expression protein, wherein amino acid on at least 1 site on the carrier protein is mutated into unnatural amino acid, and the unnatural amino acid contains an azido group or alkynyl end group. In the mutual reaction process of the carrier protein with site-directed mutagenesis and the polysaccharide antigen, a covalent bond is formed, meanwhile, the conjugate is in a bead-connected state, the carrier protein and the polysaccharide antigen can be effectively prevented from being excessively crosslinked, the particle size distribution of the conjugate is obviously uniform and controllable, and an effective means is provided for improving the quality of the polysaccharide protein conjugate vaccine.)
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地说，本发明涉及一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗，特别是肺炎多价结合疫苗中的用途。
背景技术
由肺炎链球菌导致的感染在世界范围内是导致发病率和死亡率的主要因素之一。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵袭性肺炎链球菌疾病的最常见表现，而细菌在呼吸道内散播可导致中耳感染、鼻窦炎或者复发型支气管炎。
使用与蛋白载体连接的多糖制备多糖蛋白缀合物疫苗，多糖与蛋白载体的化学键可诱导针对在其表面上展现疫苗所包含的多糖的细菌的免疫应答，由此预防疾病，因此，使用来自致病细菌的多糖的疫苗接种是增强宿主免疫力的潜在策略。
尽管多糖自身是免疫原性的，但多糖与载体蛋白的缀合已用于改善免疫原性，载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。
传统的多糖蛋白结合技术，中国专利ZL02159032.X公开了一种多糖蛋白结合疫苗的制备方法，也是目前制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在所述技术中，以己二酸二酰肼(ADH)作为连接剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化，即在碱性条件下用溴化氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与ADH反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂，与ADH一端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼(AH)基团导入多糖分子，形成多糖-AH衍生物；多糖-AH衍生物在碳二亚胺(EDAC)的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位，同时避免了多糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用，但存在一些不足之处：(1)多糖-AH衍生物会继续与溴化氰活化的多糖反应，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖蛋白的结合效率；(2)EDAC在介导ADH衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易引起载体蛋白的自身交联，从而降低多糖蛋白的结合效率，因此，多糖蛋白结合疫苗的免疫原性和抗体持效性仍有待进一步提高，如多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。
利用叠氮和炔的Click反应在生物分子体系中进行修饰是近年来研究的热门领域。Natalie W.Nairn等利用甲硫氨酸缺陷型菌在干扰素β中引入含有叠氮基团的非天然氨基酸，然后利用有铜催化的Click反应进行单位点的PEG修饰(Natalie W.Narin etal,Bioconjugate Chem.2012)。
遗传密码扩展技术，近年来遗传密码扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子为有义编码子，通过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白质中，根据非天然氨基酸的性质，可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止，这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，涉及的非天然氨基酸包括炔基和叠氮等，利用这些生物体重本来不存在的特殊基团，就可以特异性地对蛋白质进行定点修饰。面对现有技术中结合疫苗结合工艺不均一，分离纯化工艺复杂等问题，该领域迫切需要能够任意位点特异性修饰功能基团的方法。
CN106929482A描述了定点突变的流感病毒、其活疫苗及其制备方法和应用，而本发明的修饰载体蛋白Hin47-HID已经证明可预防非侵袭性流感嗜血杆菌，在本发明的一个具体的实施方案中，本发明提供了一种定点引入非天然氨基酸的突变载体蛋白Hin47-HID及其定点修饰的方法，该突变方法为针对蛋白中特定位点引入的非天然氨基酸Lys-azido，其特有的叠氮基团可以特异性地和修饰剂发生Click反应，从而将非天然氨基酸定点偶联在目的蛋白上。
发明内容
本发明涉及一种定点突变和定点修饰的免疫原性组合物、其制备方法及其应用，所述免疫原性组合物在载体蛋白基因的特定位点引入琥珀密码子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA将具有交联性质的非天然氨基酸定点突变到载体蛋白的特定位点。在载体蛋白与多糖抗原相互反应过程中，形成共价键，同时结合物呈现连珠式状态，可有效避免载体蛋白与多糖抗原发生过度交联，结合物粒径分布显著均匀可控，为提高多糖蛋白结合疫苗质量提供了有效的手段。
发明人经过对现有技术的思考和研究，利用古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯赖氨酸-tRNA合成酶(tRNAPyl/PylRS)的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到蛋白中，从而得到定点突变的目的肽或蛋白，如HID-Hin47、Hin47-HID或CRM197，然后将所述定点突变的载体蛋白作为可被进一步定点修饰的原料，对该定点突变的载体蛋白与多糖进行缀合进而得到单一位点定点修饰的载体蛋白的多糖疫苗。
据此，本发明提供了一种定点突变的载体蛋白，其中所述的载体蛋白选自白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、细菌的外膜蛋白质和细菌表达蛋白中的一种或两种以上形成的融合蛋白，其中所述载体蛋白上至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸含有叠氮基或炔基端基。
所述的载体蛋白选自白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体CRM197(SEQ ID NO:1)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、重组绿脓杆菌外毒素A、流感嗜血杆菌脂蛋白HID和流感嗜血杆菌热休克蛋白HIN47中的一种或两种以上形成的融合蛋白。
优选的，所述的载体蛋白选自流感嗜血杆菌脂蛋白HID、融合蛋白HIN47-HID或融合蛋白HID-HIN47。
所述的非天然氨基酸为苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、丝氨酸衍生物或赖氨酸衍生物。优选的，所述的非天然氨基酸为含有叠氮基的赖氨酸衍生物。更优选的，所述的非天然氨基酸为：
在本发明的一个实施方式中，所述的载体蛋白为HIN47-HID融合蛋白，所述突变位点可为SEQ ID NO:2中任何位点上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:2的序列的第174R位，217I位，223N位，226I位，313R位，315K位，522K位，557D位，653E位，684Y位或其他对活性影响较小的位点。
在本发明的一个实施方式中，所述的载体蛋白为HID-HIN47蛋白，所述突变位点可为SEQ ID NO:3中任何位点上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQID NO：3的序列的第78K位，113D位，209E位，240Y位，527R位，570I位，576N位，579I位，666R位，668K位或其他对活性影响较小的位点。
经过突变后，所述定点突变的蛋白与突变前的目的蛋白的氨基酸的序列的区别在于：突变前蛋白氨基酸序列的第N位氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸的连接方式如下式所示：
其中，所述的N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸
本发明还提供一种定点突变的载体蛋白的偶联物，所述的偶联物为本发明所述的定点突变的载体蛋白与含有或修饰的炔基端基的分子制备得到，所述的分子为含有糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物，或者，糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物通过末端炔基的修饰得到的修饰物。
本发明所述的定点突变的载体蛋白与含有或修饰的炔基端基的分子通过Click反应制备得到。所述的Click反应可以为一价铜介导的Click反应，也可以是环辛炔或其衍生物介导的无铜Click反应。
本发明所述的糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物可为糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物的末端炔基的修饰物，通过一价铜的催化作用，实现定点偶联制备得到偶联物，或者糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物为以环辛炔或其衍生物为修饰基的修饰物，直接实现定点偶联。
优选的，本发明所述的定点突变的载体蛋白的偶联物，突变前蛋白氨基酸序列的第N位氨基酸被突变为如下结构：
其中，
N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸，
R2为糖、核酸、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
在本发明的一种实施方式中，所述的偶联物为糖缀合物，所述的糖缀合物为本发明所述的定点突变的载体蛋白与含有或修饰有炔基端基的多糖缀合。
优选的，将本发明所述的定点突变的蛋白与多糖缀合，其中所述多糖:载体蛋白的比率(w/w)为0.3至3。
优选的，所述多糖的每10至50个糖重复单元，在所述载体蛋白与所述多糖直接存在至少一个共价键。
本发明所述的多糖可为末端炔基的修饰物，通过一价铜的催化作用，实现定点偶联制备得到糖缀合物，或者多糖为以环辛炔或其衍生物为修饰基的修饰物，直接实现对目的多糖蛋白的定点偶联。
本申请还提供了一种免疫原性组合物，其中本发明所述的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
所述多糖选自荚膜多糖，例如荚膜多糖为肺炎球菌的血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或33F中的一个或两个以上的组合。
本发明还提供了一种肺炎多价结合疫苗，所述肺炎多价结合疫苗为多价肺炎球菌多糖与两种或两种以上本发明所述的定点突变的载体蛋白形成。
本发明还提供了所述的定点突变的载体蛋白、所述的定点突变的载体蛋白的偶联物，或所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。
优选的，所述的疫苗为流感疫苗或肺炎疫苗。
相比于其他方法，本发明的优点可体现在如下中的一个或几个：
1.可以在蛋白质任意位点引入非天然氨基酸，从而创造可以仅对该位点进行特异性修饰的载体蛋白；
2.利用非天然氨基酸上特有的活性基团，可以实现高效，特异性地修饰目的；
3.特定位点的修饰可以减弱特定功能的蛋白酶活性，降低副作用，实现载体蛋白的作用
4.通过修饰条件的优化，利用环辛炔介导的无铜Click反应，可以实现高效，对蛋白无害，简单易行的修饰反应。
附图说明
图1显示了突变后蛋白Hin47-HID、以click化学反应为得到的多糖蛋白结合物的SDS-PAGE胶图；
图2a显示click化学反应为得到的多糖蛋白结合物的粒径分布图；
图2b显示传统偶联方法得到的多糖蛋白结合物粒径分布图；
图3显示不同偶联方式得到3型结合物在家兔三免Elisa结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1定点突变的载体蛋白表达质粒的构建
1：突变位点的选择
利用在线软件phyre2分别预测了HID和HIN47的三维结构。
在融合蛋白HIN47-HID和HID-HIN47上分别选择了10个关键性氨基酸，这些关键氨基酸位点替代后，不仅可以定点结合多糖，预期会进一步降低HIN47残余蛋白酶活性，有利于提高最终多糖结合产物的稳定性。具体突变位点的信息见表1-表2，其中氨基酸位置是指在SEQ ID NO：2-3所示的序列上的位置。
表1 HIN47-HID突变位点
表2 HID-HIN47突变位点
2：表达质粒的获得
根据NCBI Gene Bank公布的HID及HIN47基因序列，经分别全基因合成获得基因全长DNA片段，然后用GGSGGS六个氨基酸的linker将HIN47与HID蛋白分别以HIN47-linker-HID以及HID-linker-HIN47的顺序融合构建于pET9a载体中，分别获得pET9a-HIN47-HID和pET9a-HID-HIN47表达质粒。
3：定点突变
使用全式金公司的Fast Mutagenesis System定点突变试剂盒，根据其使用说明，用前述ET9a-HIN47-HID和pET9aHID-HIN47表达质粒做模版，使用表3-4中的突变引物对，完成各突变；对于突变后获得的质粒，进行测序验证工作。测序结果表明，均成功将各突变位点基因突变为TAG，得到10个定点突变的质粒。
融合蛋白pET9a-HIN47-HID的10突变克隆命名为：
pET9a-HIN47-HID-R174，pET9a-HIN47-HID-I217，pET9a-HIN47-HID-N223,pET9a-HIN47-HID-I226，pET9a-HIN47-HID-R313，pET9a-HIN47-HID-K315,pET9a-HIN47-HID-K522，pET9a-HIN47-HID-D557，pET9a-HIN47-HID-E653,pET9a-HIN47-HID-Y684。
融合蛋白pET9a-HID-HIN47的10突变克隆命名为：
pET9a-HID-HIN47-K78，pET9a-HID-HIN47-D113，pET9a-HID-HIN47-E209，pET9a-HID-HIN47-Y240，pET9a-HID-HIN47-R527，pET9a-HID-HIN47-I570，pET9a-HID-HIN47-N576，pET9a-HID-HIN47-I579，pET9a-HID-HIN47-R666，pET9a-HID-HIN47-K668。
表3 HIN47-HID突变引物列表
表4 HID-HIN47突变引物列表
实施例2突变载体蛋白的表达和纯化
突变蛋白的Lys-azido掺入表达及纯化
将实施例1的获得的表达质粒pET9a-HIN47-HID-K522在LB培养基中37℃培养12～16小时后，再经二次扩增至菌液OD值到0.6～1.0时，加入Lys-azido至终浓度1mM，37℃继续扩增30分钟，加入IPTG至终浓度0.5mM，***糖终浓度0.2％，24℃诱导表达12小时后收集菌体。
将收集的菌体用Ni-NTA-Bind-Buffer平衡重悬，超声破碎，离心去除细胞碎片，经过Ni-NTA金属螯合亲和层析，用Ni-NTA-Wash-Buffer充分洗涤，最后用Ni-NTA-Elute-Buffer洗脱，得到初步纯化的蛋白样品HIN47-HID--K522，纯度约为90％(见图1，line 4)。
实施例3突变体载体蛋白与多糖的通过无铜催化定点偶联
无铜催化的Click反应需要借助环辛炔的环张力作用实现，将修饰物与DIBO(有环辛炔结构的多糖)偶联，从而与含有叠氮的基团进行无铜催化Click反应。
Click反应体系如下：
HIN47-HID--K522蛋白1微克每微升，DIBO-肺炎3型多糖，分子量分别为200KD、400KD，各2Mm,4℃垂直混悬2小时，结果显示不同分子量(200KD、400KD)的肺炎3型多糖都可以成功修饰到蛋白上F3-HIN47-HID--K522-200、F3-HIN47-HID--K522-400(见图1，line1、2)。
经过上述反应条件能够在1小时内将大约90％的蛋白定点与多糖偶联，反应后的复溶物经过除盐，再经过离子交换，可以获得＞95％纯度的多糖定点偶联的蛋白。
实施例4通过有铜催化Click反应偶联多糖
反应体系如下：
HIN47-HID--K522蛋白1微克每微升
肺炎1型多糖-炔20微克每微升
Cu2+ 1mM
BTTES 400微摩尔
PBS 0.01M(pH≈7)
Cu丝小段(足量)
注：(1,2,3-triazol-1-yl)ethanesulfonic acid，简称BTTES)
反应条件：4℃，垂直混悬30分钟，反应结束后加入EDTA至1mM终止反应，获得的最终产物是肺炎3型多糖与HIN47-HID--K522蛋白定点偶联结合物F3-HIN47-HID--K522-Cu(见图1 line 3)，从图1可以看出，通过有铜催化Click反应对目的蛋白进行多糖偶联。
实施例5多糖定点偶联蛋白过滤性评价
马尔文激光粒度仪Mastersizer 2000对结合物颗粒大小分布进行分析，通过多糖定点偶联蛋白得到结合物的制剂粒度分布均匀，无明显聚集物存在；而通过传统多糖蛋白偶联方法得到结合物F3-HIN47-HID--K522-Cu粒度分布不均匀和有聚集物存在，见图2a-2，其中传统多糖蛋白偶联方法为：3型多糖经60℃高温水解后，在高碘酸钠0.5g每升条件下，进行活化反应，得到活化多糖在0.1M pH 6.5磷酸盐缓冲液中与载体蛋白HIN47-HID经氰基硼氢化钠终浓度2g/L，反应56小时后，加入硼氢化钠2g/L，继续反应两小时，后经生理盐水超滤，得到结合物F3-HIN47-HID。
实施例6多糖定点偶联蛋白结合物免疫原性评价
在家兔模型中，对不同偶联方式得到疫苗进行研究。涉及实例3、4、5来自肺炎链球菌的3型荚膜多糖与HIN47-HID类蛋白的多糖蛋白缀合物和磷酸铝(AlPO4)佐剂在家兔中单价疫苗的免疫应答的影响。这些效果通过抗原特异性Elisa测定血清IgG浓度和通过调理吞噬测定法(OPA)测定抗体功能来表征。图3显示了不同偶联方式得到3型结合物在家兔三免Elisa结果。结果显示，相对于对照，实例3、4、5来自肺炎链球菌的3型荚膜多糖与HIN47-HID类蛋白的多糖蛋白缀合物显示出明显的抗体滴度。
在第0、2、4周，用计划人用临床剂量(多糖2微克)的四分之一剂量(多糖0.5微克)，肌肉免疫新西兰大白兔，在不同时间点收集血清，通过Elisa测定血清特异性IgG并通过杀菌能力(OPA)评估功能活性。
表5 3型多糖蛋白结合物检测结果
表6 3型多糖蛋白结合物杀菌力(OPA)结果
表5显示了3型多糖蛋白结合物检测结果，结果显示通过定点偶联得到3型多糖蛋白结合物游离多糖和游离蛋白百分比明显小于未突变的蛋白载体。表6显示了3型多糖蛋白结合物杀菌力(OPA)结果，通过定点偶联得到3型多糖蛋白结合物在家兔中诱导明显更高的抗体应答及特异性杀菌能力。
实施例7多糖定点偶联蛋白结合物安全性检查
对实施例3、4所制备的3个多糖蛋白结合物取样，每份样品选用体重18～22g小鼠5只和体重250～350g豚鼠2只，每只腹侧皮下注射样品0.5ml，每只腹侧皮下注射样品5.0ml，观察7天，记录体重变化，结果显示观察期内所有小鼠、豚鼠均健存，且无异常反应，到期时每只小鼠、豚鼠体重比注射前均有增加。说明本发明制备的定点偶联结合疫苗中没有污染外源性毒性物质，也没有存在意外的不安全因子。
实施例2-7以HIN47-HID--K522为例展示突变载体蛋白的制备、表征、检测方法以及免疫原性评价等效果实验，其他HIN47-linker-HID以及HID-linker-HIN47的定点突变载体蛋白均通过上述方法制备，且经过免疫原性和安全性评价后，均能达到与HIN47-HID--K522相当的水平，结果显示通过定点偶联得到3型多糖蛋白结合物在家兔中诱导明显更高的抗体应答及特异性杀菌能力。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。
SEQUENCE LISTING
<110> 康希诺生物股份公司
<120> 一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途
<160> 43
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
20 25 30
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
35 40 45
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
50 55 60
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
85 90 95
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
100 105 110
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
165 170 175
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
195 200 205
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
225 230 235 240
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
245 250 255
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
260 265 270
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
275 280 285
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
290 295 300
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
305 310 315 320
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
325 330 335
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
355 360 365
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
370 375 380
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His
405 410 415
Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg
420 425 430
Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu
435 440 445
Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly
450 455 460
Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg
465 470 475 480
Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys
485 490 495
Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu
500 505 510
His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu
515 520 525
Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp
530 535 540
His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
545 550 555 560
<210> 2
<211> 792
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Leu Pro Ser Phe Val Ser Glu Gln Asn Ser Leu Ala Pro Met
1 5 10 15
Leu Glu Lys Val Gln Pro Ala Val Val Thr Leu Ser Val Glu Gly Lys
20 25 30
Ala Lys Val Asp Ser Arg Ser Pro Phe Leu Asp Asp Ile Pro Glu Glu
35 40 45
Phe Lys Phe Phe Phe Gly Asp Arg Phe Ala Glu Gln Phe Gly Gly Arg
50 55 60
Gly Glu Ser Lys Arg Asn Phe Arg Gly Leu Gly Ser Gly Val Ile Ile
65 70 75 80
Asn Ala Ser Lys Gly Tyr Val Leu Thr Asn Asn Ala Val Ile Asp Glu
85 90 95
Ala Asp Lys Ile Thr Val Gln Leu Gln Asp Gly Arg Glu Phe Lys Ala
100 105 110
Lys Leu Val Gly Lys Asp Glu Leu Ser Asp Ile Ala Leu Val Gln Leu
115 120 125
Glu Lys Pro Ser Asn Leu Thr Glu Ile Lys Phe Ala Asp Ser Asp Lys
130 135 140
Leu Arg Val Gly Asp Phe Thr Val Ala Ile Gly Asn Pro Phe Gly Leu
145 150 155 160
Gly Gln Thr Val Thr Ser Gly Ile Val Ser Ala Leu Gly Arg Ser Thr
165 170 175
Gly Ser Asp Ser Gly Thr Tyr Glu Asn Tyr Ile Gln Thr Asp Ala Ala
180 185 190
Val Asn Arg Gly Asn Ser Gly Gly Ala Leu Val Asn Leu Asn Gly Glu
195 200 205
Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Ile Ser Pro Ser Gly Gly Asn Ala
210 215 220
Gly Ile Ala Phe Ala Ile Pro Ser Asn Gln Ala Ser Asn Leu Val Gln
225 230 235 240
Gln Ile Leu Glu Phe Gly Gln Val Arg Arg Gly Leu Leu Gly Ile Lys
245 250 255
Gly Gly Glu Leu Asn Ala Asp Leu Ala Lys Ala Phe Asn Val Ser Ala
260 265 270
Gln Gln Gly Ala Phe Val Ser Glu Val Leu Pro Lys Ser Ala Ala Glu
275 280 285
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