阅读说明：本技术 用于高水平生产crm的改进方法 (Improved process for high level production of CRM ) 是由 巴拉穆拉利·马西拉马尼 拉扬·斯里拉曼 曼达尔·希里什·迪克西特 德维普拉萨纳·查卡 叙尔迪 于 2018-04-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于使用具有增加的CRM197基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM197的改进方法,其中该方法包括使该菌株在具有一种或多种氨基酸的无动物来源组分的培养基中生长。(The present invention provides an improved process for the production of CRM197 in high yield using an engineered strain of corynebacterium diphtheria with increased copy number of the CRM197 gene, wherein the process comprises growing the strain in an animal derived component free medium having or more amino acids.)

用于高水平生产CRM的改进方法

技术领域

本发明涉及使用具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株以高产率生产CRM₁₉₇的改进方法。

背景技术

CRM₁₉₇是白喉毒素的遗传解毒的形式。在52位的单个突变用谷氨酸代替了甘氨酸，导致该天然毒素的ADP-核糖基转移酶活性丧失。缺乏毒性的CRM₁₉₇的结构基础已经阐明，并广泛用作结合疫苗的载体蛋白。与白喉毒素一样，CRM₁₉₇是由两个亚基(通过二硫桥键连接)组成的535个氨基酸(58.4KD)的单个多肽链。

CRM₁₉₇用作许多批准的结合疫苗如以商品名Hibtiter TM销售的b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)结合物、以商品名

销售的13价肺炎球菌多糖结合物等中的载体蛋白。

Ruth M.Drew et al.,Bacteriol.1951 Nov；62(5):549-59；公开了适合生产高滴度白喉毒素的化学上限定的培养基并概述了Park-Williams No.8的多伦多菌株白喉棒状杆菌的氨基酸需求。培养基含有有效替代动物来源组分即酪蛋白水解产物的氨基酸。氨基酸包括谷氨酸，胱氨酸，脯氨酸，色氨酸，亮氨酸，缬氨酸，蛋氨酸和甘氨酸。

Rappuoli et al；Applied and Environmental Microbiology 1983 Vol.46(3):560-564已经公开，非串联双溶原菌(lysogen)是稳定的并能够提供高产量的CRM₁₉₇，其比单溶原菌高多达三倍。

R Fass.et al.,Applied Microbiology and Biotechnology；April 1995,Volume 43(1):83-88；公开了一种从两种白喉棒状杆菌菌株：C7(β)(tox-201，tox-9)和C7(β)(tox-107)产生突变白喉毒素的高密度生长方法。这种方案涉及使用改良的非去铁(non-deferrated)的生长培养基，其提供细菌的快速且高密度的生长，并且当与同时消耗葡萄糖和铁结合时提高毒素生产。供应富氧空气以使细菌生长至在600nm(15-20g/L干重)下提供70的吸光度的细胞密度。培养物上清液中最大毒素浓度为150mg/L。

Parag P.Nagarkar et al.,Journal of Applied Microbiology 2002,92,215-220；公开了白喉棒状杆菌生长期间的氨基酸利用模式，并显示出所测试的九种氨基酸中只有四种，即胱氨酸，组氨酸，天冬氨酸和蛋氨酸对白喉棒状杆菌的生长和毒素产生是重要的。

欧洲专利号1 849 860 B1公开了使用非动物来源的蛋白材料如来自大豆、棉籽、土豆等的蛋白，作为病原细菌培养的培养基成分。

美国专利号6,962,803 B2公开了通过发酵能够产生白喉毒素的微生物菌株来纯化白喉毒素的方法，所述方法包括向生长的培养物中添加葡萄糖，由此葡萄糖的添加维持了有效支持白喉毒素生产的微生物生长。其进一步公开了，除了碳源之外，还有其他的生长的最低营养要求，包括微量金属，磷酸盐(磷酸酯，phosphate)，氮源，通常是酪蛋白氨基酸和酵母提取物。

美国专利申请公开号2011/0097359 A1公开了用于培养白喉棒状杆菌菌株以生产一定水平的白喉毒素或其类似物的培养基，其中培养基基本上不含动物来源产物，并且包含：水；碳水化合物源；氮源；和多种一定初始浓度的游离氨基酸，其中每种游离氨基酸的初始浓度并不限制于白喉毒素或其类似物的生产水平。进一步公开了碳水化合物源不含葡萄糖。

WO 2006/100108 A1公开了一种发酵方法，包括以下步骤：在足以维持均质培养和有限通气的搅拌条件下，在发酵罐内的培养基中培养白喉棒状杆菌菌株，使得培养物中的pO2对于大部分发酵步骤降至小于4％。进一步公开了通过通气程度将发酵罐内的pH保持于7.0至7.8，而无需添加酸或碱。

CRM₁₉₇过程通常对过程组分以及过程参数的细微变化敏感。尽管在商业实现方面取得了有限的成功，但在全球范围内使用了由白喉棒状杆菌的CRM₁₉₇生产。上述参考文献均未公开采用工程化的白喉棒状杆菌菌株以高产率如>150mg/L生产CRM₁₉₇的方法。本发明的发明人已经开发出使用工程化白喉棒状杆菌菌株用于CRM₁₉₇的高产率生产的代谢流模型。

本发明的目的

本发明的主要目的是提供用于高水平生产CRM₁₉₇的改进方法。

本发明又一个目的是提供用于高水平生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法成本有效并能够用于生产结合疫苗。

发明内容

本发明提供了一种使用具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM₁₉₇的改进方法，其中该方法包括使菌株在包含一种或多种氨基酸并且无动物来源组分的发酵培养基中生长。

本发明提供了一种生产CRM₁₉₇的改进方法，方法包括在不含动物来源的分且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化的白喉棒状杆菌菌株，并向培养基补充营养物。

本发明还提供了一种用于生产CRM₁₉₇的改进方法，方法包括在不含动物来源的组分并且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化的白喉棒状菌株，和基于代谢流模型向培养基补充营养物。

附图说明

图1-命名为pBE33的质粒的构建

图2-代谢流平衡模型流程图。

具体实施方式

本发明提供了使用具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM₁₉₇的改进方法，其中方法包括使菌株在包含大于10种的氨基酸且无动物来源组分的发酵培养基中生长。

本发明的工程化白喉棒状菌株(C7Ep)是指游离地(episomally)放置了由宿主CRM₁₉₇基因的相同机制调控的CRM₁₉₇基因的多个拷贝且所述菌株的遗传背景是单一溶源菌的白喉棒状杆菌。

用于本发明的氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸和其盐，其每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。

研究了氨基酸、维生素以及过程条件对于生产CRM₁₉₇的影响。发现某些氨基酸对细菌的生长表现出负面影响。然而，发现如果以最佳浓度使用大于10种氨基酸，则CRM₁₉₇的产量会增加。使用Plackett Burma设计的实验优化氨基酸浓度。

Plackett Burman设计是使用有限数量的实验研究某些测量的量对多种独立变量(因数)的依赖性，以这种方式将这些依赖性的估计的方差最小化的实验设计。结果表明，氨基酸如天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸在35至36℃的温度下对CRM₁₉₇合成有正面影响，而氨基酸如丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸在35至36℃的温度下对CRM₁₉₇的合成具有负面影响。在不同浓度下进行几个水平的实验设计以实现高产量的CRM₁₉₇。酪氨酸和天冬酰胺的使用导致CRM₁₉₇的总产率降低，因此这些氨基酸不是本发明的部分。

在本发明的优选实施方式中，发酵培养基包含苯丙氨酸、精氨酸和一种或多种其他氨基酸的组合，其中使用的苯丙氨酸和精氨酸的量小于约1g/L。

在本发明的更优选的实施方式中，发酵培养基包含苯丙氨酸、精氨酸和一种或多种其他氨基酸的组合，其中苯丙氨酸的量为约0.25至0.75g/L，精氨酸为约0.1至0.5g/L。

本发明提供了使用具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株生产CRM₁₉₇的改进方法，其中该方法包括使该菌株在包含大于10种氨基酸的发酵培养基中生长，在培养基中补充范围为约0.05至20mg/L的维生素，其中培养基不含动物来源组分。

在本发明的另一个实施方式中，在培养期间将氨基酸、维生素、微量元素等作为营养物添加到发酵培养基中。

在本发明中用作补充剂的各种营养物包括选自烟酸、硫胺素、泛酸、生物素、核黄素、叶酸的维生素；庚二酸；磷酸盐、氮源和微量金属等，且每种维生素以范围为约0.05至20mg/L的量使用。

用于本发明的发酵培养基是非去铁的，并且完全不含动物来源组分。此外，该培养基还不含传统的基于肉的Loeffler培养基和基于酪蛋白氨基酸的去铁的低铁YC培养基。本发明的发酵培养基的组分包括酵母提取物，蔬菜蛋白胨，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，色氨酸，葡萄糖，YC微量盐溶液。

在本发明的另一个实施方式中，用于培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株的培养基组合物包括基础发酵培养基，其包含酵母提取物，蔬菜蛋白胨，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，色氨酸，葡萄糖，YC微量盐溶液；一种或多种氨基酸，维生素，微量元素等。

合适的微量金属包括钾，镁，钙，氯化物，胆碱，铜，锰，硫酸盐，锌等。

本发明提供了使用具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株生产CRM₁₉₇的改进方法，其中该方法包括基于代谢流模型向发酵培养基补充营养物。

代谢流模型是指热传递、质量传递、氧传递速率(OTR)、氧吸收速率(OUR)和离子传递动力学的完整网络，其中OTR通过搅拌、背压和泵送纯氧维持。该模型如图2所示。

代谢流模型的开发

该模型是基于对过程中作为主变量的氢离子积聚，其次是溶解氧，氧向CO₂的转化以及过程中释放的热量的在线数据解释创建的。例如，该模型适用于碳源限制条件。将碳源脉冲化，并在此过程中评价响应。基于响应对氢离子生成进行校正。然后优化进料以获得稳定pH和溶解氧(DO)以及传热速率(例如，pH 7.4；残余DO≥2至20；热传递速率HTR)。

在本发明的实施方式中，该方法包括在整个发酵过程期间用葡萄糖补充培养基。

本发明不涉及使用麦芽糖作为碳源和去铁步骤。

根据本发明生产的CRM₁₉₇可以用于制造结合疫苗如肺炎球菌结合物，伤寒结合物，Hib结合物等。

在又一个实施方式中，本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在不含动物来源组分且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株，和基于代谢流模型用营养物补充培养基，其中氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸及其盐。

在又一个实施方式中，本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在不含动物来源组分且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株，其中每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。

在又一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在不含动物来源组分且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株，和基于代谢流模型向培养基中补充营养物，其中每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。

在又一个实施方式中，本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在不含动物来源组分且包含基础培养基、大于10种的氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株，和根据代谢流模型向培养基补充营养物，其中每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。

在又一个实施方式中，本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在不含动物来源组分且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株，和基于代谢流模型用营养物补充培养基，其中氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸及其盐，其中每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。

在又一个实施方式中，本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在不含动物来源组分并包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状菌株，其中氨基酸选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸及其盐，其中每种氨基酸以约0.05至2g/L的量使用。

在优选的实施方式中，本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括

i)在不含动物来源组分且包含基础培养基和大于10种的选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，缬氨酸及其盐的氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状菌株，和

ii)根据代谢流模型向培养基补充葡萄糖和营养物。

在又一个实施方式中，在发酵过程期间，温度维持于30至40℃的范围内并使用20％的正磷酸、12.5％的氢氧化铵将pH保持于7.0至8.0，优选7.4至7.6。发酵过程进行15至24小时，优选16至20小时。

在一个实施方式中，本发明提供了不含酪氨酸和天冬酰胺的发酵组合物和方法。在一个实施方式中，本发明的方法不含基于酪蛋白氨基酸的去铁的低铁YC培养基、作为碳源的麦芽糖和去铁步骤。

本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株，发酵培养基不含动物来源组分，并含有量小于约1g/L的苯丙氨酸、精氨酸和一种或多种其他氨基酸的组合。

在一个实施方式中，本发明提供了用于生产CRM₁₉₇的改进方法，该方法包括在不含动物来源组分且包含大于10种氨基酸的发酵培养基中培养具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株，和根据代谢流模型对培养基补充营养物，其中所获得的CRM₁₉₇的产量大于150mg/L。

在一个实施方式中，本发明能够制备结合物疫苗，其包括将来自伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎球菌(meningococcus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的多糖与根据本发明制备的CRM₁₉₇结合。

本发明提供了使用具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株以高产率生产CRM₁₉₇的改进方法，其中该方法包括使该菌株在不含动物来源组分而包含大于10种氨基酸的培养基中生长，和基于代谢流模型向培养基补充营养物。

在一个实施方式中，本发明提供了用于以产量如150mg/L，200mg/L，300mg/L，500mg/L，1g/L，1.5g/L，2g/L，2.5g/L，3g/L，3.5g/L，4g/L，4.5g/L和5g/L生产CRM₁₉₇的改进的方法。

在一个实施方式中，本发明提供了工程化的白喉棒状杆菌菌株C7(β197)，其中pBE33质粒通过电穿孔转移。

根据本发明生产的CRM₁₉₇采用免疫捕获酶联免疫吸附测试(IC-ELISA)进行定量。

开发在表达载体质粒上具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的工程化白喉棒状杆菌菌株

白喉棒状杆菌C7(β-197)ATCC 53821，是编码CRM₁₉₇的基因，以单拷贝形式存在，并且突变型CRM₁₉₇蛋白在铁的调节下会分泌到培养物培养基中。CRM₁₉₇的产量在具有棒状杆菌噬菌体-β(ATCC 39255)的两个拷贝的白喉棒状杆菌C7菌株中增加了三倍。这表明，基因拷贝数与产量的提高有关。为了使由白喉棒状杆菌生产CRM₁₉₇在商业上可行，期望提高表达水平。将更多拷贝数整合入细菌基因组中在技术上是挑战性的。多拷贝噬菌体整合子在遗传上是不稳定的，并会丢失CRM基因的另外的拷贝。本发明人旨在通过增加递送到具有抗生素选择标记的质粒上的CRM₁₉₇的基因拷贝数，连同CRM₁₉₇的天然调控元件一起，改进CRM₁₉₇的表达水平。因此，本发明人开发了具有增加的CRM₁₉₇基因的拷贝数的白喉棒状杆菌菌株，评价了该菌株的稳定性。与未修饰的棒状杆菌菌株相比，修饰的菌株具有更高的CRM₁₉₇表达水平。

参考下面给出的实施例更具体地举例说明本发明。然而，应该理解的是，本发明不以任何方式受限于实例，而是包括其在本文描述的参数内的变化，如本领域技术人员所公知的。

实施例1

通过CRM₁₉₇的游离型拷贝改进CRM₁₉₇表达：

制备了可以在白喉棒状杆菌C7(β197)中稳定复制的载体。如T.C Currier etal.,Anal Biochem.1976；76(2):431441中描述的，使用大质粒分离方案从白喉C7棒状杆菌中分离天然质粒。使用天然质粒DNA制备，扩增1.87Kb复制起点(oriR)。同时，使用pUC4-KIXX模板DNA扩增1.033Kb kanR序列，并将平端连接至oriR上以生成pBE30。此外，从白喉棒状杆菌C7(β197)基因组DNA扩增2.13Kb包含pTox启动子区(Boyd et al.,1988)、cru和预测的终止子序列的CRM₁₉₇基因序列，并将其克隆到pBE30中设计的唯一的SpeI限制位点。通过等位基因特异性PCR试验(Pushnova et al.,Analytical Biochemistry.1998；260:24to29)和DNA测序验证了该扩增子中的GAG突变。由此获得的质粒命名为pBE33(图1)。

遵循针对白喉棒状杆菌C7(β197)优化的方案通过电穿孔转移pBE33质粒。通过特异性菌落PCR和质粒分离以及限制性消化，确认了转化的白喉棒状杆菌C7(β197)(pBE33)菌落。CRM₁₉₇在菌落中的表达通过SDS-PA GE和免疫蛋白印迹分析。培养基中的CRM₁₉₇通过ELISA和HPLC定量，并表示为每升培养基中表达的CRM₁₉₇浓度。

实施例2

在无动物来源组分的基础培养基上用工程化的白喉棒状杆菌C7Ep菌株生产CRM₁₉₇

白喉棒状杆菌C7Ep菌株用于该过程。随后进行两步培养以在摇瓶中制备接种物。摇瓶培养的培养基包含酵母提取物(YE)10g/L、蔬菜蛋白胨15g/L、KH₂PO₄ 4.3g/L、色氨酸50mg/L、葡萄糖4.0g/L、烟酸0.8mg/L、庚二酸0.08mg/L、CuSO₄·5H₂O 25mg/L、ZnSO₄·5H₂O12.5mg/L、MnCl₂·4H₂O 6.25mg/L、胱氨酸0.5g/L、卡那霉素25mg/L、葡萄糖4.0g/L。

向20L发酵罐培养基中添加5％接种物以开始该过程。用于发酵罐培养的培养基包括YE 15g/L、蔬菜蛋白胨30g/L、KH₂PO₄ 4.3g/L、色氨酸50mg/L、烟酸0.8mg/L，庚二酸0.08mg/L，CuSO₄·5H₂O 25mg/L，ZnSO₄·5H₂O 12.5mg/L，MnCl₂·4H₂O 6.25mg/L，胱氨酸0.5g/L，卡那霉素25mg/L，葡萄糖4.0g/L。

在整个批次中以300RPM搅拌培养物。温度维持于35℃并使用20％正磷酸和5NNaOH将pH维持于7.4。使用1.0vvm空气对培养物通气。培养液富氧以将溶解氧(DO)水平保持于20％。最初的几个小时后，当达到O₂富集极限时，DO水平持续降至20％以下。其余批次的溶解氧水平保持接近于零，在接近最后几小时时上升。当液体培养基中的残留葡萄糖降到0.5g/L以下时，以2g/L/小时的速度给予40％的葡萄糖进料。培养14小时后，当细胞密度达到约90单位的OD 600nm时，收获批料。反应器中的泡沫由30％有机消泡剂控制。CRM₁₉₇的产量达到60至65mg/L发酵液的滴度。

使用未工程化的白喉棒状杆菌C7 CRM₁₉₇菌株在相似条件下发酵，产生的CRM₁₉₇为约35至40mg/L，这低于工程化的菌株。这表明了额外的基因拷贝导致增加的CRM₁₉₇生产的影响。

实施例3：

通过遵循代谢流平衡模型，在不含动物来源组分的基础培养基上用工程化白喉棒状杆菌C7Ep菌株生产CRM₁₉₇

白喉棒状杆菌C7Ep菌株用于该过程。随后进行两步培养以在摇瓶中制备接种物。摇瓶培养的培养基包含YE 10g/L、蔬菜蛋白胨15g/L、KH₂PO₄ 4.3g/L、色氨酸50mg/L、葡萄糖4.0g/L、烟酸0.8mg/L、庚二酸0.08mg/L、CuSO₄·5H₂O 25mg/L、ZnSO₄·5H₂O 12.5mg/L、MnCl₂·4H₂O 6.25mg/L、胱氨酸0.5g/L、卡那霉素25mg/L、葡萄糖4.0g/L。

向20L发酵罐的培养基中添加5％接种物以开始该过程。发酵罐培养的培养基包含YE 15g/L、蔬菜蛋白胨30g/L、KH₂PO₄ 4.3g/L、色氨酸50mg/L、烟酸0.8mg/L、庚二酸0.08mg/L、CuSO₄·5H₂O 25mg/L、ZnSO₄·5H₂O 12.5mg/L、MnCl₂·4H₂O 6.25mg/L、胱氨酸0.5g/L、卡那霉素25mg/L、葡萄糖4.0g/L。

在整个批次中以300RPM搅拌培养物。温度维持于35℃并使用20％正磷酸和12.5％氢氧化铵将pH维持于7.4。使用1.0vvm空气对培养物通气。培养液富氧并将溶解氧(DO)水平保持于20％。引入模型，其遵循给定时间点的代谢转化率，该模型根据对应于有关pH、CO₂和发热的变化的残余DO的在线参数采集输入。在log阶段，尽管达到了O₂富集极限，但DO水平仍保持于20％以下。其余批次的溶解氧水平保持接近零，在接近最后几小时时上升。当液体培养基中的残留葡萄糖降到0.5g/L以下时，以2g/L/小时的速度进料40％的葡萄糖以验证代谢流模型的合理性。培养14小时后，当细胞密度达到约90单位的OD 600nm时，收获批料。反应器中的泡沫由30％有机消泡剂控制。CRM₁₉₇的产量达到发酵液150mg/L的滴度。

实施例4：

根据本发明生产CRM₁₉₇

遵循三步培养法制备接种物。前两个步骤在摇瓶中完成。摇瓶培养的培养基包含YE 10g/L、蔬菜蛋白胨15g/L、KH₂PO₄ 4.3g/L、色氨酸50mg/L、葡萄糖4.0g/L、YC微量盐溶液2mL/L、胱氨酸补充液1ml/L、卡那霉素25mg/L、葡萄糖4.0g/L。

接种发酵罐的基础培养基的组成为YE 15g/L、蔬菜蛋白胨30g/L、KH₂PO₄ 4.3g/L、色氨酸50mg/L、烟酸0.8mg/L、庚二酸0.08mg/L、CuSO₄·5H₂O 25mg/L、ZnSO₄·5H₂O 12.5mg/L、MnCl₂·4H₂O 6.25mg/L、胱氨酸0.5g/L、卡那霉素25mg/L、葡萄糖4.0g/L

下面给出的是发酵罐培养基的组成(表I)和按照Placket Burmann设计而设计的成分。

表I

序号	培养基组分	用量	单位	序号	培养基组分	用量	单位
								1	丙氨酸	0.1	g/L	18	缬氨酸	1	g/L
2	精氨酸	0.1	g/L	19	钾	2	g/L
								3	天冬氨酸	0.5	g/L	20	镁	1	g/L
4	半胱氨酸	0.5	g/L	21	硫胺素	0.1	mg/L
								5	谷氨酸	1	g/L	22	生物素	4	mg/L
6	谷酰胺	0.1	g/L	23	钙	2	mg/L
								7	甘氨酸	0.5	g/L	24	氯化物	0.5	mg/L
8	组氨酸	1	g/L	25	胆碱	0.1	mg/L
								9	异亮氨酸	1	g/L	26	铜	10	mg/L
10	亮氨酸	0.5	g/L	27	叶酸	1.6	mg/L
								11	赖氨酸	0.1	g/L	28	锰	1	mg/L
12	蛋氨酸	1	g/L	29	烟酸	100	mg/L
								13	苯丙氨酸	0.5	g/L	30	泛酸	50	mg/L
14	脯氨酸	0.1	g/L	31	庚二酸	20	mg/L
								15	丝氨酸	0.1	g/L	32	核黄素	50	mg/L
16	苏氨酸	0.1	g/L	33	硫酸盐	20	mg/L
								17	色氨酸	0.1	g/L	34	锌	7	mg/L

向具有上述组分和基础培养基(YE 15g/L、蔬菜蛋白胨30g/L、KH₂PO₄ 4.3g/L、色氨酸50mg/L、烟酸0.8mg/L、庚二酸0.08mg/L、CuSO₄·5H₂O 25mg/L、ZnSO₄·5H₂O 12.5mg/L、MnCl₂·4H₂O 6.25mg/L、胱氨酸0.5g/L、卡那霉素25mg/L、葡萄糖4.0g/L)的20L发酵罐中，加入5％来自接种发酵罐的接种物以开始该过程。温度维持于35℃并使用20％正磷酸、12.5％氢氧化铵将pH维持于7.4。基于代谢流的模型(图2)调节葡萄糖进料和OTR。使用1.0vvm空气对培养物通气。培养液富氧而将溶解氧(DO)水平保持于20％。在log阶段，尽管达到了O₂富集极限，但DO水平仍保持于20％以下。其余批次的DO水平保持接近零，在接近最后几小时时上升。当液体培养基中的残留葡萄糖降到0.5g/L以下时，以4.5g/L/小时的速度进料40％的葡萄糖溶液。按照以下水平间歇补充维生素和微量元素：烟酸6.425mg/L，庚二酸0.465mg/L，CuSO₄·5H₂O 25mg/L，ZnSO₄·5H₂O 12.5mg/L，MnCl₂·4H₂O 6.25mg/L，硫胺素0.08mg/L，泛酸0.25mg/L，生物素0.006mg/L，核黄素0.3mg/L，叶酸0.06mg/L。培养18小时后，当细胞密度达到约132个单位的OD 600nm时，收获该批次。反应器中的泡沫由30％有机消泡剂控制。CRM₁₉₇的产量达到了450至500mg/L的发酵液滴度。

实施例5

使用天然白喉棒状杆菌C7和白喉棒状杆菌工程化菌株C7Ep的CRM₁₉₇产量比较

采用基础无动物培养基，Pre模型方法改良以及根据本发明的培养基和方法，使用天然C7白喉棒状杆菌和工程化的白喉棒状杆菌菌株进行发酵。

单溶原性白喉棒状杆菌菌株C7和具有游离放置的CRM₁₉₇基因的额外拷贝的工程化的菌株(C7Ep)用于过程优化。在具有动物组分的典型非去铁YC培养基中，C7产生22至25mg/L的CRM₁₉₇，而C7Ep产生40至45mg/L的CRM₁₉₇。当通过用蔬菜蛋白胨替代动物来源组分改良培养基时，C7菌株产生了40至45mg/L的CRM₁₉₇，而C7Ep产生65mg/L的CRM₁₉₇。通过更改参数修改条件，C7Ep产生了120至150mg/L的CRM₁₉₇。使用来自基本过程的输入开发模型。优化方法的最终结果是，C7产生120mg/L的CRM₁₉₇，C7Ep产生>500mg/L的CRM₁₉₇。在下表II中比较了产量：

表II-在不同的过程条件下天然C7白喉棒状杆菌与游离修饰的C7Ep的产量比较。