一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法
阅读说明：本技术 一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法 (Screening method of monoclonal antibody for specifically recognizing endogenous marker Brdu ) 是由 郑沣 孙小函 侯圆圆 刘姗姗 杨颂 黄强 张高英 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法,包括如下步骤：制作Brdu内源标记的动物模型,以及制作Brdu内源标记的细胞模型,用内源标记的动物模型及细胞模型对单抗制备中的ELISA阳性融合孔进行筛选,融合后去掉不能识别内源性Brdu标记的ELISA阳性孔,保留能识别内源标记的ELISA阳性融合孔,进行亚克隆操作,分离单克隆,对单克隆孔同法进行内源Brdu标记筛选,获得特异性单克隆细胞株。(The invention discloses a screening method of a monoclonal antibody for specifically recognizing an endogenous marker Brdu, which comprises the following steps: the method comprises the steps of manufacturing an animal model of Brdu endogenous marker and a cell model of Brdu endogenous marker, screening ELISA positive fusion holes in monoclonal antibody preparation by using the animal model and the cell model of endogenous marker, removing the ELISA positive holes incapable of recognizing endogenous Brdu marker after fusion, reserving the ELISA positive fusion holes capable of recognizing endogenous marker, performing subcloning operation, separating monoclonal, performing endogenous Brdu marker screening on the monoclonal holes by the same method, and obtaining specific monoclonal cell strains.)
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，尤其涉及一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法。
背景技术
外源性抗原与内源性抗原通常存在差别，通常我们使用外源性抗原制备抗体，期望得到识别内源性抗原的抗体，但大多数抗体都无法识别内源性抗原；通常单抗制备过程中，融合后的第一步筛选是间接ELISA，这种方法特异性性不强，仅能说明抗体与外源性抗原之间有相互结合，但很难特异性获得识别内源性抗原的抗体；融合孔上清量非常少，通常不到200μl，很难做除ELISA之外的其它筛选，这导致后续亚克隆操作的工作量大且盲目。
发明内容
本发明提出了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明提出了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤：
S1：制作Brdu内源标记的动物模型；
S2：制作细胞爬片，使用含100μM/L Brdu的培养基，于培养箱中培养细胞爬片40min，制作Brdu内源标记的细胞模型；
S3：使用内源标记的动物模型及细胞模型对单抗制备中的融合孔进行筛选；
S4：去掉不能识别内源性Brdu标记的ELISA阳性孔，保留能识别内源标记的ELISA阳性融合孔；
S5：对能识别内源标记的ELISA阳性融合孔进行亚克隆操作，分离单克隆，对单克隆孔同法进行内源Brdu标记筛选，获得特异性单克隆细胞株。
优选的，所述S1中，Brdu内源标记的动物模型制备步骤：
1)、将Brdu 50mg/kg注入大小鼠腹腔，共4次，每次间隔2小时；
2)、最后一次24小时后，处死动物，取组织；
3)、固定、包埋、切片处理，制作内源筛选的动物模型。
优选的，所述S2中，Brdu内源标记的细胞模型制备步骤：
(1)、将盖玻片用洗洁剂清洗干净，然后用自来水将洗洁剂充干净，再用纯水冲洗3-6次，泡在75％的酒精中静置10-15min；
(2)、用镊子夹起盖玻片在酒精灯上将酒精烧干，烘干温度为50℃-60℃；
(3)、将烧干的盖玻片放在六孔板中，待冷却后将细胞悬液滴加在盖玻片上；
(4)、5h后轻轻补加1ml培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养12小时，细胞贴在盖玻片上良好生长；
(5)、每孔避光加入1ml含有100μM Brdu的培养基，于培养箱中孵育40min；
(6)、换液，4％多聚甲醛固定15-20min，换PBS缓冲液，4℃保存待用。
优选的，所述S3中，所述融合孔筛选过程为采用ELISA法进行初步筛选后，使用制作的经Brdu内源标记的动物模型组织切片及细胞模型的细胞爬片，对初步筛选出的ELISA阳性融合孔直接进行IHC、ICC筛选，获得能识别内源标记Brdu的ELISA阳性融合孔，去掉不能识的ELISA阳性孔。
优选的，所述S3、S4、S5中，对单抗制备中的融合孔、单克隆孔直接进行特异性内源筛选。
本发明提出的一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，有益效果在于：
本发明直接对融合上清进行内源检测，可在融合孔阶段就对融合孔上清中的抗体进行特异性筛选，可微量操作、批量操作，大大节省了后续亚克隆操作的工作量，提高了筛选的针对性，获得特异性抗体的几率大增，可在融合筛选阶段就得到能特异性识别内源抗原的融合孔，进而针对性地对融合孔进行亚克隆操作，简单快捷地获得特异性单克隆，该针对融合孔上清进行直接内源筛选的方法不仅适用IHC，也适用IF、WB、FC等多种应用的单抗筛选。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明做进一步说明。
实施例1
本发明提出了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤：
S1：制作Brdu内源标记的动物模型，Brdu内源标记的动物模型制备步骤：
1)、将Brdu 50mg/kg注入大小鼠腹腔，共4次，每次间隔2小时；
2)、最后一次24小时后，处死动物，取组织；
3)、固定、包埋、切片处理，制作内源筛选的动物模型；
S2：制作细胞爬片，使用含100μM/L Brdu的培养基，于培养箱中培养细胞爬片40min，制作Brdu内源标记的细胞模型，Brdu内源标记的细胞模型制备步骤：
(1)、将盖玻片用洗洁剂清洗干净，然后用自来水将洗洁剂充干净，再用纯水冲洗3次，泡在75％的酒精中静置10min；
(2)、用镊子夹起盖玻片在酒精灯上将酒精烧干，烘干温度为50-60℃；
(3)、将烧干的盖玻片放在六孔板中，待冷却后将细胞悬液滴加在盖玻片上；
(4)、5h后轻轻补加1ml培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养12小时，细胞贴在盖玻片上良好生长；
(5)、每孔避光加入1ml含有100μM Brdu的培养基，于培养箱中孵育40min；
(6)、换液，4％多聚甲醛固定15-20min，换PBS缓冲液，4℃保存待用；
S3：使用内源标记的动物模型及细胞模型对单抗制备中的融合孔进行筛选，融合孔筛选过程为采用ELISA法进行初步筛选后，使用制作的经Brdu内源标记的动物模型组织切片及细胞模型的细胞爬片，对初步筛选出的ELISA阳性融合孔直接进行IHC、ICC筛选，获得能识别内源标记Brdu的ELISA阳性融合孔，去掉不能识的ELISA阳性孔；
S4：去掉不能识别内源性Brdu标记的ELISA阳性孔，保留能识别内源标记的ELISA阳性融合孔；
S5：对能识别内源标记的ELISA阳性融合孔进行亚克隆操作，分离单克隆，对单克隆孔同法进行内源Brdu标记筛选，获得特异性单克隆细胞株。
实施例2
本发明提出了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤：
S1：制作Brdu内源标记的动物模型，Brdu内源标记的动物模型制备步骤：
1)、将Brdu 50mg/kg注入大小鼠腹腔，共4次，每次间隔2小时；
2)、最后一次24小时后，处死动物，取组织；
3)、固定、包埋、切片处理，制作内源筛选的动物模型；
S2：制作细胞爬片，使用含100μM/L Brdu的培养基，于培养箱中培养细胞爬片40min，制作Brdu内源标记的细胞模型，Brdu内源标记的细胞模型制备步骤：
(1)、将盖玻片用洗洁剂清洗干净，然后用自来水将洗洁剂充干净，再用纯水冲洗4次，泡在75％的酒精中静置15min；
(2)、用镊子夹起盖玻片在酒精灯上将酒精烧干，烘干温度为53℃；
(3)、将烧干的盖玻片放在六孔板中，待冷却后将细胞悬液滴加在盖玻片上；
(4)、5h后轻轻补加1ml培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养12小时，细胞贴在盖玻片上良好生长；
(5)、每孔避光加入1ml含有100μM Brdu的培养基，于培养箱中孵育40min；
(6)、换液，4％多聚甲醛固定20min，换PBS缓冲液，4℃保存待用；
S3：使用内源标记的动物模型及细胞模型对单抗制备中的融合孔进行筛选，融合孔筛选过程为采用ELISA法进行初步筛选后，使用制作的经Brdu内源标记的动物模型组织切片及细胞模型的细胞爬片，对初步筛选出的ELISA阳性融合孔直接进行IHC、ICC筛选，获得能识别内源标记Brdu的ELISA阳性融合孔，去掉不能识的ELISA阳性孔；
S4：去掉不能识别内源性Brdu标记的ELISA阳性孔，保留能识别内源标记的ELISA阳性融合孔；
S5：对能识别内源标记的ELISA阳性融合孔进行亚克隆操作，分离单克隆，对单克隆孔同法进行内源Brdu标记筛选，获得特异性单克隆细胞株。
实施例3
本发明提出了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤：
S1：制作Brdu内源标记的动物模型，Brdu内源标记的动物模型制备步骤：
1)、将Brdu 50mg/kg注入大小鼠腹腔，共4次，每次间隔2小时；
2)、最后一次24小时后，处死动物，取组织；
3)、固定、包埋、切片处理，制作内源筛选的动物模型；
S2：制作细胞爬片，使用含100μM/L Brdu的培养基，于培养箱中培养细胞爬片40min，制作Brdu内源标记的细胞模型，Brdu内源标记的细胞模型制备步骤：
(1)、将盖玻片用洗洁剂清洗干净，然后用自来水将洗洁剂充干净，再用纯水冲洗5次，泡在75％的酒精中静置15min；
(2)、用镊子夹起盖玻片在酒精灯上将酒精烧干，烘干温度为50-60℃；
(3)、将烧干的盖玻片放在六孔板中，待冷却后将细胞悬液滴加在盖玻片上；
(4)、5h后轻轻补加1ml培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养12小时，细胞贴在盖玻片上良好生长；
(5)、每孔避光加入1ml含有100μM Brdu的培养基，于培养箱中孵育40min；
(6)、换液，4％多聚甲醛固定20min，换PBS缓冲液，4℃保存待用；
S3：使用内源标记的动物模型及细胞模型对单抗制备中的融合孔进行筛选，融合孔筛选过程为采用ELISA法进行初步筛选后，使用制作的经Brdu内源标记的动物模型组织切片及细胞模型的细胞爬片，对初步筛选出的ELISA阳性融合孔直接进行IHC、ICC筛选，获得能识别内源标记Brdu的ELISA阳性融合孔，去掉不能识的ELISA阳性孔；
S4：去掉不能识别内源性Brdu标记的ELISA阳性孔，保留能识别内源标记的ELISA阳性融合孔；
S5：对能识别内源标记的ELISA阳性融合孔进行亚克隆操作，分离单克隆，对单克隆孔同法进行内源Brdu标记筛选，获得特异性单克隆细胞株。
实施例4
本发明提出了一种特异性识别内源标记物Brdu的单克隆抗体的筛选方法，包括如下步骤：
S1：制作Brdu内源标记的动物模型，Brdu内源标记的动物模型制备步骤：
1)、将Brdu 50mg/kg注入大小鼠腹腔，共4次，每次间隔2小时；
2)、最后一次24小时后，处死动物，取组织；
3)、固定、包埋、切片处理，制作内源筛选的动物模型；
S2：制作细胞爬片，使用含100μM/L Brdu的培养基，于培养箱中培养细胞爬片40min，制作Brdu内源标记的细胞模型，Brdu内源标记的细胞模型制备步骤：
(1)、将盖玻片用洗洁剂清洗干净，然后用自来水将洗洁剂充干净，再用纯水冲洗6次，泡在75％的酒精中静置15min；
(2)、用镊子夹起盖玻片在酒精灯上将酒精烧干，烘干温度为50-60℃；
(3)、将烧干的盖玻片放在六孔板中，待冷却后将细胞悬液滴加在盖玻片上；
(4)、5h后轻轻补加1ml培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养12小时，细胞贴在盖玻片上良好生长；
(5)、每孔避光加入1ml含有100μM Brdu的培养基，于培养箱中孵育40min；
(6)、换液，4％多聚甲醛固定20min，换PBS缓冲液，4℃保存待用；
S3：使用内源标记的动物模型及细胞模型对单抗制备中的融合孔进行筛选，融合孔筛选过程为采用ELISA法进行初步筛选后，使用制作的经Brdu内源标记的动物模型组织切片及细胞模型的细胞爬片，对初步筛选出的ELISA阳性融合孔直接进行IHC、ICC筛选，获得能识别内源标记Brdu的ELISA阳性融合孔，去掉不能识的ELISA阳性孔；
S4：去掉不能识别内源性Brdu标记的ELISA阳性孔，保留能识别内源标记的ELISA阳性融合孔；
S5：对能识别内源标记的ELISA阳性融合孔进行亚克隆操作，分离单克隆，对单克隆孔同法进行内源Brdu标记筛选，获得特异性单克隆细胞株。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。