一种来自链霉菌的(r)-选择性苯乙烯单加氧酶

文档序号：1731583 发布日期：2019-12-20 浏览：21次 >En<

阅读说明：本技术 一种来自链霉菌的(r)-选择性苯乙烯单加氧酶 ((R) -selective styrene monooxygenase from streptomycete ) 是由吴中柳崔璨郭超丁照云刘艳于 2019-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种来源于链霉菌Streptomyces sp.NRRL S-3的新型苯乙烯单加氧酶基因StStyA及其在催化不对称环氧化中的应用。该酶与之前报道的所有苯乙烯环氧化酶相比,对苯乙烯类底物具有相反的选择性,生成的环氧产物为R型,对苯乙烯的ee值为91％,对4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃的ee值>99％。(The invention discloses a novel styrene monooxygenase gene StStStStyA derived from Streptomyces sp.NRRL S-3 and application thereof in catalysis of asymmetric epoxidation. The enzyme has opposite selectivity to styrene substrate compared with all styrene epoxidases reported previously, and the generated epoxy product is R-type, the ee value of the styrene is 91 percent, and the ee value of the 4-vinyl-2, 3-dihydrobenzofuran is more than 99 percent.)

一种来自链霉菌的(R)-选择性苯乙烯单加氧酶

技术领域

本发明涉及一种新型苯乙烯单加氧酶StStyA的催化功能，经该酶催化苯乙烯类底物可获得R-构型环氧产物，属于应用微生物及酶工程领域。

背景技术

手性环氧化合物是许多手性天然产物、药物的合成前体。随着生物催化技术的发展，以酶催化获得环氧化合物成为关注的热点。其中苯乙烯环氧化酶(StyreneMonooxygenase,SMO，EC 1.14.14.11)可以催化苯乙烯类化合物得到光学纯(S)-环氧化合物，是获得手性环氧化合物的重要方法之一。目前已报道的苯乙烯环氧化酶种类来源单一，大部分来源于假单胞菌属(Pseudomonas)，序列相似度高，酶学性能差异较小，催化活性低；并且催化形成的环氧立体选择性单一，只能生成S构型的环氧产物，限制了其应用范围。只有筛选不同来源且序列相似度低的新酶，才有可能得到新的催化功能。因此，筛选新性能的苯乙烯环氧化酶基因，特别是能生成(R)构型环氧的基因，并发展其在不对称环氧化催化中的应用，具有重要意义。

随着全基因组测序技术的不断发展，NCBI数据库中已经公布了大量的基因序列，为我们提供了丰富的酶资源库，通过数据库挖掘的方法是寻找新型苯乙烯环氧化酶的有效途径。链霉菌在生态系统中发挥着重要的作用，同时也是许多生物活性物质和一些重要蛋白的来源菌株。但目前为止，还没有来源于链霉菌的苯乙烯环氧化酶报道。

发明内容

本发明目的是公开一种来源于链霉菌Streptomyces sp.NRRL S-3的新型苯乙烯单加氧酶StStyA的功能，并提供了该基因构建的重组菌用于催化不对称环氧化反应的方法。

所述新型苯乙烯单加氧酶StStyA的特征是：核苷酸长度为1254bp，序列为SEQ IDNo.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明的苯乙烯单加氧酶StStyA基因是通过NCBI数据库挖掘的方法获得，之后通过分子克隆构建相关载体并进行异源表达及生物转化，从而得到了R型环氧产物，ee值在91％-99％之间，尤其对4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃具有优异的立体选择性，ee值大于99％。

根据本领域公共知识，构建的相关载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

本发明涉及的StStyA蛋白与NCBI数据库中已报道序列的相似度见下表，从表中可以看出单加氧酶StStyA在蛋白质水平上的相似度<40％，是一个新颖性序列。

本发明的苯乙烯单加氧酶StStyA是通过基因组数据库挖掘的方法获得的：我们以已报道的来源于Pseudomona sp.LQ26的StyA蛋白序列(GenBank登录号ADE62390.1)为参考序列在NCBI数据库中进行BLAST，得到了数量较多的序列，去除已研究过的序列，同时根据酶来源菌株及其序列相似度，我们筛选到该蛋白序列(NCBI登录号为：WP_030740546.1)，并对其序列进行了密码子偏好性优化，优化后的基因(SEQ ID No.1)由上海生工生物工程有限公司合成，并连接至pET28a(+)载体，上、下游限制性内切酶位点分别为BamH I/SacⅠ，获得的质粒命名为pET28-StStyA。

为验证苯乙烯单加氧酶StStyA的功能，将该酶在大肠杆菌中异源表达、纯化，以纯酶进行生物催化反应，可以得到(R)-苯乙烯环氧，ee＝91％，见实施例1。因此，苯乙烯单加氧酶StStyA具有环氧化功能，且生成R-构型产物。

由于苯乙烯单加氧酶环氧化过程需要黄素氧化还原酶的参与，本发明构建了包含StStyA、linker和黄素氧化还原酶StyB的质粒StStyALB(SEQ ID No.3)，该质粒的构建方法详见实施例2。Linker为连接StStyA和黄素氧化还原酶StyB的一段核苷酸序列；黄素氧化还原酶StyB为环氧化反应提供辅酶FADH₂。将该质粒转入E.coli，得到重组菌E.coli(pET28-StStyALB)，经异源表达后得到的粗酶液进行生物催化。

另外，为了促进StyB(GenBank登录号ADE62391.1)的FADH₂再循环，我们以羰基还原酶ChKRED20(NCBI登录号：KC342020)利用异丙醇生成NADH。辅酶循环过程见说明书附图1。羰基还原酶ChKRED20按照文献报道方法对该酶进行异源表达(J.Mol.Catal.B:Enzym.2014,105,82-88)。

本发明还提供了StStyA构建的催化体系在不同底物生物转化中的应用，详见实施例5。

生物催化反应体系包括：缓冲液、StStyALB粗酶、ChKRED20粗酶、NAD⁺、异丙醇、底物。

本发明与已有技术相比具有如下优势：

本发明涉及的苯乙烯单加氧酶StStyA与之前报道的所有苯乙烯环氧化酶相比，对苯乙烯类底物具有相反的选择性，生成的环氧产物为R型，为首次公开的获得R型环氧产物的苯乙烯单加氧酶，对生物催化合成R型环氧产物是一个巨大的突破。该酶对苯乙烯类底物具有较好的立体选择性，尤其对4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃，ee值大于99％，为这些底物对应的(R)-构型环氧的合成提供了高选择性的生物催化途径。

附图说明

图1StStyA生物催化辅酶循环体系；

图2重组质粒pET28-StStyA表达StyA蛋白电泳图，M：蛋白Marker；1：pET-28a(+)粗酶；2：pET-StStyA粗酶；3：StStyA纯酶。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1苯乙烯单加氧酶StStyA的表达、纯化和酶动力学参数分析

StStyA异源表达：将pET28-StStyA质粒通过化学法转入E.coli BL21-DE3，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养，构建重组表达菌E.coli(pET28-StStyA)。挑取单克隆于含有卡那霉素(50μg/mL)LB培养基中，37℃、180rpm过夜培养。以1％的接种量接种于TB培养基中，37℃振荡培养3h，加入终浓度0.05mM IPTG，20℃诱导18h后，6000rpm、4℃离心10min，弃上清，菌体用生理盐水清洗两次，加入0.1M的pH 7.5磷酸钾缓冲液重悬菌体并混匀，超声波破碎细胞(工作条件：工作时间3s，间歇时间3s，工作次数99，功率200W)，离心，上清即为粗酶液。

StStyA纯化：将上述StStyA粗酶液通过Ni²⁺-NTA柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化，纯化方法为常规方法，参见手册。洗脱液为含有300mM NaCl和250mM咪唑的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 7.5)，收集含有目的蛋白的洗脱液，并用含有50mM NaCl，2mM DTT和1mM EDTA的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 7.5)透析。用SDS-PAGE和Nano-drop 2000分光光度计(NanoDrop Technologies，USA)进行蛋白样品分析，StyA蛋白电泳图见附图2。

StStyA功能验证：反应体系为1mL，包括20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，5μMStStyA，10μM StyB，800μM NADH，20μM FAD⁺，1mM苯乙烯。反应在30℃水浴中以140rpm振荡反应0.5h后，用乙酸乙酯萃取终止反应后GC检测，得到了(R)-苯乙烯环氧，ee＝91％，转化率为73％。

该反应体系中黄素氧化还原酶StyB的获得方法为：含有黄素氧化还原酶StyB基因的质粒pETB为之前构建，该基因在大肠杆菌BL21-DE3中异源表达、纯化获得。实验方法为文献报道的方法(J.Mol.Catal.B:Enzym.2010,67,236-241)。

StStyA的酶动力学参数测定：

反应体系为1mL，包括20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，5μM StStyA，10μM StyB，800μM NADH，20μM FAD⁺，0.1～8mM苯乙烯。反应在30℃水浴中以140rpm振荡反应0.5h后，用乙酸乙酯萃取终止反应，GC检测转化率，之后通过Graphpad Prism软件(Graphpad，SanDiego，CA)非线性回归拟合Michaelis-Menten方程得到酶动力学参数，Km＝0.68±0.08mM，k_cat＝5.3min^-1。

实施例2 pETStStyALB表达载体的构建

pETAB是我们以前的工作中构建的质粒(J.Mol.Catal.B:Enzym.2010,67,236-241)，包含StyA、linker和StyB的DNA片段。本发明将StStyA替换pETAB中StyA基因，保留linker和StyB，构建一个具有完整催化体系人工双组分质粒pETStStyALB。

具体做法如下：

(1)以质粒pETAB为模板，通过定点突变技术将pETAB的Linker区引入BamH I限制性位点。所用引物5'-CAAGGTGGCTAAGGATCCCTCCGCTGGCCATG-3'和5'-CATGGCCAGCGGAGGGATCCTTAGCCACCTTG-3'。将得到的质粒用Nde I和BamH I进行双酶切，获得酶切后的载体片段。具体方法为本领域常规方法。

(2)扩增StStyA的DNA片段：引物5'-GCGCATATGAGCGTTGGCATCGTG-3'和5'-GCGGGATCCTTAGCC ACCTTGCGCAC-3'，模板为实施例1中的质粒pET28-StStyA，并用Nde I和BamH I进行双酶切。将(1)获得的载体片段和此处StStyA的DNA片段进行连接。通过DNA测序验证新构建的质粒并将其命名为pETStStyALB(SEQ ID No.3)。具体方法为本领域常规方法。

实施例3pETStStyALB质粒的异源表达与粗酶液制备

将pETStStyALB质粒通过化学法转入E.coli BL21-DE3，涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃过夜培养。挑取单克隆至含有卡那霉素(50μg/mL)LB培养基中，37℃、180rpm过夜培养。以1％的接种量接种于TB培养基中，37℃振荡培养3h，加入终浓度0.05mMIPTG，20℃诱导18h后，6000rpm、4℃离心10min，弃上清，菌体用生理盐水清洗两次，加入0.1M的pH 7.5磷酸钾缓冲液重悬菌体并混匀，超声波破碎细胞(工作条件：工作时间3s，间歇时间3s，工作次数99，功率200W)，12000rpm，4℃离心，20min，取上清粗酶液用于生物催化反应，并以粗酶液中的总蛋白量进行定量。

实施例4生物催化条件优化

4.1最适反应pH值优化

反应体系为1mL，包括5mg StStyALB粗酶(总蛋白量，以下实施例均同)，2.5mgChKRED20粗酶(总蛋白量，以下实施例均同)，1mM NAD⁺，20μL异丙醇，5mM苯乙烯，以及不同pH缓冲液：0.1M PBK缓冲液(pH 6.5-8.0)或Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)或Glycine-NaOH缓冲液(pH 8.6-11.0)。反应在30℃水浴中以140rpm振荡反应2h后，用乙酸乙酯终止反应并萃取，加入无水硫酸钠进行干燥，以GC检测分析。结果如表1所示，在pH＝9.5、0.1MGlycine-NaOH缓冲液中环氧产率最高。

表1StStyALB最适反应pH优化

4.2最适反应温度优化

反应体系为1mL，包括5mg StStyALB粗酶，2.5mg ChKRED20粗酶，1mM NAD⁺，20μL异丙醇，5mM苯乙烯，0.1M Glycine-NaOH缓冲液(pH 9.5)。在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃水浴中以140rpm振荡反应2小时后，用乙酸乙酯终止反应并萃取，加入无水硫酸钠进行干燥，以GC检测分析。反应结果如表2所示，在30℃时环氧产率最高。

表2 StStyALB最适反应温度优化

综上所述，以30℃，pH＝9.5为粗酶生物转化条件。

实施例5不同底物的生物催化

反应体系为1mL，包括0.1M Glycine-NaOH缓冲液(pH 9.5)，5mg StStyALB粗酶，2.5mg ChKRED20粗酶，1mM NAD⁺，20μL异丙醇，5mM底物(底物谱如表3所示)，在30℃水浴中以140rpm振荡反应2h后，用乙酸乙酯终止反应并萃取，加入无水硫酸钠进行干燥，旋蒸去除溶剂，以GC或HPLC检测分析。HPLC检测所用仪器：Shimadzu Prominence LC-20AD系统-PDA检测器，具体使用条件:(1a,2-propanol/hexane 98:2,0.6ml/min,t_R(R)12.0min,t_R(S)13.7min；2a,2-propanol/hexane 90:10,0.5ml/min,t_R(S)11.4min,t_R(R)11.7min；3a,2-propanol/hexane 98:2,0.5ml/min,t_R(R)10.6min,t_R(S)11.3min；4a,2-propanol/hexane90:10,0.5ml/min,t_R(1R,2S)11.4min,t_R(1S,2R)12.8min；5a,2-propanol/hexane 90:10,0.5ml/min,t_R(R)13.5min,t_R(S)20.0min)。

从表3可以看出，本发明公开的苯乙烯单加氧酶对苯乙烯类底物转化生成的环氧选择性为R型，其中对于底物5a的对映体选择性大于99％。

表3 StStyALB粗酶生物转化结果

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种来自链霉菌的(R)-选择性苯乙烯单加氧酶

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1254

<212> DNA

<213> Streptomyces sp. NRRL S-3

<400> 1

atgagcgttg gcatcgtggg tagcggcatt agcggtctgc acctggcgct gcgtctgcag 60

caacgtggtg tgccggttac cgtgtacagc gagcacgaca tcgatggtct gcgtaccggt 120

cgtccgcgta acttcccggc gcgttttggc cgtacccagc aacgtgagcg tgaactgggt 180

gttttcgagt gggattttgc ggacgcgcag gttcgtcact gggcggtgac cgcgcacgcg 240

gcggatgcgg gtcgtccgct ggaatttgtt gcgggtctgc gtccgccgag cagcgtggtt 300

gatttccgta tttacctgcc gagcctgctg agcgcgtatg tggaccgtgg tggccagctg 360

gttaccggtg atcacgcggt ggaggacctg gcggcgcacc acgacctgct ggttgtggcg 420

aacggtaacc gtagcgtgcg tcgtctgttc ccggcggacc cggatcgtag cccgtacacc 480

accccgcaac gtgttctgtg cgcgggtatc tatcacggca ttaccgagga agtgccgcac 540

agcctggata tccacttcct gccgggtgcg ggcgaaattc tgcgtctgcc gttttacagc 600

ccggcgggtc gtgcggacgt tctggcgttc gaggcggtgc cgggtggccc gctggaagcg 660

gttgcgcacg tggacgcgga tgcggacccg gcgggttttc gtcgtcaggt tctggatctg 720

gtggcggcgt atgcgccgac cctgcgtgag cgtgttgaca ccggtgcgtt caccctgacc 780

ggtccgggtg aactggcgca aggtgcgatc accccggtgg ttcgtcgtgg ttgggcgcgt 840

ctggacgatg gtacctgcgc gctggcgatc ggtgatgcgt ggattaccaa cgacccgctg 900

accgcgcagg gtgcgaacct gggcagccac accgcgtttg cgctggcgga tctgattacc 960

gacgcggagg gtccgttcga cgaagcgttt tgccgtgcgg cgagcgcgcg tctgtgggag 1020

cacgcgcgtc acgtggttga atggagcaac gcgtttctgg ctccgccgcc gccgcacgtt 1080

gcgggtctgt tcggtcgtgc ggcggcggat aagcgtatcg cggacgcgtt cgttagccgt 1140

tttaacgatc cggtggcgat gtggcgtacc ctgagcagcc cggagggcgt tgcggcgttc 1200

gtggcggact gcgaagcggc ggcgccggcg ccggtgggtg cgcaaggtgg ctaa 1254

<210> 2

<211> 417

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. NRRL S-3

<400> 2

Met Ser Val Gly Ile Val Gly Ser Gly Ile Ser Gly Leu His Leu Ala

1 5 10 15

Leu Arg Leu Gln Gln Arg Gly Val Pro Val Thr Val Tyr Ser Glu His

20 25 30

Asp Ile Asp Gly Leu Arg Thr Gly Arg Pro Arg Asn Phe Pro Ala Arg

35 40 45

Phe Gly Arg Thr Gln Gln Arg Glu Arg Glu Leu Gly Val Phe Glu Trp

50 55 60

Asp Phe Ala Asp Ala Gln Val Arg His Trp Ala Val Thr Ala His Ala

65 70 75 80

Ala Asp Ala Gly Arg Pro Leu Glu Phe Val Ala Gly Leu Arg Pro Pro

85 90 95

Ser Ser Val Val Asp Phe Arg Ile Tyr Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ala

100 105 110

Tyr Val Asp Arg Gly Gly Gln Leu Val Thr Gly Asp His Ala Val Glu

115 120 125

Asp Leu Ala Ala His His Asp Leu Leu Val Val Ala Asn Gly Asn Arg

130 135 140

Ser Val Arg Arg Leu Phe Pro Ala Asp Pro Asp Arg Ser Pro Tyr Thr

145 150 155 160

Thr Pro Gln Arg Val Leu Cys Ala Gly Ile Tyr His Gly Ile Thr Glu

165 170 175

Glu Val Pro His Ser Leu Asp Ile His Phe Leu Pro Gly Ala Gly Glu

180 185 190

Ile Leu Arg Leu Pro Phe Tyr Ser Pro Ala Gly Arg Ala Asp Val Leu

195 200 205

Ala Phe Glu Ala Val Pro Gly Gly Pro Leu Glu Ala Val Ala His Val

210 215 220

Asp Ala Asp Ala Asp Pro Ala Gly Phe Arg Arg Gln Val Leu Asp Leu

225 230 235 240

Val Ala Ala Tyr Ala Pro Thr Leu Arg Glu Arg Val Asp Thr Gly Ala

245 250 255

Phe Thr Leu Thr Gly Pro Gly Glu Leu Ala Gln Gly Ala Ile Thr Pro

260 265 270

Val Val Arg Arg Gly Trp Ala Arg Leu Asp Asp Gly Thr Cys Ala Leu

275 280 285

Ala Ile Gly Asp Ala Trp Ile Thr Asn Asp Pro Leu Thr Ala Gln Gly

290 295 300

Ala Asn Leu Gly Ser His Thr Ala Phe Ala Leu Ala Asp Leu Ile Thr

305 310 315 320

Asp Ala Glu Gly Pro Phe Asp Glu Ala Phe Cys Arg Ala Ala Ser Ala

325 330 335

Arg Leu Trp Glu His Ala Arg His Val Val Glu Trp Ser Asn Ala Phe

340 345 350

Leu Ala Pro Pro Pro Pro His Val Ala Gly Leu Phe Gly Arg Ala Ala

355 360 365

Ala Asp Lys Arg Ile Ala Asp Ala Phe Val Ser Arg Phe Asn Asp Pro

370 375 380

Val Ala Met Trp Arg Thr Leu Ser Ser Pro Glu Gly Val Ala Ala Phe

385 390 395 400

Val Ala Asp Cys Glu Ala Ala Ala Pro Ala Pro Val Gly Ala Gln Gly

405 410 415

Gly

<210> 3

<211> 1820

<212> DNA

<213> Streptomyces sp. NRRL S-3

<400> 3