阅读说明：本技术 一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9及其用途 (Sumo modification system gene TpUBC9 of taenia pisiformis and application thereof ) 是由 张少华 才学鹏 骆学农 郭爱疆 王帅 侯俊玲 梁盼红 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9及其用途,涉及基因工程技术领域。本发明所述基因TpUBC9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因TpUBC9编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过酵母双杂交技术首次筛选到豆状带绦虫亮氨酸氨基肽酶TpLAP的互作蛋白基因TpUBC9,并克隆了TpUBC9基因的全长cDNA,并验证了TpUBC9-TpLAP相互作用,证实带绦虫虫体内也存在精细的SUMO化修饰系统；为进行后续带绦虫SUMO化修饰相关研究提供了新的线索。将其制备成TpUBC9抗体免疫磁珠,具有特异性好,亲和性高,操作便捷,结果可靠等特点。(The invention provides a taenia pisiformis SUMO modification system gene TpUBC9 and application thereof, and relates to the technical field of genetic engineering. The nucleotide sequence of the gene TpUBC9 is shown as SEQ ID NO. 1; the amino acid sequence of the protein coded by the gene TpUBC9 is shown in SEQ ID NO. 2. The invention screens the interacting protein gene TpUBC9 of soybean tapeworm leucine aminopeptidase TpLAP for the first time by a yeast two-hybrid technology, clones the full-length cDNA of TpUBC9 gene, verifies the interaction of TpUBC9-TpLAP and verifies that a fine SUMO modification system also exists in the body of tapeworm; provides a new clue for the subsequent related research of SUMO modification of tapeworm. The TpUBC9 antibody immunomagnetic beads prepared from the antigen have the characteristics of good specificity, high affinity, convenient operation, reliable result and the like.)

一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9及其用途。

背景技术

豆状带绦虫(Taeniapisiformis)是一种常见的犬科动物肠道寄生虫，属于带科(Taeniidae)带属(Taenia)绦虫。其生活史需要转换2个宿主完成，成虫通常寄生于犬类小肠内，豆状囊尾蚴则寄生于兔类肝脏、胃网膜、肠系膜等部位。在我国，家兔平均感染率高达40％，死亡率4.0％～23.69％，严重影响兔产品质量及威胁我国养兔业的发展。目前，我国对带绦虫/蚴病的防治仍面临很大的难题，亟需筛选和挖掘特异药物靶标及疫苗候选分子，为该类寄生虫病的有效防控和根治提供新手段。

SUMO化修饰对哺乳动物和寄生虫的生长发育是不可或缺的，其中UBC9是SUMO化修饰途径中唯一的E2结合酶，底物蛋白的SUMO化必须依赖于UBC9的表达。研究表明，敲除秀丽隐杆线虫UBC9基因后可导致胚胎发育迟缓，幼虫咽部肌肉、性腺和尾部严重发育畸形，最终导致无法正常产卵以及生殖孔破裂。果蝇UBC9缺失可阻断前部体节发育重要调控转录因子bicoid蛋白的入核，进而影响靶基因的正常表达，最终导致果蝇前部体节发育异常。小鼠UBC9缺陷明显削弱干细胞分化能力，导致细胞凋亡、胚胎在发育早期致死或心脏发育不全等。

目前，有关带绦虫SUMO化修饰途径的研究国内外均未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9，为豆状带绦虫SUMO化系统中的TpUBC9蛋白纯化和蛋白相互作用研究奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9，所述基因TpUBC9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因TpUBC9编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一组克隆所述基因TpUBC9的引物对，所述引物对包括正向引物TpUBC9F321和反向引物TpUBC9R487，所述正向引物TpUBC9F321的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述反向引物TpUBC9R487的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种扩增所述基因TpUBC9的方法，包括以下步骤：(1)将豆状带绦虫的总RNA为模板，反转录后得到cDNA第一链；

(2)以所述cDNA第一链为模板，以所述引物对为引物进行cDNA末端快速扩增；所述扩增的程序为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25个循环；

(3)胶回收所述PCR目的条带，连接至pMD19-T载体并转化E.coli DH5a感受态细胞；将经菌液PCR鉴定为阳性和测序正确的克隆，拼接3′和5′扩增序列，获得TpUBC9基因全长cDNA序列。

优选的，步骤(1)中利用Clontech RACE cDNA Amplification试剂盒进行所述反转录。

本发明还提供了一种包含所述基因TpUBC9的重组表达载体pET28a-TpUBC9，以pET-28a(+)为表达载体，将所述基因TpUBC9克隆在所述表达载体的酶切位点Nde I和Xho I之间。

本发明还提供了一种包含所述基因TpUBC9或所述重组表达载体pET28a-TpUBC9的重组菌。

本发明还提供了一种TpUBC9免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：(a)将所述重组表达载体pET28a-TpUBC9转化大肠杆菌，IPTG诱导后用Ni-亲和柱纯化获得His-TpUBC9融合蛋白；

(b)利用所述His-TpUBC9融合蛋白免疫家兔，得多克隆抗体；

(c)将所述多克隆抗体包被Dynabeads M-280 Tosylactivated磁珠，得所述TpUBC9免疫磁珠。

本发明提供了一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9，所述基因TpUBC9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因TpUBC9编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，通过酵母双杂交技术首次筛选到豆状带绦虫TpLAP的互作蛋白基因TpUBC9；首次获得豆状带绦虫SUMO化修饰系统的核心组件分子TpUBC9，并克隆了TpUBC9基因的全长cDNA，并验证了TpUBC9-TpLAP相互作用，证实带绦虫虫体内也存在精细的SUMO化修饰系统；为进行后续带绦虫SUMO化修饰相关研究提供了新的线索。

本发明进一步制备了TpUBC9抗体免疫磁珠，该方法可有效富集TpUBC9蛋白及筛选和鉴定与TpUBC9稳定互作的底物蛋白，具有特异性好，亲和性高，操作便捷，结果可靠等特点，可直接从虫体总蛋白、原核和真核表达系统中特异富集TpUBC9蛋白，可有效鉴定与TpUBC9稳定互作的底物蛋白，从而决定了这一方法在SUMO化修饰蛋白互作中应用的技术可行性；为筛选和验证SUMO化修饰底物分子提供了一种简单和实用的手段。

附图说明

图1为His-TpUBC9蛋白的SDS-PAGE及Western-blot分析结果；其中M：蛋白分子量标准；1：诱导的His-TpUBC9蛋白；2：空载体菌诱导对照；3～4：His-TpUBC9纯化蛋白(200mM和300mM咪唑洗脱)；5：His-TpUBC9与抗TpUBC9多抗反应(1μg/mL)；6：His-TpUBC9与兔阴性血清无反应；

图2为免疫磁珠纯化His-TpUBC9蛋白的Westernblot分析结果；其中1：Ni柱纯化的His-TpUBC9；2：免疫磁珠4℃孵育过夜的His-TpUBC9蛋白；3：免疫磁珠37℃孵育1h的His-TpUBC9蛋白；

图3为酵母一对一验证TpUBC9与TpLAP相互作用；其中1：阴性对照组(pGBKT7-Lam+pGADT7-T)在DDO平板上生长，在QDO/X/A平板上不生长；2：阳性对照组(pGBKT7-p53+pGADT7-T)在DDO平板上生长，在QDO/X/A平板上生长蓝色酵母菌落；3：BD-TpLAP+AD-TpUBC9实验组在DDO平板上生长，在QDO/X/A平板上生长蓝色酵母菌落；

图4为免疫磁珠验证TpUBC9与TpLAP相互作用；其中1：共转染Myc-TpLAP和Flag-TpUBC9质粒的细胞全蛋白裂解液(Input)，可分别与Myc抗体和Flag抗体反应；2：免疫磁珠分离的共转染细胞样品，与Myc抗体和Flag抗体均反应；3：未转染质粒的细胞全蛋白裂解液，与Myc抗体和Flag抗体无反应。

具体实施方式

本发明提供了一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9，所述基因TpUBC9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因TpUBC9编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述基因TpUBC9优选通过酵母双杂交技术，以TpLAP(豆状带绦虫亮氨酸氨基肽酶)为诱饵蛋白通过筛选豆状带绦虫成虫三框型酵母cDNA文库获得互作分子TpUBC9。本发明所述筛选的方法，优选包括以下步骤：

(1)三框型酵母cDNA文库的构建：Trizol法提取豆状带绦虫成虫总RNA，Oligo d(T)25Magnetic Beads纯化mRNA；采用CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒分别经BP和LR重组后，构建酵母cDNA文库；

(2)诱饵质粒的构建及鉴定：PCR扩增获得TpLAP完整CDS序列，经Nde I和Pst I双酶切回收目的片段后与pGBKT7连接，转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，提取质粒测序验证后即为诱饵载体(BD-TpLAP)；BD-TpLAP质粒转化酵母菌Y2HGold进行自激活及毒性检测；

(3)酵母双杂交：以BD-TpLAP为诱饵，自豆状带绦虫成虫三框型酵母cDNA文库中筛选TpLAP的互作蛋白。阳性菌斑抽取酵母质粒并转化大肠杆菌DH5α；挑取阳性细菌质粒测序，进行Blast比对分析，得到阳性互作基因序列；再将阳性质粒与诱饵质粒两两共转Y2HGold酵母菌进行酵母回复实验。

本发明所述TpUBC9基因cDNA全长为608bp，3'UTR长90bp，含28bp的polyA尾；ORF大小为516bp，编码171个氨基酸，预测分子量约19.59kDa，等电点为8.25。BLAST比对结果显示，TpUBC9为UBCc基因超家族的同源序列，保守结构域位于43～480位核苷酸之间。

本发明还提供了一组克隆所述基因TpUBC9的引物对，所述引物对包括正向引物TpUBC9F321和反向引物TpUBC9R487，所述正向引物TpUBC9F321的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述反向引物TpUBC9R487的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明所述引物对优选的依据上述方法筛选得到的基因TpUBC9，利用Oligo 6.0软件在基因保守区设计3'和5'特异性引物。

本发明还提供了一种扩增所述基因TpUBC9的方法，包括以下步骤：(1)将豆状带绦虫的总RNA为模板，反转录后得到cDNA第一链；

(2)以所述cDNA第一链为模板，以所述引物对为引物进行cDNA末端快速扩增；所述扩增的程序为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25个循环；

(3)胶回收所述PCR目的条带，连接至pMD19-T载体并转化E.coli DH5a感受态细胞；将经菌液PCR鉴定为阳性和测序正确的克隆，拼接3′和5′扩增序列，获得TpUBC9基因全长cDNA序列。

本发明所述扩增优选为利用RACE-PCR技术扩增拼接，首先将豆状带绦虫的总RNA为模板，反转录后得到cDNA第一链。本发明对所述豆状带绦虫的总RNA的提取并没有特殊限定，利用本领域的常规RNA提取方法即可。本发明优选利用Clontech RACEcDNA Amplification试剂盒进行所述反转录，得到带3'接头和5'接头的cDNA第一链。

得cDNA第一链后，本发明以所述cDNA第一链为模板，以所述引物对为引物进行cDNA末端快速扩增；所述扩增的程序为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25个循环。本发明优选利用ClontechRACE cDNA Amplification试剂盒进行所述扩增，所述扩增的体系以50μL计，包括：2×SeqAmp PCR buffer 25μL，10×UPM 5μL，3'GSP/5'GSP(25μM)1μL，模板2.5μL，SeqAmp DNA Polymerase 1μL，灭菌水15.5μL。

得PCR目的条带后，本发明胶回收所述PCR目的条带，连接至pMD19-T载体并转化E.coli DH5a感受态细胞；将经菌液PCR鉴定为阳性和测序正确的克隆，拼接3′和5′扩增序列，获得TpUBC9基因全长cDNA序列。本发明所述胶回收、连接和转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明在所述扩增完成后，优选还包括验证所述TpUBC9基因开放阅读框(ORF)序列的准确性。本发明优选利用如SEQ ID NO.5～6所示的引物对进行LD-PCR验证，具体方法包括：利用SEQ ID NO.5～6所示的引物扩增目的片段，连接pMD19-T载体，转化DH5a感受态细胞，阳性克隆测序后，获得序列与TpUBC9全长cDNA序列比对，确定正确的全长TpUBC9序列。

表1 TpUBC9基因扩增引物

本发明所述LD PCR的体系以50μL计，优选包括：5×Q5 Reaction buffer 10μL，2.5mM dNTP 4μL，上下游引物各1μL，5'cDNA模板2μL，Q5 DNA聚合酶1μL，5×Q5 high GCEnhancer 10μL，灭菌水21μL。本发明所述LD PCR的反应程序优选为：98℃30s；98℃10s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃再延伸2min。

本发明还提供了一种包含所述基因TpUBC9的重组表达载体pET28a-TpUBC9，以pET-28a(+)为表达载体，将所述基因TpUBC9克隆在所述表达载体的酶切位点Nde I和Xho I之间。本发明对所述重组表达载体pET28a-TpUBC9的构建方法并没有特殊限定，优选的利用SEQ ID NO.7～8所示的原核载体表达引物进行扩增(下划线表示酶切位点)：

TpUBC9F：5ˊ-GGAATTCCATATGATGGGGGGAGTAATGGGTGATT-3ˊ(Nde I，SEQ ID NO.7)

TpUBC9R：5ˊ-CCGCTCGAGAGATAGATTTGGGTTACGAAAAAG-3ˊ(Xho I，SEQ ID NO.8)。

本发明还提供了一种包含所述基因TpUBC9或所述重组表达载体pET28a-TpUBC9的重组菌。本发明对所述重组菌的构建方法并没有特殊限定。

本发明还提供了一种TpUBC9免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：(a)将所述重组表达载体pET28a-TpUBC9转化大肠杆菌，IPTG诱导后用Ni-亲和柱纯化获得His-TpUBC9融合蛋白；

(b)利用所述His-TpUBC9融合蛋白免疫家兔，得多克隆抗体；

(c)将所述多克隆抗体包被Dynabeads M-280 Tosylactivated磁珠，得所述TpUBC9免疫磁珠。

本发明对步骤(c)所述磁珠包被的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9及其用途进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

豆状带绦虫成虫三框型酵母cDNA文库构建

1.1豆状带绦虫成虫总RNA的提取和mRNA的纯化

取豆状带绦虫成虫节片约500mg，置预冷RNase free离心管中，加入液氮速冻，随即放入液氮研磨仪充分研磨，设置参数为：50Hz，120s。待研磨结束，取出离心管，虫粉中立即加入Trizol(1mL/100mg)，混匀；参照Trizol Regent试剂说明书抽提出成虫总RNA，用Agilent Bioanalyzer 2100 system和Qubit2.0 Flurometer进行总RNA的浓度和完整性测定；质量鉴定合格后，立即按照Oligo d(T)25 Magnetic Beads说明书纯化mRNA进行文库制备。

1.2成虫三框型酵母cDNA文库构建

参照CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒操作步骤分别合成cDNA第一链和cDNA第二链，将cDNA与三框attB1重组接头连接；分级分离并收集cDNA；用BP Clonase IIenzyme Mix将cDNA连接至载体pDONR222，电转化大肠杆菌DH10B，制备初级文库菌液；取转化后菌液10μL稀释1000倍后，从中取出50μL涂布LB平板(含50μg/mL卡那霉素，kan⁺)，次日计数，计算库容量；同时随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定文库重组率和***片段长度。用LR Clonase II Mix，将鉴定合格的初级文库质粒连接至AD文库载体pGADT7-DEST，电转化DH10B；制备次级文库菌液。同上进行库容量、重组率和***片段长度的鉴定；鉴定合格后即为酵母双杂交cDNA文库。

1.3结果

酵母次级文库鉴定结果表明，初级文库质粒与pGADT7-DEST载体LR重组成功。平板稀释度为1:100条件下，测得文库滴度＝675/50μL×100×1000μL＝1.35×10⁶；转化平板的总克隆数(CFU)＝1.35×10⁶×4＝5.4×10⁶。随机挑选24个克隆均扩增出了***片段，重组率达100％，cDNA***片段平均长度>1kb，达到了标准cDNA文库的要求。

实施例2

诱饵载体BD-TpLAP构建及酵母双杂交筛选

2.1 BD-TpLAP的构建

根据TpLAP完整ORF序列(GenBank：MG366593)及pGBKT7载体质粒图谱，用Oligo6.0软件设计并合成如下引物(下划线为酶切位点)：

TpLAP-BDF：5'-GGAATTCCATATGATGGGGGACCAGGGCATCAATT TCG-3'(Nde I，SEQ IDNO.9)

TpLAP-BDR：5'-AACTGCAGTCAGAGACGAGGGAGGACGTACATGC-3'(Pst I，SEQ IDNO.10)

PCR反应体系(50μL)：LATaq Mix 25μL，10μM TpLAP-BDF和TpLAP-BDR各2μL，成虫cDNA2μL，灭菌水19μL。

PCR反应条件：94℃5min，94℃1min，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。胶回收目的条带经Nde I和Pst I双酶切、回收连接至pGBKT7-T载体，转化DH5a感受态细胞及测序验证；诱饵载体命名为BD-TpLAP；在LB(kan⁺)培养基中增菌至对数期，提取诱饵质粒并测定浓度，-20℃保存备用。

2.2酵母感受态细胞的制备

(1)取Y2HGold酵母菌在YPDA平板上划线，30℃倒置培养2～3d；

(2)挑取直径2～3mm的酵母单克隆接种于3mLYPDA培养基，30℃、230r/min振荡培养8h；吸取5μL菌液至50mLYPDA中，30℃、230r/min振荡培养16～20h，至OD₆₀₀达到0.15～0.3；室温700g离心5min，弃上清；

(3)用100mLYPDA重悬酵母菌体；30℃、230r/min振荡培养3～5h，至OD600达0.4～0.5；室温700g离心5min，弃上清；用60mL无菌水重悬酵母菌体；室温700g离心5min，弃上清；用3mL 1.1×TE/LiAc溶液重悬酵母菌体；

(4)将酵母菌悬液等量分装于2个1.5mL的离心管；12000g离心15s；

(5)弃上清，将酵母重悬于600μL 1.1×TE/LiAc溶液，重悬液即为酵母感受态细胞。

2.3 BD-TpLAP质粒自激活及毒性检测

(1)将Carrier DNA置100℃加热8min，冰浴3min预变性处理2次；置冰上备用；

(2)取Y2HGold酵母感受态细胞50μL，加入100ng BD-TpLAP质粒、20μL预变性的Carrier DNA和500μL 1.1×TE/LiAc/PEG4000，混匀；阴性对照组加入100ng PGBKT7-Lam和200ng PGADT7-T质粒；阳性对照组加入100ng PGBKT7-p53和200ng PGADT7-T质粒；并各加入20μL预变性的Carrier DNA和500μL 1.1×TE/LiAc/PEG4000，混匀；

(3)30℃水浴1h，每10min混匀1次；每管加入160μL DMSO，轻柔颠倒混匀；

(4)42℃水浴热激20min，每10min上下轻柔颠倒混匀1次；700g离心5min，弃上清；用3mL YPD Plus液体培养基重悬菌体；置30℃摇床温育90min；700g离心5min；弃上清，用30mL 0.9％NaCl重悬菌体；去离子水洗涤1次菌体；0.9％NaCl重悬菌体；

(5)取100μL菌体悬液涂布于SD营养缺陷型培养平板；其中BD-TpLAP涂布于SDO/X(SD/-Trp/X-α-Gal)培养板；阴性对照组(pGBKT7-Lam+pGADT7-T)及阳性对照组(pGBKT7-p53+pGADT7-T)涂布于DDO/X(SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal)培养板；置30℃培养箱倒置培养3～5d，观察结果。

2.4酵母双杂交筛选

(1)共转化猎物和诱饵质粒，步骤为：Y2HGold酵母感受态细胞8mL中加入酵母文库质粒10μg、BD-TpLAP质粒3μg和预变性的Carrier DNA50μL，轻柔混匀；加入60mL 1×TE/LiAc/PEG，涡旋混匀；30℃、220r/min振荡培养45min；加入7mL DMSO，轻柔混匀；42℃水浴热激20min，每10min上下颠倒轻柔混匀1次；冰浴5min；700g离心5min；加入1000mLYPDA，30℃振荡培养60min；1000g离心5min，收集菌体；30℃水浴1h，每10min混匀1次；

(2)加入1×TE悬浮菌体，取菌液涂布于QDO/X/A(SD/-Ade-His-Leu-Trp/X-α-Gal/AbA)平板上，300μL/块；置电热恒温培养箱培养3～5d；观察菌落生长状态，变蓝则为阳性菌落。

2.5阳性质粒扩增及测序

(1)挑取显蓝色的酵母单菌落至5mL QDO培养基，30℃振荡培养2d，12000g离心1min，收集菌体，利用天根酵母质粒小抽试剂盒抽提酵母质粒；

(2)取5μL酵母质粒转化至DH5a感受态细胞；挑取单菌落增菌后，利用Omega公司的质粒小提试剂盒抽提质粒，测序排除假阳性克隆，Blast分析阳性质粒序列与GenBank中各物种已知基因的序列相似性；

(3)挑取互作质粒进行回复验证，将BD-TpLAP质粒和互作质粒共转化于Y2HGold感受态细胞中；菌体涂布于QDO/X/A平板；30℃培养3～5d，菌落变蓝则为阳性。

2.6结果

诱饵质粒BD-TpLAP在SDO/X平板上生长白色菌落，大小均匀，未出现蓝色克隆，表明BD-TpLAP对酵母细胞无毒性及自激活作用。筛库及测序比对分析显示，获得4个TpUBC9阳性克隆，回复杂交结果为阳性。

实施例3

豆状带绦虫TpUBC9基因全长cDNA克隆

3.1豆状带绦虫成虫总RNA的提取和cDNA第一链合成

参照Clontech RACE cDNA Amplification试剂盒说明书，以1.1提取的成虫总RNA为模板，分别合成带3'接头和5'接头的cDNA第一链。

3.2 TpUBC9基因全长cDNA的克隆

根据4个TpUBC9阳性质粒的测序结果，利用Oligo 6.0软件在基因保守区设计3'和5'特异性引物，分别以豆状带绦虫成虫3'cDNA和5'cDNA为模板扩增TpUBC9的全长cDNA；具体扩增步骤参照Clontech RACE cDNA Amplification试剂盒说明书进行，引物信息见上述表1。

PCR反应体系(50μL)：2×SeqAmp PCR buffer 25μL，10×UPM 5μL，3'GSP/5'GSP(25μM)1μL，3'cDNA/5'cDNA 2.5μL，SeqAmp DNA Polymerase 1μL，灭菌水15.5μL。

PCR扩增程序：94℃30s；72℃3min，5个循环；94℃30s,70℃30s,72℃3min，5个循环；94℃30s,68℃30s，72℃3min，25个循环。

利用胶回收试剂盒纯化PCR目的条带，连接至pMD19-T载体并转化E.coli DH5a感受态细胞；挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定为阳性的克隆送南京GenScript公司测序。利用DNAStar和SeqMan(version 5.0)软件拼接3′和5′扩增序列，获得TpUBC9基因全长cDNA序列。为进一步验证TpUBC9开放阅读框(ORF)序列的准确性，以表1中设计的LD-PCR引物扩增目的片段，连接pMD19-T载体，转化DH5a感受态细胞，阳性克隆测序后，获得序列与TpUBC9全长cDNA序列比对，确定正确的全长TpUBC9序列。

连接体系(10μL)：Solution I 5μL，PCR回收片段4.5μL，pMD19-T载体0.5μL。

LD PCR体系(50μL)：5×Q5 Reaction buffer 10μL，2.5mM dNTP 4μL，上下游引物各1μL，5'cDNA模板2μL，Q5 DNA聚合酶1μL，5×Q5 high GC Enhancer 10μL，灭菌水21μL。

LD PCR反应程序：98℃30s，98℃10s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃再延伸2min。

3.3结果

测序表明，TpUBC9基因cDNA全长为608bp，3'UTR长90bp，含28bp的polyA尾；ORF大小为516bp，编码171个氨基酸，预测分子量约19.59kDa，等电点为8.25。BLAST比对结果显示，TpUBC9为UBCc基因超家族的同源序列，保守结构域位于43～480位核苷酸之间。

实施例4

His-TpUBC9重组蛋白制备

4.1表达引物的设计与合成

根据实施例1中获得的豆状带绦虫TpUBC9基因ORF序列(SEQ NO.1)，用Oligo 6.0软件设计TpUBC9原核载体表达引物(下划线表示酶切位点)如下：

TpUBC9F：5ˊ-GGAATTCCATATGATGGGGGGAGTAATGGGTGATT-3ˊ(Nde I，SEQ ID NO.7)

TpUBC9R：5ˊ-CCGCTCGAGAGATAGATTTGGGTTACGAAAAAG-3ˊ(Xho I，SEQ ID NO.8)

4.2表达载体pET-28a(+)-TpUBC9的构建

以阳性质粒pMD19T-TpUBC9为模板，PCR扩增TpUBC9 ORF；将胶回收产物和pET-28a质粒分别用Nde I/Xho I双酶切，回收产物进行连接后转入大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞。筛选阳性克隆子，碱裂解法小量提取质粒，经PCR扩增及限制性内切酶Nde I/Xho I双酶切鉴定后，出现516bp DNA片段，与目的片段的大小相符；经测序验证后，阳性质粒命名为pET-28a(+)-TpUBC9。

4.3豆状带绦虫TpUBC9重组蛋白的诱导表达

将pET-28a(+)-TpUBC9/Transetta(DE3)重组菌接种于LB培养基中(100μg/mL，Kan⁺)，增菌培养至对数期，加入0.5mM IPTG于20℃诱导表达24h。诱导菌体经反复冻融及超声破碎后，收集上清，按Ni-NTA说明书操作纯化目的蛋白。

4.4结果

SDS-PAGE电泳分析显示，重组菌诱导后获得了可溶性表达的His-TpUBC9融合蛋白，条带大小约23kDa，与推测的蛋白大小基本一致；诱导的空载体未出现目的条带。诱导蛋白经Ni亲和层析纯化，在200～300mM咪唑浓度下洗脱出较高纯度的重组蛋白(图1)。

实施例5

兔抗TpUBC9多克隆抗体制备

5.1动物免疫

将纯化的His-TpUBC9蛋白用PBS(pH7.2)稀释至1.0mg/mL，与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化均匀；接种家兔，首次免疫100μg/只，皮下多点注射；二免抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合后乳化，接种量200μg/只；之后再加强免疫2次，免疫间隔21d。末次免疫后10d采集兔血清。

5.2多抗纯化与鉴定

抗体纯化采用饱和硫酸铵沉淀法和ProteinA亲和层析法分步纯化，具体步骤如下：取效价最高的免疫血清5mL，用PBS稀释至10mL，置磁力搅拌器上逐滴加入10mL饱和硫酸铵(pH7.2)搅拌均匀，置4℃沉淀过夜；4℃、10000g离心30min，弃上清；将沉淀复溶于10mLPBS，同法用33％饱和硫酸铵沉淀处理1次；再将沉淀复溶于3mL PBS，参照GenScript公司的Protein A亲和层析操作步骤进一步纯化抗体；分光光度法测定抗体浓度；采用间接ELISA和Westernblot方法检测血清效价及反应性。

5.3结果

ELISA检测兔高免血清效价可达1:5.12×10⁵(表2)；Western blot检测在23kDa左右出现特异的阳性反应条带，而免疫前血清无反应。结果表明制备的His-TpUBC9融合蛋白纯度高；抗His-TpUBC9多克隆抗体效价高，具有良好的免疫反应性及特异性(图1)。

表2抗His-TpUBC9多克隆抗体ELISA效价检测结果

实施例6

TpUBC9抗体免疫磁珠的制备

6.1磁珠包被

取Dynabeads M-280 Tosylactivated磁珠10mg，用0.1M硼酸溶液(pH 9.5)悬浮磁珠，置磁力架3min，弃上清；反复洗涤3次；磁珠中加入400μL兔抗TpUBC9多抗(0.5mg/mL)和200μL偶联缓冲液(0.1M硼酸，含终浓度1.2M的(NH₄)₂SO₄，pH 9.5)，混匀；置37℃缓慢旋转结合20h，磁力架收集磁珠，留上清；分光光度法测定上清中残余抗体的含量，计算抗体偶联率[抗体偶联率(％)＝已结合磁珠的抗体含量(μg)/抗体的加入总量(μg)]。磁珠中加入洗涤液1(0.01M PBS，含0.15M NaCl和0.5％BSA，pH 7.4)，置37℃缓慢旋转结合1h，磁力架收集磁珠；用洗涤液2(0.01M PBS，含0.15M NaCl和0.1％BSA，pH 7.4)反复洗涤免疫磁珠3次；4℃保存备用。

6.2免疫磁珠纯化His-TpUBC9蛋白效果分析

取4.3中含TpUBC9的超声破碎上清0.5mL与1mg免疫磁珠混匀，37℃孵育1h，置磁力架2min，弃上清；用洗涤缓冲液2洗涤磁珠5次；MPC收集磁珠，加入1×蛋白上样缓冲液50μL，12％SDS-PAGE分析蛋白并用Anti-His-HRP进行Westernblot鉴定。

6.3结果

成功制备了TpUBC9抗体免疫磁珠，抗体结合完全，偶联率达100％；利用免疫磁珠从1mL的诱导菌液上清中分离获得可溶性His-TpUBC9蛋白(图2)，操作便捷，蛋白纯化效果好。

实施例7

TpUBC9-TpLAP相互作用的验证

7.1质粒构建

根据TpLAP(GenBank：MG366593)和TpUBC9基因(SEQ NO.1)ORF序列，分别构建AD-TpUBC9、Flag-TpUBC9和Myc-TpLAP载体；Oligo6.0软件设计并合成引物(表3，下划线为酶切位点)。按常规PCR方法扩增带酶切位点的目的条带，经双酶切、回收纯化、连接转化及测序验证。完成猎物载体和真核标签表达载体的构建；参照Omega公司无内毒素质粒小提取试剂盒说明书，分别提取质粒，Nanodrop 2000测定浓度。

表3载体构建引物

7.2酵母一对一验证TpUBC9-TpLAP相互作用

参照2.3操作方法，进行AD-TpUBC9自激活和毒性检测。参照2.4操作方法进行AD-TpUBC9与BD-TpLAP酵母一对一验证，取100ng BD-TpLAP和200ngAD-TpUBC9质粒共转化于Y2HGold酵母感受态细胞；细胞悬液涂布于DDO和QDO/X/A平板上；置30℃培养箱培养3～5d，观察菌落生长情况，在QDO/X/A平板上生长蓝斑为阳性。

7.3免疫磁珠验证TpUBC9-TpLAP相互作用

(1)HEK293T细胞培养及转染常规培养HEK293T细胞，待细胞生长密度达70％且形态良好时，更换DMEM完全培养液(含10％胎牛血清)；按照Xfect^TM Transfection Reagent转染试剂说明书，将Myc-TpLAP和Flag-TpUBC9质粒共转染到HEK293T细胞中；同时将未转染质粒的HEK293T细胞作为阴性对照。具体转染步骤为：取Myc-TpLAP和Flag-TpUBC9质粒各10μg，加至Xfect Reaction Buffer中(终体积300μL)，充分混匀；然后加入6.5μL的Polymer，充分混匀，室温孵育10min使之形成纳米复合物；瞬时离心后将300μL复合物逐滴加至细胞瓶培养液中，轻柔混匀，置CO₂恒温培养箱培养过夜；次日更换新鲜DMEM完全培养液，继续培养48h。

(2)免疫共沉淀(CoIP)收集细胞，加入细胞裂解液(100μL细胞裂解液+10μLPMSF)，摇床30min，于4℃、12000g离心20min；取500μL细胞裂解上清液加入免疫磁珠1mg，4℃旋转孵育过夜；置磁力架2min，弃上清；用预冷PBS洗3次；磁珠中加入1×蛋白上样缓冲液50μL，煮10min，离心取上清电泳；将未转染细胞全蛋白裂解液，共转染细胞全蛋白裂解液(Input)及IP样品经12％SDS-PAGE电泳，eBlot系统转印至PVDF膜；分别与鼠抗Myc抗体和兔抗Flag抗体反应，4℃过夜；TBST漂洗3次；再分别与对应HRP标记二抗于37℃孵育1h；TBST漂洗3次，5min/次；加入ECL底物发光液避光显色，观察结果。

7.3结果

BD-TpLAP和AD-TpUBC9所携带的两个全长基因单独存在情况下不能激活Y2HGold中的报告基因，无自激活活性，菌落生长状态好，无毒性。酵母一对一分析表明：二者共转化后在QDO/X/A平板上生长蓝斑，证实二者存在互作(图3)。CoIP结果显示Myc-TpLAP和Flag-TpUBC9在细胞内可形成相互作用的蛋白复合物，TpUBC9可直接识别TpLAP靶蛋白分子(图4)；说明制备的TpUBC9抗体免疫磁珠可用于TpUBC9直接互作蛋白的分析和鉴定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种豆状带绦虫SUMO化修饰系统基因TpUBC9及其用途

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> Taenia pisiformis

<400> 1

atggggggag taatgggtga tttcagtgag gctgatggta ttgctttgaa aaggttagct 60

gaagaaagga aggcatggcg tagggaccat ccctttggat tcgttgctaa acccacaaaa 120

aatgccgatg gcactctcga cctcatgacc tgggattgta gtattcctgg taaaaaagga 180

actctttggg agggtgggct ttttcatctt cgtatgtact ttaagcctga ataccctaca 240

actccgccta aatgcaaatt cgaaccgcct ctgttccacc cgaacatttt tccttcaggg 300

acggtttgtc tttcgcttct agatgaggaa aaacattggc gccccgctgt taccattaag 360

cagatccttc tggggattca agatctttta gatcacccta accccaagga tccggcgcag 420

gcggatgcat atacattgtt cattcagaat cggaaggact atgactacag aataaagaaa 480

caagctgaac tttttcgtaa cccaaatcta tcttaa 516

<210> 2

<211> 171

<212> PRT

<213> Taenia pisiformis

<400> 2

Met Gly Gly Val Met Gly Asp Phe Ser Glu Ala Asp Gly Ile Ala Leu

1 5 10 15

Lys Arg Leu Ala Glu Glu Arg Lys Ala Trp Arg Arg Asp His Pro Phe

20 25 30

Gly Phe Val Ala Lys Pro Thr Lys Asn Ala Asp Gly Thr Leu Asp Leu

35 40 45

Met Thr Trp Asp Cys Ser Ile Pro Gly Lys Lys Gly Thr Leu Trp Glu

50 55 60

Gly Gly Leu Phe His Leu Arg Met Tyr Phe Lys Pro Glu Tyr Pro Thr

65 70 75 80

Thr Pro Pro Lys Cys Lys Phe Glu Pro Pro Leu Phe His Pro Asn Ile

85 90 95

Phe Pro Ser Gly Thr Val Cys Leu Ser Leu Leu Asp Glu Glu Lys His

100 105 110

Trp Arg Pro Ala Val Thr Ile Lys Gln Ile Leu Leu Gly Ile Gln Asp

115 120 125

Leu Leu Asp His Pro Asn Pro Lys Asp Pro Ala Gln Ala Asp Ala Tyr

130 135 140

Thr Leu Phe Ile Gln Asn Arg Lys Asp Tyr Asp Tyr Arg Ile Lys Lys

145 150 155 160

Gln Ala Glu Leu Phe Arg Asn Pro Asn Leu Ser

165 170

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcctgaatac cctacaactc cgcct 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggatccttg gggttagggt gatc 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acatgggggg agtaatgggt gat 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggggacga atgcacatat tgg 23

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggaattccat atgatggggg gagtaatggg tgatt 35

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctcgaga gatagatttg ggttacgaaa aag 33

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaattccat atgatggggg accagggcat caatttcg 38

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aactgcagtc agagacgagg gaggacgtac atgc 34

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccggaattca tggggggagt aatgggtg 28

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cacgagctct taagatagat ttgggttacg 30

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcccaagctt atggggggag taatgggt 28

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccggaattct taagatagat ttgggttacg 30

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggaattcaa atgggggacc agggcatc 28

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgcgtcgac tcagagacga gggaggacg 29