一种检测肌苷酸的酶生物传感器、其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种检测肌苷酸的酶生物传感器、其制备方法和应用 (A kind of enzyme biologic sensor, preparation method and application detecting inosinicacid ) 是由 刘源 刘静思 王广现 姜水 于 2019-09-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物传感器技术领域,公开了一种检测肌苷酸的酶生物传感器、其制备方法和应用,其线性检测范围为0.313～210μg/L,检出限为0.238μg/L,由参比电极、对电极和由工作电极表面固化对肌苷酸敏感的物质识别膜得到的修饰电极组成,物质识别膜由复合溶液a、由5’-核苷酸酶溶液和黄嘌呤氧化酶溶液按体积比1：1组成的双酶复合溶液b和牛血清白蛋白溶液按体积比1:1:1组成,复合溶液a由MXene-Ti<Sub>3</Sub>C<Sub>2</Sub>Tx溶液(T选自-OH、-O或-F)、壳聚糖溶液、氯金酸溶液和氯铂酸溶液按体积比12：1.2：1：1组成。本发明酶生物传感器简单、快速、准确,灵敏度高,可用于食品中肌苷酸定量检测。(The invention belongs to biosensor technology fields, disclose a kind of enzyme biologic sensor for detecting inosinicacid, preparation method and application, its linear detection range is 0.313~210 μ g/L, detection is limited to 0.238 μ g/L, by reference electrode, to electrode and the modified electrode obtained to the material identification film of inosine acid-sensitive is solidified by working electrode surface forms, material identification film is by composite solution a, by 5'-NT solution and xanthine oxidase solution double enzyme composite solution b that 1:1 is formed by volume and bovine serum albumin solution, 1:1:1 is formed by volume, composite solution a is by MXene-Ti 3 C 2 12:1.2:1:1 is formed by volume for Tx solution (T is selected from-OH ,-O or-F), chitosan solution, chlorauric acid solution and platinum acid chloride solution.Enzyme biologic sensor of the present invention is simple, quick, accurate, and high sensitivity can be used for inosinicacid quantitative detection in food.)
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种检测肌苷酸的酶生物传感器、其制备方法和应用，用于食品中肌苷酸(IMP)的检测。
背景技术
肌苷酸(IMP)是一种单核苷酸，是生物体内ATP的代谢中间体。肌苷酸及其盐类能够产生鲜味，是肉品中重要的风味物质之一，它还能够与谷氨酸钠协同作用，使鲜味成倍增加，是一种常用的调味剂。除此之外，肌苷酸也是国际公认的衡量肉类新鲜程度的重要指标。目前，定量检测肌苷酸的方法包括分光光度法、高效液相色谱法等，但这些方法存在着检测成本高、耗费时间长、操作复杂等问题，相较而言，电化学酶生物传感器具有较高的敏感性和选择性，能够有效地放大信号，且样品用量较少，响应迅速，操作简单，更加适用于食品中肌苷酸的检测。
酶电极制备过程中的关键步骤是酶的固定化，近几十年来，研究人员一直在不断寻找合适的酶载体材料和固定化方法。MXene-Ti3C2Tx(T＝OH、O或F)材料是一种过渡族金属碳化物，具有类石墨烯的二维结构，比表面积高、导电率高，稳定性、生物相容性好，能够促进酶活性中心和电极界面之间的电子转移，在生物传感器酶载体方面有良好的应用前景，纳米Au、Pt粒子能够降低酶解产物过氧化氢的过电位，从而提高酶生物传感器的检测性能，壳聚糖具有良好成膜性，常被用于酶的固定化。
发明内容
为了克服现有检测肌苷酸的方法检测成本高、耗费时间长、操作复杂的问题，本发明的首要目的在于提供一种具有良好选择性、灵敏度和稳定性的检测肌苷酸的酶生物传感器。
本发明的另一目的在于提供上述酶生物传感器的制备方法，通过合适的酶载体材料和固定化方法获得性能稳定的酶生物传感器。
本发明的再一目的在于提供上述酶生物传感器在肌苷酸定量检测中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方法实现：
第一方面，本发明的检测肌苷酸的酶生物传感器，由参比电极、对电极及修饰电极组成，所述修饰电极通过工作电极表面固化对肌苷酸敏感的物质识别膜得到；其中：
所述物质识别膜由复合溶液a、双酶复合溶液b和10mg/mL的牛血清白蛋白溶液按照体积比为1:1:1组成；其中，所述复合溶液a由0.5～1.25mg/mL的MXene-Ti3C2Tx溶液、5mg/mL的壳聚糖溶液、5mmol/L的氯金酸溶液和3mmol/L的氯铂酸溶液按体积比12：1.2：1：1组成，所述双酶复合溶液b由2mg/mL的5’-核苷酸酶溶液和2mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液按体积比1：1组成；
所述MXene-Ti3C2Tx内T选自-OH、-O或-F；
所述5’-核苷酸酶溶液由5’-核苷酸酶溶于pH 6.0、0.01M的PBS溶液得到，所述黄嘌呤氧化酶溶液由黄嘌呤氧化酶溶于pH 6.0、0.01M的PBS溶液得到。
优选的，所述MXene-Ti3C2Tx的制备方法为：将1.6gLiF缓慢溶于20mL9mol/L的HCl水溶液，搅拌5min，然后加入1.0gTi3AlC2粉末，室温条件下以400rpm磁力搅拌24h；然后以3500rpm离心5min，将所得沉淀物用超纯水洗涤；重复超声及洗涤操作5～8次，当测得溶液pH为6时，收集沉淀物，溶于100mL水中，在氩气保护下，于4℃冰浴中超声3h，使所得Ti3C2Tx薄片脱层；最后以8000rpm离心1h，收集上清液，60℃真空干燥得到黑色粉末，即为MXene-Ti3C2Tx。
优选的，所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极，所述对电极为铂电极。
优选的，所述酶生物传感器的线性检测范围为0.313～210μg/L。
优选的，所述酶生物传感器的检出限为0.238μg/L。
第二方面，所述酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)对工作电极进行表面预处理；
(2)将MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液、氯铂酸溶液按配比混合均匀，得复合溶液a，并将其滴加到步骤(1)表面预处理后的工作电极表面，室温晾干；
(3)将5’-核苷酸酶溶液和黄嘌呤氧化酶溶液按配比混合均匀，得双酶复合溶液b，并将其滴加到步骤(2)处理后的电极表面，室温晾干；
(4)将牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(3)处理后的电极表面，室温晾干，得修饰电极；
(5)将步骤(4)所得修饰电极与所述参比电极和所述对电极组成三电极体系，即得；
其中，所述复合溶液a、双酶复合溶液b和牛血清白蛋白溶液的滴加量体积比为1:1:1。
优选的，步骤(1)中，所述工作电极表面预处理的步骤为：将工作电极依次使用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，然后置于铁***溶液中进行活化处理，取出，用超纯水冲洗，氮气吹干；所述铁***溶液为由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液。
第三方面，上述生物传感器在肌苷酸定量检测中的应用，线性检测范围为0.313～210μg/L，检出限为0.238μg/L。
本发明选用新型二维纳米材料MXene-Ti3C2Tx(T＝-OH、-O或-F)，结合纳米Au、Pt粒子并利用壳聚糖的成膜性和包埋性，构建电化学酶生物传感器的酶载体，增加酶催化剂在电极表面的固定量和稳定性，有助于对底物的催化。滴加由5’-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶组成的双酶复合溶液后用牛血清白蛋白溶液封闭成膜，得到修饰电极，再配合参比电极和对电极组成三电极体系，制得用于检测肌苷酸的酶生物传感器，线性检测范围为0.313～210μg/L，检出限为0.238μg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的生物传感器具有良好的电子传递性，能将反应产生的电子在酶活性中心与电极表面之间进行良好的转移，提高生物传感器的反应速度。
(2)本发明的生物传感器具有良好的选择性，可对肌苷酸进行准确检测，抗干扰能力强，对半胱氨酸、蛋氨酸、肌苷二磷酸和肌苷三磷酸等干扰物无电流响应。
(3)本发明的生物传感器具有良好的稳定性和重现性，通过方波伏安法连续测量10次，结果仅显示出3.4％的相对标准偏差，在4℃存放2周后仍能达到原始响应电流的95％。
(4)本发明的生物传感器可用于食品中肌苷酸的检测，制备工艺简单、安全，可在室温环境检测条件下检测，具有较宽的检测范围，较低的检测限，应用前景好。
附图说明
图1是本发明中酶生物传感器的整体结构示意图。
图2是本发明中酶生物传感器工作电极的制备流程图。
图3是实施例2中酶生物传感器工作电极在PBS溶液(0.01M、pH＝6.0)中的循环伏安曲线图；其中，a表示扫描速率为160mV/s，b表示扫描速率为120mV/s，c表示扫描速率为80mV/s，d表示扫描速率为40mV/s。
图4是实施例3中酶生物传感器在存在3μmol/L肌苷酸和不存在肌苷酸的PBS溶液(0.01M、pH＝6.0)中的循环伏安曲线图；其中，a表示PBS溶液中存在浓度为3μmol/L的肌苷酸，b表示PBS溶液中不存在肌苷酸。
图5是实施例3中酶生物传感器在存在3μmol/L肌苷酸和不存在肌苷酸的PBS溶液中(0.01M、pH＝6.0)的差分脉冲伏安曲线图；其中，a表示PBS溶液中不存在肌苷酸，b表示PBS溶液中存在3μmol/L的肌苷酸。
图6是实施例4中酶生物传感器在PBS溶液中以100mV/s扫描速率、-0.15V电位条件下，对不同浓度肌苷酸的电流-时间响应曲线图。
图7是实施例4中酶生物传感器对不同浓度肌苷酸的响应电流的标准曲线。
图8是实施例5中酶生物传感器对PBS溶液中不同干扰物及肌苷酸的电流-时间响应曲线图。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例MXene-Ti3C2Tx材料可以是市售产品或采用以下方法制备得到：将1.6gLiF缓慢溶于20mL9mol/L的HCl水溶液，搅拌5min，然后加入1.0gTi3AlC2粉末，室温条件下以400rpm磁力搅拌24h；然后以3500rpm离心5min，将所得沉淀物用超纯水洗涤；重复超声及洗涤操作5～8次，当测得溶液pH为6时，收集沉淀物，溶于100mL水中，在氩气保护下，于4℃冰浴中超声3h，使所得Ti3C2Tx薄片脱层，最后以8000rpm离心1h，收集上清液，60℃真空干燥得到黑色粉末，即为MXene-Ti3C2Tx。
实施例1
检测肌苷酸的酶生物传感器，其整体结构如图1所示，由参比电极2、对电极3及修饰电极1组成，修饰电极1由工作电极1-1及固化在工作电极表面的物质识别膜1-2组成，其中，对肌苷酸敏感的物质识别膜1-2由MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液、氯铂酸溶液、5’-核苷酸酶溶液、黄嘌呤氧化酶溶液以及牛血清白蛋白溶液制备而成，将上述酶生物传感器放入待测液4中，可检测待测液4中肌苷酸的含量。
修饰电极1的制备流程如图2所示，具体制备方法步骤为：
(1)工作电极预处理。将工作电极依次使用直径为0.3μm与0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁***溶液(由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液)中，在-0.2～0.6V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
(2)滴加复合溶液a。在预处理后的电极表面滴加5μL a溶液；a溶液为MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液、氯铂酸溶液的混合溶液，其中MXene-Ti3C2Tx溶液的浓度为0.5～1.25mg/mL，壳聚糖溶液的浓度为5mg/mL，氯金酸溶液的浓度为5mmol/L，氯铂酸溶液的浓度为3mmol/L，MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液、氯铂酸溶液的体积比为12：1.2：1：1；
(3)滴加双酶复合溶液b。待电极表面滴加的a溶液干燥后，滴加5μLb溶液；b溶液为5’-核苷酸酶溶液、黄嘌呤氧化酶溶液的混合溶液，其中5’-核苷酸酶溶液的浓度为2mg/mL，黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为2mg/mL，5’-核苷酸酶溶液、黄嘌呤氧化酶溶液的体积比为1：1；
(4)滴加牛血清白蛋白溶液。待电极表面滴加的b溶液干燥后，滴加5μL牛血清白蛋白溶液，干燥后即制得修饰电极1。
将上述修饰电极1，与参比电极2和对电极3组成三电极体系，即得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
实施例2
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
(1)将直径为3mm的玻碳电极依次使用直径为0.3μm与0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁***溶液(由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液)中，在-0.2～0.6V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
(2)将125mgMXene-Ti3C2Tx材料分散于100mL超纯水中，获得浓度为1.25mg/mL的MXene-Ti3C2Tx溶液；采用1wt％乙酸溶液配制浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液；将98.50mg三水合四氯金酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为5mmol/L的氯金酸溶液；将77.70mg六水合六氯铂酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为3mmol/L的氯铂酸溶液；将20mg5’-核苷酸酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的5’-核苷酸酶溶液；将20mg黄嘌呤氧化酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，将500mg牛血清白蛋白溶于50mL超纯水，得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。
(3)将MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液及氯铂酸溶液按照12：1.2：1：1的体积比混合均匀，得到复合溶液a，取5μL复合溶液a滴加到步骤(1)表面预处理过的玻碳电极表面，室温晾干。
(4)将5’-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1：1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5μL双酶复合溶液b滴加到步骤(3)中玻碳电极表面，室温晾干。
(5)取5μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
(6)将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极(KCl浓度为3mol/L)和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用循环伏安法对实施例2制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将检测肌苷酸的酶生物传感器浸入pH 6.0、0.01M的PBS缓冲溶液，采用循环伏安法进行电化学测试，扫描速率为40、80、120、160mV/s，扫描电位范围为-0.6～0.6V。
图3是检测肌苷酸的酶生物传感器工作电极在pH 6.0、0.01M的PBS溶液中的循环伏安曲线图，其中，a表示扫描速率为160mV/s，b表示扫描速率为120mV/s，c表示扫描速率为80mV/s，d表示扫描速率为40mV/s；阴极和阳极峰值电流随着扫描速率的增加而线性增加，峰值电流与扫描速率成正比，表明5’-肌苷酸酶/黄嘌呤酶和工作电极之间的电子转移可以在物质识别膜上快速进行。
实施例3
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
(1)将直径为3mm的玻碳电极依次使用直径为0.3μm与0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁***溶液(由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液)中，在-0.2～0.6V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
(2)将125mgMXene-Ti3C2Tx材料分散于100mL超纯水中，获得浓度为1.25mg/mL的MXene-Ti3C2Tx溶液；采用1wt％乙酸溶液配制浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液；将98.50mg三水合四氯金酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为5mmol/L的氯金酸溶液；将77.70mg六水合六氯铂酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为3mmol/L的氯铂酸溶液；将20mg5’-核苷酸酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的5’-核苷酸酶溶液；将20mg黄嘌呤氧化酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，将500mg牛血清白蛋白溶于50mL超纯水，得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。
(3)将MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液及氯铂酸溶液按照12：1.2：1：1的体积比混合均匀，得到复合溶液a，取5μL复合溶液a滴加到步骤(1)表面预处理过的玻碳电极表面，室温晾干。
(4)将5’-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1：1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5μL双酶复合溶液b滴加到步骤(3)中玻碳电极表面，室温晾干。
(5)取5μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
(6)将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极(KCl浓度为3mol/L)和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用循环伏安法对实施例3制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将检测肌苷酸的酶生物传感器浸入pH 6.0、0.01M的PBS缓冲溶液，在PBS缓冲液中注入3μmol/L肌苷酸，采用循环伏安法进行电化学测试，扫描速率为100mV/s，扫描电位范围为-0.2～0.6V。
图4是检测肌苷酸的酶生物传感器工作电极在pH 6.0、0.01M的PBS溶液中的循环伏安曲线图，其中，a表示PBS溶液中存在3μmol/L的肌苷酸，b表示PBS溶液中不存在肌苷酸，当注入3μmol/L肌苷酸后，氧化电流和还原电流明显增加，表明固定在电极上的5’-肌苷酸酶和黄嘌呤酶具有高度的生物催化性，可对溶液中的肌苷酸产生灵敏的电流响应，电极表面实现快速的电子转移。
采用差分脉冲伏安法对实施例3制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将检测肌苷酸的酶生物传感器浸入pH6.0、0.01M的PBS缓冲溶液，在PBS缓冲液中注入3μmol/L肌苷酸，采用差分脉冲伏安法进行电化学测试，扫描电位范围为-0.2～0.6V。
图5是检测肌苷酸的酶生物传感器工作电极在pH6.0、0.01M的PBS溶液中的差分脉冲伏安曲线图，其中，a表示PBS溶液中不存在肌苷酸，b表示PBS溶液中存在3μmol/L的肌苷酸。差分脉冲伏安法对电极施加阶梯电势，与循环伏安法相比，灵敏度和分辨率更高，有很好的检测能力。图中a与b相比，PBS溶液中存在肌苷酸的b曲线电流峰值更高，电流峰在-0.15V附近，表明在相对较低的-0.15V(相对于Ag/AgCl)电位附近观察到酶生物传感器对肌苷酸的最大响应电流，因此可将-0.15V作为固定电压，作进一步的电流-时间法电化学表征，从而有效降低背景干扰因素，降低检测限。
实施例4
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
(1)将直径为3mm的玻碳电极依次使用直径为0.3μm与0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，再将玻碳电极置于铁***溶液(由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液)中，在-0.2～0.6V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
(2)将50mgMXene-Ti3C2Tx材料分散于100mL超纯水中，获得浓度为0.5mg/mL的MXene-Ti3C2Tx溶液；采用1wt％乙酸溶液配制浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液；将98.50mg三水合四氯金酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为5mmol/L的氯金酸溶液；将77.70mg六水合六氯铂酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为3mmol/L的氯铂酸溶液；将20mg5’-核苷酸酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的5’-核苷酸酶溶液；将20mg黄嘌呤氧化酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，将500mg牛血清白蛋白溶于50mL超纯水，得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。
(3)将MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液及氯铂酸溶液按照12：1.2：1：1的体积比混合均匀，得到复合溶液a，取5μL复合溶液a滴加到步骤(1)表面预处理过的玻碳电极表面，室温晾干。
(4)将5’-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1：1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5μL双酶复合溶液b滴加到步骤(3)中玻碳电极表面，室温晾干。
(5)取5μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
(6)将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极(KCl浓度为3mol/L)和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用电流-时间法对实施例4制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将检测肌苷酸的酶生物传感器浸入10mLpH 6.0、0.05M的PBS缓冲溶液，每隔30s往PBS缓冲液中加入浓度为3μmol/L的肌苷酸3μL，且用磁力搅拌器不断搅拌，采用电流-时间法进行电化学测试，固定电位为-0.15V，扫描速率为100mV/s。
图6是实施例4中制备的酶生物传感器在-0.15V的固定电位、100mV/s的扫描速率下对不同浓度肌苷酸响应的时间-电流曲线。可以看出，每隔30s加入3μL肌苷酸(3μmol/L)后，图像呈现梯度曲线，修饰的工作电极对肌苷酸的响应时间小于5s(达到稳态电流的98％)，表明电极表面的物质识别膜在所测肌苷酸浓度范围内保持着较好的生物催化活性。
图7所示的是实施例4中检测肌苷酸的酶生物传感器对不同浓度肌苷酸的响应电流的标准曲线；该图显示，当肌苷酸浓度在0.313～3.761μg/L内，响应电流与肌苷酸浓度成线性关系，线性回归方程为：I(μA)＝0.9488+2036.4C(μmol/L)，相关系数R2为0.9973，检出限为0.238μg/L。提高所滴加的肌苷酸浓度，重复以上实验，可得：当肌苷酸浓度在0.313～210μg/L内时，响应电流与肌苷酸浓度成线性关系，检出限为0.238μg/L。因此，本发明酶生物传感器可用于肌苷酸的定量检测。
对实际样品的检测：
选用4种不同的肉样品(鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉)，各取5g，在5g肉样品中加入20mL5％高氯酸，使用匀浆机在10000rpm均化3min，然后用5％高氯酸稀释至25mL，将匀浆在4℃条件下以15000rpm离心10分钟，收集上清液，用KOH调节pH＝5.5，再在4℃以15000rpm离心10分钟，收集上清液，用于肌苷酸含量的分析检测。将实施例4中制备的酶生物传感器的检测结果与液相色谱的检测结果进行对比，具体检测结果如下表1所示。
表1.实际样品的肌苷酸含量检测结果比较(单位：mg/g)
表1的结果显示，实施例4中制备的酶生物传感器与液相色谱的检测结果相差不大，表明构建的酶生物传感器可以应用于实际样品中肌苷酸含量的分析检测。
实施例5
用于检测肌苷酸的酶生物传感器，其制备步骤如下：
(1)将直径为3mm的玻碳电极依次使用直径为0.3μm与0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上抛光成镜面，再用超纯水冲洗，然后在超纯水中超声处理1min，晾干后，将玻碳电极置于铁***溶液(由K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和KCl按摩尔比为1:1:100组成的混合溶液)中，在-0.2～0.6V下采用循环伏安法扫描4圈进行电极活化，取出用超纯水冲洗，氮气吹干后得到预处理的玻碳电极。
(2)将50mgMXene-Ti3C2Tx材料分散于100mL超纯水中，获得浓度为0.5mg/mL的MXene-Ti3C2Tx溶液；采用1wt％乙酸溶液配制浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液；将98.50mg三水合四氯金酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为5mmol/L的氯金酸溶液；将77.70mg六水合六氯铂酸溶于50mL超纯水中，得到浓度为3mmol/L的氯铂酸溶液；将20mg5’-核苷酸酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的5’-核苷酸酶溶液；将20mg黄嘌呤氧化酶溶于10mLPBS溶液(pH 6.0、0.01M)中，得到浓度为2mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，将500mg牛血清白蛋白溶于50mL超纯水，得到浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液。
(3)将MXene-Ti3C2Tx溶液、壳聚糖溶液、氯金酸溶液及氯铂酸溶液按照12：1.2：1：1的体积比混合均匀，得到复合溶液a，取5μL复合溶液a滴加到步骤(1)表面预处理过的玻碳电极表面，室温晾干。
(4)将5’-核苷酸酶溶液及黄嘌呤氧化酶溶液按照1：1的体积比混合均匀，得到双酶复合溶液b，取5μL双酶复合溶液b滴加到步骤(3)中玻碳电极表面，室温晾干。
(5)取5μL牛血清白蛋白溶液滴加到步骤(4)中玻碳电极表面，室温晾干，得到修饰电极。
(6)将修饰电极与作为参比电极的Ag/AgCl电极(KCl浓度为3mol/L)和作为对电极的铂丝组合成三电极体系，得到检测肌苷酸的酶生物传感器。
采用电流-时间法对实施例5制备的酶生物传感器进行测试，具体步骤为：室温下，将检测肌苷酸的酶生物传感器浸入pH 6.0、0.05M的PBS缓冲溶液，往PBS缓冲液中依次加入肌苷三磷酸(1g/L)、半胱氨酸(1g/L)、肌苷酸(0.1g/L)、肌苷二磷酸(1g/L)、肌苷酸(0.1g/L)、蛋氨酸(1g/L)、肌苷酸(0.1g/L)，且用磁力搅拌器不断搅拌，采用电流-时间法进行电化学测试，固定电位为-0.15V，扫描速率为100mV/s。
图8是实施例5中制备的酶生物传感器在-0.15V的固定电位、100mV/s的扫描速率下对不同干扰物质及肌苷酸响应的时间-电流曲线。可以看出，当在PBS缓冲液中添加肌苷酸后电流信号变大，而当添加干扰物时无任何电流响应，说明制备的酶生物传感器具有良好的特异性和抗干扰性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。