阅读说明：本技术 用于通过使用集成电泳dna纯化来检测遗传结构变异的系统和方法 (For purifying the system and method to detect genetic structure variation by using integrated electrophoresis DNA ) 是由 T·C·伯勒斯 于 2018-04-06 设计创作，主要内容包括：一种电泳盒,其可以包括样品孔、含有分离凝胶的凝胶柱和与凝胶柱相邻布置的洗脱模块。样品可以被提供给电泳盒,并且可以从样品中分离高分子量DNA。可以在DNA序列的重复区域的两侧上切割单拷贝DNA序列,以产生切割的样品,然后可以使用凝胶电泳对其进行分级。可以从分离凝胶的连续切片中分离DNA级分,并且经受PCR测定,以检测DNA级分内的单拷贝序列,所述单拷贝序列含有重复扩增序列。可以将所述DNA级分电洗脱到多个洗脱模块内。可以确定具有重复扩增序列的DNA级分的大小。还确定该大小是否在正常重复大小范围以上。(A kind of electrophoresis cartridge may include sample well, the gel column containing separating gel and the elution module being adjacently positioned with gel column.Sample can be provided to electrophoresis cartridge, and high-molecular-weight DNA can be separated from sample.Single-copy DNA sequence can be cut on the two sides of the repeat region of DNA sequence dna, to generate the sample of cutting, gel electrophoresis then can be used, it is classified.DNA fraction can be separated from the serial section of separating gel, and is subjected to PCR measurement, and to detect the single-copy sequence in DNA fraction, the single-copy sequence contains repeat amplification protcol sequence.It can will be in the DNA fraction electroelution to multiple elution modules.It can determine the size of the DNA fraction with repeat amplification protcol sequence.Also determine whether the size is normally repeating magnitude range or more.)

用于通过使用集成电泳DNA纯化来检测遗传结构变异的系统 和方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2017年4月7日提交，且名称为“Systems and Methods forDetection of Genetic Structural Variation Using Integrated ElectrophoreticDNA Purification”的美国临时专利申请号62/483,261的优先权和权益。本专利申请将上文引用的专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

背景技术

许多遗传性遗传疾病由含有简单DNA序列重复的染色体区域的长度扩增引起。例如，脆性X精神发育迟滞综合征，由基因FMR1的5'末端附近的(CGG)_n序列引起，并且从大多数未受影响的个体中的<50个CGG拷贝扩增到大多数受影响的个体中的多于200个拷贝(Nolin等人，2003)。类似地，在与ALS相关的最常见的突变基因，C9orf72中，第一个内含子中的(G₄C₂)_n重复从<8个重复到≥300个重复的扩增与疾病状态相关(Suh等人，2015)。至少二十二种遗传性神经系统疾病由此类重复扩增突变引起(La Spada和Taylor，2010)。

此类重复扩增突变的检测和分析可能因几个因素而复杂化。首先，含有长度为2-10bp的简单序列重复的区域的PCR扩增是易于出错的，通常产生在重复单元数方面不同的扩增子产物家族。许多重复扩增也是极度富含GC的，这使得PCR测定开发甚至更加困难。通过对于特定基因组基因座的仔细优化，这些问题可以降到最低，使得可以获得有用的诊断测定，但是此类测定的优化是费力且耗时的，并且关于一种重复扩增类型的条件通常不能转移到其它测定。

关于PCR测定的另一个困难是一些重复扩增的大小可以>20kb(Nolin等人，2003)，超出了PCR测定的典型尺寸范围，其一般发现在5-10kb之间。这意味着具有极大扩增的等位基因可能在PCR测定中未被检测到。

为了避免这些复杂化，在许多情况下仍然使用DNA印迹分析，特别是在重复扩增大小可以是许多kb的情况下。然而，DNA印迹的常规使用是非常费力且耗时的，并且出结果的时间可以是两到四天，包括印迹分析时间。

发明内容

本文描述了各种仪器、系统和方法。在一些实施例中，可以提供电泳盒。电泳盒可以包括至少一个样品孔、含有分离凝胶的至少一个凝胶柱、以及紧靠至少一个凝胶柱布置的多个洗脱模块。样品可以在电泳盒中提供。可以从其中分离高分子量DNA，并且可以在DNA的重复区域的两侧上切割单拷贝DNA序列，从而产生切割的样品。可以使用凝胶电泳分级切割的样品，并且可以从分离凝胶的连续切片中分离DNA级分。可以使DNA级分经受PCR测定，以检测DNA级分内的单拷贝序列，所述单拷贝序列含有重复扩增序列，并且可以将所述DNA级分电洗脱到多个洗脱模块内。可以确定具有重复扩增序列的DNA级分的大小。可以确定具有重复扩增序列的DNA级分的大小是否在正常重复大小范围以上。

切割可以通过限制性酶执行，并且这些酶可以配置为不在含有重复的DNA片段内切割。可替代地和/或另外地，可以用可定制的RNA或DNA指导的切割酶执行切割，所述切割酶可以包含Cas9、Cpf1和NgAgo。

在一些实施例中，可以在电泳盒的多个洗脱模块中提供液体电泳缓冲液，使得经受PCR测定的DNA级分电洗脱到多个洗脱模块内，并设置在所述电泳缓冲液中。可以将具有DNA级分的电泳缓冲液加入PCR反应中，并且这可以就重复扩增序列内的单拷贝序列靶进行测定。

改变电泳条件，如凝胶浓度、电压、电压波形、缓冲液组成和运行时间，可以改变DNA级分的流动性。可以改变条件，以使在预定长度上的DNA片段减慢从远离电泳移动到至少一个凝胶柱内。

附图说明

图1A显示了根据一些实施例的序列重复区域的扩增。

图1B显示了根据一些实施例的序列的***。

图1C显示了根据一些实施例的序列的反转。

图2A-2B显示了根据一些实施例的未扩增重复和单拷贝侧翼序列的长度。

图2C显示了根据一些实施例的扩增重复和单拷贝侧翼序列的长度。

图3显示了根据一些实施例的示例性流程图。

图4A-4C显示了根据一些实施例的单拷贝qPCR检测扩增子的位置。

图5A显示了根据一些实施例，用于DNA大小分离随后为电洗脱的SageELF盒。

图5B显示了根据一些实施例，从分离电泳到分级/电洗脱的示例性SageELF工作流。

图6显示了根据一些实施例的示例性SageHLS盒。

图7A-10B显示了根据各种实施例的示例性工作流。

图11A-11B显示了根据一些实施例，在SageHLS盒上的电泳条件。

图12显示了根据一些实施例的示例性示意图。

图13A-13B显示了根据一些实施例，在实例1中实现的结果的图。

具体实施方式

本文公开了用于表征重复扩增突变的程序，其组合了宽尺寸灵活性DNA印迹测定与通过PCR的检测。对于许多测定应用，工作流可以在小于一天内完成。

图1A显示了扩增105前的基因组DNA，其具有单拷贝序列A110、含有简单序列重复115的染色体区域和单拷贝序列B120。扩增105前的基因组DNA具有长度125。当扩增含有简单序列重复115的染色体区域时，可以产生疾病状况130。扩增的简单序列重复区域130在一侧被单拷贝序列A110'包围，而在另一侧被单拷贝序列B120'包围。扩增的A-B片段125'的长度长于A-B片段125的长度。

如附图中所示，‘>’表示简单的序列重复单元。例如，这可以是ALS基因C9orf72中的G₄C₂。在C9orf72中，与疾病表型相关的G₄C₂重复数目的阈值估计在30和70之间，尽管许多受影响的个体可以具有大到数万个碱基(数千个重复单位)的重复扩增。

图1B显示了根据一些实施例的序列的***。此处，***前的基因组DNA 135具有单拷贝序列A140、用于***事件的染色体靶位点145和单拷贝序列B150。A-B片段具有长度155。然后将序列***靶位点160处。在***后，单拷贝序列A140'位于***序列160的一侧上，且单拷贝序列B150'位于另一侧上。***后所得到的A-B片段155'的长度长于A-B片段155的长度。

图1C显示了根据一些实施例的序列的反转。如所示，基因组DNA165具有单拷贝序列A170和单拷贝序列B175。单拷贝序列A170可以配置在反转断点180的左端和反转断点185的右端之间。单拷贝序列B175可以配置在反转断点180、185之外。A-B片段可以具有长度190。反转断点180的左端和反转断点185的右端之间的区段可以被反转195。所得到的基因组DNA 165'可以具有这样配置的单拷贝序列A170'和单拷贝序列B175'，使得反转后的A-B片段190'的长度不同于A-B片段190的长度。在一些实施例中，例如图1C中所示的那种，反转后的A-B片段190'的长度可以长于反转前的A-B片段190的长度。在一些实施例中，反转后的A-B片段190'的长度可以短于反转前的A-B片段190的长度。

图2A显示了在切割之前具有特异性切割位点A 205和特异性切割位点B 210的基因组DNA 200。含有重复的染色体区域215配置在切割位点A205和切割位点B 210之间。显示了未扩增重复和单拷贝侧翼序列的长度220。在图2B中，基因组DNA 200已在切割位点A 205和切割位点B 210处被切割，使得切割区段具有长度220。图2C显示了具有扩增重复区域225的特异性切割位点A 205'和特异性切割位点B 210'。扩增的重复序列和单拷贝侧翼序列具有长度220’。

图3中显示了示例性实施例。可以提供样品305，并且可以从样品中分离HMW DNA310。可以在HMW DNA的重复区域的两侧上以单拷贝序列执行特异性切割315。切割的样品可以进行分级。在一些实施例中，使用凝胶电泳分级切割的样品。电泳大小选择可以使用有效地分辨携带未扩增重复的基因组片段与携带扩增重复的片段来执行320。可以从分离凝胶和/或凝胶泳道的连续/邻接区段中分离DNA 325。DNA级分可以经受PCR 330。PCR可以是关于侧接重复序列、在切除的重复区域内的单拷贝序列中扩增子的测定。可以确定来自洗脱级分内的位置对于重复扩增区域评分为阳性的洗脱级分中的DNA大小335，并且可以确定任何扩增子是否在大于正常重复大小范围的基因组片段中检测到340。

在一些实施例中，测定的基础是测量通过在重复扩增区域的两侧上的独特单拷贝DNA序列处的切割产生的DNA片段的长度(图1A，图2A-B)。源自未扩增重复的片段小于源自扩增重复的片段。通过凝胶电泳对切割的样品进行大小分级，并且从分离凝胶的连续切片中分离DNA，包括由样品DNA占据的所有凝胶区域。使纯化的DNA级分经受PCR测定，所述PCR测定设计为检测含有重复扩增序列的特异性释放片段内的单拷贝序列(图4A-4C)。

如图4A中所示，显示了具有特异性切割位点A 405和特异性切割位点B 410的基因组DNA 400。含有重复序列的染色体区域140配置在特异性切割位点A 405和特异性切割位点B 410之间。图4B显示了在特异性切割位点A 405和特异性切割位点B 410处的切割。在特异性切割位点A 405和含有重复的染色体区域415之间是单拷贝qPCR检测扩增子420的位置。图4C显示了特异性切割位点A 405'和特异性切割位点B 410'之间的扩增重复区域425。显示了单拷贝qPCR检测扩增子420'的位置。

在公开内容自始至终讨论的切割(包括侧翼单拷贝序列(图2A-2C))可以通过限制性酶来实现，条件是它们不在含有重复的片段内的其它地方切割。这些切割也可以用可定制的RNA或DNA指导的切割酶如Cas9、Cpf1或NgAgo来完成。

在一些实施例中，消化的基因组DNA片段在图5A、图5B(也在美国专利号9,599,590(其以引用的方式并入本文)中描述)、或图6(也在PCT申请号PCT/US2015/055833(其以引用的方式并入本文)中描述)中所示的电泳盒中进行大小分离且电洗脱。在大小分级后，将分离凝胶的整个DNA含量横向电洗脱到布置在分离凝胶柱一侧上的邻接系列的洗脱模块内。将分级的DNA电洗脱到洗脱模块中的液体电泳缓冲液内，并且可以直接加入PCR反应中，且测定切除的重复扩增片段内的单拷贝序列靶。由于每个洗脱级分中的DNA大小由电泳条件(例如凝胶百分比、缓冲液、运行时间、电压)确定，因此洗脱级分内阳性PCR信号的位置可以与检测到的重复区域等位基因的大小直接相关。

在一些实施例中，PCT/US2015/055833中描述的仪器、方法和系统用于完成所有PCR前步骤。示例性工作流在图7A-10B中以示意形式示出。如PCT申请号PCT/US2015/055833中所述，可以在一个集成的工作流中提取且消化高分子量基因组DNA，伴随最低限度的用户干预。产生可检测的重复扩增片段的特异性切割可以用DNA限制性酶如传统的DNA限制性酶(图7A-7E和图8A-8B)、或RNA指导的切割酶如化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(图9A-9E和图10A-10B)完成。可以使用输入材料，例如纯化的白血细胞、未分级的全血、以及从解离的组织样品获得的细胞悬浮液(或核)。

如图1B和图1C中所示，本文公开的系统和方法也可用于检测***和反转重排。在两种情况下，重排均改变了侧接重排的一个断裂点(即***点，图1B，或反转的一个断裂点，图1C)的独特切割位点之间的距离。

如引言中所述，在一些重复扩增疾病中，扩增可以相当长且高度可变。为了解决这个问题，可以修改电泳条件(包括例如凝胶浓度、电压、电压波形、缓冲液组成、运行时间)，使得大于一定长度的所有DNA分子都作为限制性低迁移率级分一起迁移。这发生在由长度引起的电泳迁移率中的增加(即，来自磷酸盐主链的电荷增加)被由较大分子的阻力增加引起的电泳迁移率中的降低所抵消时。在该限制性低迁移率点处的分子大小是凝胶百分比、电压和缓冲液组成的复合函数。然而，对于给定的缓冲液和凝胶浓度，关于DNA的限制性低迁移率可以在琼脂糖凝胶中在1000bp直到多个10,000bp的范围内进行调节。图11A-11B显示了在SageHLS盒上的电泳条件(如在PCT/US2015/055833中所述)，其中可以在洗脱模块编号2中洗脱以10,000bp开始的限制性低迁移率条带。

在一些实施例中，可以修改关于特定重复扩增基因座的电泳条件，使得未扩增的重复片段在凝胶柱的底部附近洗脱，适度扩增的重复片段在洗脱级分的中间范围内在未扩增级分之上的级分中分辨，并且具有极大扩增的片段在凝胶柱的顶部附近的限制性低迁移率压缩带中洗脱(图8A-8B和图10A-10B)。

实例1.用于特定染色体基因座的集成提取、Cas9消化、电洗脱和qPCR测定的SageHLS工作流的示范

该实例示出了使用SageHLS从输入细胞样品中纯化高分子量基因组DNA，使用Cas9切割酶从BRCA1基因座处选择性地切除特定的198kb基因组DNA片段，并且最后，在一个集成的工作流中大小选择且洗脱含有BRCA1的片段。然后通过pPCR测定HLS洗脱级分的BRCA1片段。

缓冲液定义：

电泳缓冲液，也称为0.5xKBB(51mM Tris(碱)、29mM TAPS(酸)、0.1mM EDTA(酸)，pH 8.7)

FSE缓冲液：15％w/v Ficoll 400，0.25xKBB缓冲液，80mg/mL蔗糖，10mM EDTA

ERB缓冲液：0.5xKBB，伴随32mg/mlβ-环糊精、10mM MgCl₂、50μg/ml BSA的加入

HLS裂解缓冲液：1xKBB，2％甘油，3％SDS，2.5μg/ml溴酚蓝，2.5μg/ml酚红

通过低速离心将人培养细胞(Raji细胞系)洗涤数次，并且重悬浮于磷酸盐缓冲盐水中。最后一次洗涤后，将细胞以每70微升1.5X10⁶个细胞的浓度重悬浮于FSE缓冲液中。在FSE中重悬浮的细胞的两个70微升样品装载到SageHLS盒(0.75％琼脂糖)的两个样品孔中的每一个内。将两个泳道的试剂孔倒空，并且用HLS裂解缓冲液(大约230微升)重新填充，并且在30℃、55V下进行电泳1小时。

在纯化电泳后，倒空样品孔和试剂孔。用ERB缓冲液(不含酶)重新填充试剂孔。在两个泳道之一中，样品孔用80ul含有1微摩尔wt化脓性链球菌Cas9酶(New EnglandBiolabs)的ERB重新填充，所述酶已用5个两部分指导RNA的等摩尔混合物组装，各自为5微摩尔浓度。在另一个泳道中，不含酶的ERB作为模拟消化对照装载到样品孔中。将HLS器械的样品孔加热器调节至37℃，并且将Cas9混合物在55V下电泳移动到凝胶内1分钟。在1分钟电泳后，将样品孔倒空并且用不含酶的ERB缓冲液重新填充。将盒在没有电泳的情况下温育30分钟，其中样品孔在37℃下温育，以允许纯化DNA的Cas9消化。

在消化后，将试剂孔倒空并且用HLS裂解缓冲液重新填充，并且使用设计为将200kb BRCA1消化产物移至洗脱模块3的4小时脉冲场程序进行大小分离电泳(HLS-CATCH的阶段3程序100-400kb，SageHLS用户手册，Sage Science，Inc.)。在大小分离后，使用50V的连续场电压进行电洗脱1.5小时。

从IDT订购两部分指导RNA(ALT-R^TMcrRNA和tracRNA)。选择gRNA以切除198kb片段，其包括整个BRCA1基因座，在5'和3'侧上具有充足的侧翼序列(参见图12)。设计了用于基因的右侧的三种crRNA--BRCA1gR67:GCTTATTACATTCTCGGCCA；BRCA1gR68:CTTATTACATTCTCGGCCAT；以及BRCA1gR69:ATTACATTCTCGGCCATGGG。设计了用于用于基因的左侧的两种crRNA--BRCA1gLL1:CCTCTGGGAGCCACAGGCCA；以及BRCA1gLL3:GCCATGACAACAACCCAGAC(图12)。将crRNA和tracRNA(IDT)溶解于IDT双重缓冲液中，并且通过将含有50微摩尔tracRNA和各10微摩尔的5种crRNA(crRNA中总共50微摩尔)的混合物在95℃下温育5分钟，且在环境实验室温度下在台面上冷却15分钟进行退火。在加入HLS盒之前，通过将最终反应混合物在ERB缓冲液(参见上文)中组装，且将混合物在37℃下温育10分钟，组装退火的gRNA和Cas9酶。

在洗脱后，将洗脱的产物在10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0中1:10稀释，并且通过Taqman qPCR测定BRCA1基因DNA，使用RNaseP RNA基因作为关于非靶DNA的参考基因座。(ABI/Life Technologies部件编号：#4400291-BRCA1拷贝数测定(Hs00300666-cn扩增子，小)；#4403326-RNaseP拷贝数参考测定；#4371355-Taqman GT Master Mix；qPCR器械；ABIQuantStudio 3)。图13A-13B中的结果显示了在Cas9消化的盒泳道的级分3中回收了BRCA1片段的1.5x10⁶个拷贝的回收，但仅在模拟消化的盒泳道中可见背景信号。

实例2.可用于检测高分子结构变体的凝胶压缩的示范。

将DNA标记物(1kb延伸标记物，New England Biolabs)的样品装载到SageHLS盒的两个泳道的样品孔内。将DNA分离且使用下述电泳条件电洗脱：0.75％琼脂糖，50mM Tris，29mM TAPS，0.1mM EDTA，pH 8.7，55V连续场(DC)，50分钟，凝胶温度30℃。在分析琼脂糖平板凝胶上分析来自所有洗脱孔的电洗脱级分(图11A-11B)。在HLS分离运行中的电泳迁移率压缩的证据在级分#2中可见(即，片段10-48.5kb共迁移且在级分#2中一起发现，并且在级分#1中没有发现DNA)。因此，由于压缩现象，在这些条件下，在级分#2中将发现大于10kb的所有DNA。级分#5和#6含有范围为1-2kb的片段。

参考文献

La Spada A.R.和Taylor,J.P.,Repeat expansion disease:progress andpuzzles in disease pathogenesis.Nature Reviews Genetics 11:247-258.

Nolin S.L.等人，Expansion of the Fragile X CGG Repeat in Females withPremutation or Intermediate Alleles.Am.J.Hum.Genet.72:454–464,2003.

6-50个未受影响的18-150bp

60-200个“预突变”180-600bp

完全突变>200>600bp

Suh,E.R.等人，Semi-automated quantification of C9orf72 expansion sizereveals inverse correlation between hexanucleotide repeat number and diseaseduration in frontotemporal degeneration.Acta Neuropathol 130(3):363–372,2015.

未受影响的2-8(12-48bp)受影响的300-3800(1800-22800bp)

对本专利申请中呈现的出版物或其它文件(包括但不限于专利、专利申请、论文、网页、书籍等)的任何和所有引用都以引用的方式整体并入本文。

本文已经描述了设备、系统和方法的示例性实施例。如其它地方注明的，这些实施例仅用于说明性目的描述而不是限制性的。其它实施例是可能的并且由本公开涵盖，这将从本文包含的教导中显而易见。因此，本公开的广度和范围不应受任何上述实施例的限制，而应仅根据本公开所支持的权利要求及其等同物来限定。此外，本公开内容的实施例可以包括方法、系统和装置，其还可以包括来自任何其它公开的方法、系统和装置的任何和所有元件，包括对应于分子处理的任何和所有元件。换言之，来自一个或另一个所公开实施例的元件可以与来自其它公开实施例的元件互换。另外，可以去除所公开的实施例的一个或多个特征/元件，并且仍导致可申请专利的主题(并且因此，导致本主题公开内容的更多实施例)。相应地，通过具体地缺乏此类现有技术中公开的系统、装置和/或方法的一个或多个元件/特征，本公开内容的一些实施例可以与一个和/或另一个参考/现有技术在专利上不同。换言之，对某些实施例的权利要求可以包含否定限制，以具体地排除一个或多个元件/特征，导致与包括此类特征/元件的现有技术在专利上不同的实施例。