阅读说明：本技术 一种运载亚铁离子的荧光纳米粒子的制备方法及其在制备纳米亚铁离子复合物中的应用 (It is a kind of deliver ferrous ion fluorescent nano particles preparation method and its preparation nanometer ferrous ion compound in application ) 是由 谭明乾 王南鹰 丛爽 崔国馨 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种运载亚铁离子的荧光纳米粒子的制备方法,包括以下步骤：使用乙醇对烤牛肉进行超声浸提,得粗提物溶液；采用有机溶剂对所述粗提物溶液萃取脱脂,收集水相；使用G25葡聚糖凝胶柱对所述水相进行纯化,收集365nm激发下产生荧光的洗脱液,旋蒸得浓缩液；使用ODS-BP色谱柱纯化所述浓缩液,收集荧光部分,冻干获得荧光纳米粒子。本发明制备的荧光纳米粒子能够与铁结合,将所述荧光纳米粒子与亚铁离子在醋酸钠缓冲溶液混合,30～90℃加热30min,取分子量大于3000Da的溶液冻干,得纳米亚铁离子载体复合物。本发明取材容易价格低廉,容易制取,所述纳米亚铁离子载体复合物稳定性高,具有可示踪性,跨膜性。(The invention discloses a kind of preparation methods of fluorescent nano particles for delivering ferrous ion, comprising the following steps: carries out ultrasonic extraction to roast beef using ethyl alcohol, obtains crude extract solution；Degreasing is extracted to the crude extract solution using organic solvent, collects water phase；The water phase is purified using G25 sephadex column, the lower eluent for generating fluorescence of 365nm excitation is collected, rotates to obtain concentrate；Using concentrate described in ODS-BP chromatography, fluorescence part is collected, freeze-drying obtains fluorescent nano particles.Fluorescent nano particles prepared by the present invention can mix the fluorescent nano particles with ferrous ion in conjunction with iron in sodium acetate buffer, 30~90 DEG C of heating 30min, take solution of the molecular weight greater than 3000Da to be lyophilized, obtain a nanometer ferrous ion carrier complexes.Present invention materials are easy cheap, are easy to produce, and the nanometer ferrous ion carrier complexes stability is high, have traceable property, cross-film.)

一种运载亚铁离子的荧光纳米粒子的制备方法及其在制备纳 米亚铁离子复合物中的应用

技术领域

本发明涉及碳纳米材料的制备方法，尤其涉及一种运载亚铁离子的荧光纳米粒子的制备方法及其在制备纳米亚铁离子复合物中的应用。

背景技术

铁是一种重要的矿物元素，无论从数量上还是重要性上来讲也是最重要的微量元素之一，并且对机体的功能活动起着重要的调节作用。缺铁是人类最普遍的微量营养素缺乏症，影响了10％～20％的世界人口。在大多数情况下，妇女在怀孕期间容易患缺铁性贫血，导致胎儿生长缓慢；长期缺铁可导致脑神经系统发育异常，对免疫系统有长期影响；严重缺铁也可导致***生长缓慢。通常解决此问题的理想方法是在饮食中加入多种富含铁的食物，并增加饮食中的铁吸收。

常见的铁补充剂分为三类：无机铁：如硫酸亚铁，尽管铁盐含铁量高，但容易与硫化物、多酚等化合，造成食物变色、变质、脂质氧化、具有金属气味，对胃肠有严重的刺激作用。长期食用会引起恶心、呕吐、腹泻，尤其是不容易被身体完全吸收。有机铁：如葡萄糖酸亚铁，虽然有机铁剂在生物利用率方面优于无机铁剂，且相对温和、副作用小，但这类铁剂大多为亚铁盐，稳定性较差，价格也比较昂贵。多肽铁：如海参卵肽铁，但由于生产步骤多，提取纯化步骤繁琐，难以广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供运载亚铁离子的荧光纳米粒子的制备方法，简化传统制备方式，降低生产成本、实现过程简单、可控。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种运载亚铁离子的荧光纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1、取烤牛肉，浸泡于乙醇中，40～80Hz超声10～60min，抽滤取溶液，40～70℃旋转蒸发至所述溶液体积的1/8～1/10，去除乙醇，得粗提物溶液；

S2、使用有机溶剂，对步骤S1所述粗提物溶液萃取脱脂，收集水相；其中，所述有机溶剂为氯仿或乙酸乙酯中的一种或两种；

S3、使用G25葡聚糖凝胶柱层析对步骤S2所述水相进行纯化，所述水相的上样量和柱体积比为1:4mL/cm³，用100～250倍柱体积的去离子水洗脱，收集365nm激发下产生蓝色荧光的部分的洗脱液，40～70℃旋转蒸发浓缩至所述洗脱液原体积的1/8～1/10，得纳米粒子浓缩液；

S4、使用半制备ODS-BP色谱纯化步骤S3所述纳米粒子浓缩液，ODS-BP填料粒径为10μm，色谱柱内径为20mm，长度为300mm，流动相为体积分数5％～20％的甲醇水溶液，所述纳米粒子浓缩液的上样量为5～15mL，流速为16～20mL/min，洗脱时间为30～120min；检测器为荧光检测器，荧光光谱激发波长为320nm，发射波长为398nm，收集具有荧光的洗脱液，得到高纯度荧光纳米粒子水溶液，40～70℃旋转蒸发至所述荧光纳米粒子水溶液原体积的1/8～1/10，冷冻干燥，得到的粉末状物质即为运载亚铁离子的荧光纳米粒子。

优选方式下，步骤S1所述烤牛肉的制备方法为：取牛肉，绞碎成肉馅，置于200～280℃烤制10～50min，得烤牛肉；所述旋转蒸发的转速为70rpm～90rpm；所述烤牛肉和乙醇的重量体积比为1:2g/ml。

优选方式下，步骤S2所述萃取脱脂具体为：取步骤S1所述粗提物溶液，加入其3倍体积的有机溶剂，震荡混匀，静置直至分层，除去有机溶剂，取水相；萃取3～5次直至有机溶剂颜色为澄清透明；所述有机溶剂为氯仿或乙酸乙酯中的一种或两种。

优选方式下，步骤S3所述G25葡聚糖凝胶柱和蠕动泵相连，所述蠕动泵的转速是40～180rpm。

优选方式下，步骤S4所述冷冻干燥具体为：-50～50℃，真空度为1～50Pa，干燥10～72h。

本发明的另一个目的是提供所述运载亚铁粒子的荧光纳米粒子的应用，用于制备纳米亚铁离子复合物；一种纳米亚铁离子复合物的制备方法，包括步骤：取所述运载亚铁离子的荧光纳米粒子与亚铁离子混合，加入pH5、50mM醋酸钠缓冲溶液使其溶解，得混合液；所述混合液中运载亚铁离子的荧光纳米粒子的终浓度为2～10mg/mL，亚铁离子的终浓度为1～5mM；将所述混合液置于30～90℃加热30min，使用3000Da超滤离心管进行超滤离心，收集分子量大于3000Da的溶液，将其冷冻干燥，得到的粉末状物质，即为纳米亚铁离子复合物。

优选方式下，所述亚铁离子为氯化亚铁；所述冷冻干燥具体为：-50～50℃，真空度为1～50Pa，干燥10～72h；所述超滤离心的参数为：4℃、8000rpm、10min。

一种纳米亚铁离子复合物的制备方法，包括步骤：

S1、取牛肉，绞碎成肉馅，置于260℃烤制30min，得烤牛肉；取所述烤牛肉500g，浸泡于1L的乙醇中，70Hz超声30min，抽滤取溶液，65℃、80rpm旋转蒸发至100mL，去除乙醇，得粗提物溶液；

S2、取步骤S1所述粗提物溶液，加入其3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，然后静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相A；取下层水相A加入其3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相B；取下层水相B加入其3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相C；

S3、使用G25葡聚糖凝胶柱层析对步骤S2所述水相C进行纯化，所述水相的上样量和柱体积比为1:4mL/cm³，用200倍柱体积的去离子水洗脱(洗脱时所述G25葡聚糖凝胶柱和蠕动泵相连，所述蠕动泵的转速是180rpm)，收集使用365nm激发下产生蓝色荧光的部分的洗脱液，65℃、80rpm旋转蒸发浓缩至所述洗脱液原体积的1/10，得纳米粒子浓缩液；

S4、使用ODS-BP色谱柱纯化步骤S3所述纳米粒子浓缩液，ODS-BP填料粒径为10μm，色谱柱内径为20mm，长度为300mm，流动相为体积分数10％(v/v)的甲醇水溶液，所述纳米粒子浓缩液的上样量为10mL，流速为20mL/min，洗脱时间为60min；检测器为荧光检测器，荧光光谱激发波长为320nm，发射波长为398nm，收集具有荧光的洗脱液，得到高纯度荧光纳米粒子水溶液，65℃、80rpm旋转蒸发至所述荧光纳米粒子水溶液原体积的1/10，-20℃、真空度为10Pa、冷冻干燥48h，得到的粉末状物质即为运载亚铁离子的荧光纳米粒子；

S5、取步骤S4所述运载亚铁离子的荧光纳米粒子500mg与0.025g氯化亚铁混合，加入50ml、pH5、50mM醋酸钠缓冲溶液使其溶解，得混合液；将所述混合液置于50℃加热30min，使用3000Da超滤离心管4℃、8000rpm超滤离心10min，收集分子量大于3000Da的溶液，-20℃、真空度为10Pa、冷冻干燥48h，得到的粉末状物质，即为纳米亚铁离子复合物。

本发明的有益效果是：

本发明所述纳米亚铁离子复合物的制备方法，获得的纳米亚铁离子复合物制取价格低廉，具有超小尺寸、高水溶性，高化学稳定性，表面含有多种官能团的特点，将其与细胞共同培养可以进入细胞。荧光纳米粒子与亚铁离子以共价键方式结合，牢固而稳定，显示出了独特的优势，可用作一种新型的补铁剂。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的纳米亚铁离子复合物的TEM图。

图2是本发明实施例1制备的纳米亚铁离子复合物的荧光光谱图。

图3是本发明实施例1制备的纳米亚铁离子复合物的荧光寿命图。

图4是本发明实施例1制备的纳米亚铁离子复合物在488nm激发下细胞成像图。

图5是本发明实施例1制备的纳米亚铁离子复合物在405nm激发下细胞成像图。

图6是本发明实施例2制备的烤牛肉中运载亚铁离子的荧光纳米粒子的TEM图。

图7是本发明实施例2制备的烤牛肉中运载亚铁离子的荧光纳米粒子的粒径分布图。

图8是本发明实施例2制备的烤牛肉中运载亚铁离子的荧光纳米粒子的荧光光谱图。

图9是本发明实施例2制备的烤牛肉中运载亚铁离子的荧光纳米粒子的荧光寿命图。

图10是本发明实施例3荧光纳米粒子金属离子稳定性图。

图11是本发明实施例3荧光纳米粒子不同浓度盐离子稳定性图。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种烤牛肉饼中纳米亚铁离子载体的制备方法，简化传统制备方式，降低生产成本、实现过程简单、可控。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种烤牛肉饼中纳米亚铁离子载体的制备方法，包括以下步骤：

A、以牛肉为原材料，将牛肉制成牛肉馅，然后做成牛肉饼烤制,将经过烤制的牛肉饼浸泡于无水乙醇中超声15–45min，抽滤去除悬浮沉淀，收集液相，旋转蒸发除乙醇，得到粗提物。

B、向粗提物中加入水复溶，再加入有机溶剂萃取脱脂，反复萃取直至水相溶液澄清透明，收集水相；

C、将B中水相溶液过G25葡聚糖凝胶柱层析，收集荧光强度较大的部分，旋转蒸发浓缩得到较高纯度的荧光纳米粒子水溶液；

D、通过半制备色谱纯化步骤C中的水溶液，收集荧光强度较大的部分，得到高纯度荧光纳米粒子水溶液，再次旋转蒸发后，进行冻干得到的粉末状物质即为运载亚铁离子的荧光纳米粒子；

E、将荧光纳米粒子粉末与亚铁离子混合,加入pH 5,50mM醋酸钠缓冲溶液使其溶解，放入30–90℃恒温水浴30min，之后放入3000Da超滤离心管中，4℃8000rpm离心10分钟，收集分子量大于3000Da的物质，将其冻干得到的粉末状物质，即为纳米亚铁离子载体复合物。

所述步骤A中所用牛肉为牛颈肉或牛胸肉或牛腩或牛腰肉或牛里脊肉或牛腱肉。

所述步骤A中烤制温度为200–280℃，烤制时间为10–50min，烤牛肉饼与乙醇的质量体积比为1：2，旋转蒸发除去乙醇的条件为温度为60℃–70℃，转速为70rpm–90rpm。

所述步骤B中有机溶剂为正己烷、氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或几种，粗提物水溶液与有机溶剂的体积比为1:3，旋转蒸发除去有机溶剂的条件为温度为60℃–70℃，转速为70rpm–90rpm。

所述步骤C中蠕动泵流速为40–180rpm。

所述步骤D中半制备色谱洗脱过程中，采用水与甲醇洗脱，水与甲醇比例为9:1，流速为20mL/min。

所述步骤E中亚铁离子优选氯化亚铁，溶液中纳米粒子和亚铁浓度分别为2–10mg/mL和1–5mM，冻干时间为96h–120h。

从烤制食品中提取的荧光纳米粒子价格低廉，具有超小尺寸、高水溶性，高化学稳定性，表面含有多种官能团的特点，将其与细胞共同培养可以进入细胞。荧光纳米粒子与亚铁离子以共价键方式结合，牢固而稳定，分子量远比多肽小,显示出了独特的优势。

以下结合实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一种纳米亚铁离子复合物的制备方法，包括步骤：

S1、取牛肉，绞碎成肉馅，置于260℃烤制30min，得烤牛肉；取所述烤牛肉500g，浸泡于1L的乙醇中，70Hz超声30min，抽滤取溶液，65℃、80rpm旋转蒸发至100mL，去除乙醇，得粗提物溶液；

S2、取步骤S1所述粗提物溶液，加入其3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，然后静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相A；取下层水相A加入其3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相B；取下层水相B加入其3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相C；

S3、使用G25葡聚糖凝胶柱层析对步骤S2所述水相C进行纯化，上样量和柱体积比为1:4mL/cm³，用200倍柱体积的去离子水洗脱(洗脱时所述G25葡聚糖凝胶柱和蠕动泵相连，所述蠕动泵的转速是180rpm)，收集使用365nm激发下产生蓝色荧光的部分的洗脱液，65℃、80rpm旋转蒸发浓缩至所述洗脱液原体积的1/10，得纳米粒子浓缩液；

S4、使用ODS-BP色谱柱纯化步骤S3所述纳米粒子浓缩液，ODS-BP填料粒径为10μm，色谱柱内径为20mm，长度为300mm，流动相为体积分数10％(v/v)的甲醇水溶液，所述纳米粒子浓缩液的上样量为10mL，流速为20mL/min，洗脱时间为60min；检测器为荧光检测器，荧光光谱激发波长为320nm，发射波长为398nm，收集具有荧光的洗脱液，得到高纯度荧光纳米粒子水溶液，65℃、80rpm旋转蒸发至所述荧光纳米粒子水溶液原体积的1/10，-20℃、真空度为10Pa、冷冻干燥48h，得到的粉末状物质即为运载亚铁离子的荧光纳米粒子；

S5、取步骤S4所述运载亚铁离子的荧光纳米粒子500mg与0.025g氯化亚铁混合，加入50ml、pH5、50mM醋酸钠缓冲溶液使其溶解，得混合液；将所述混合液置于50℃加热30min，使用3000Da超滤离心管4℃、8000rpm超滤离心10min，收集分子量大于3000Da的溶液，-20℃、真空度为10Pa、冷冻干燥48h，得到的粉末状物质，即为纳米亚铁离子复合物。

用比色法测定本实施例步骤S4所述荧光纳米粒子的铁结合能力。取10mg荧光纳米粒子溶于1mL 0.05M pH5.0醋酸钠缓冲溶液，空白组添加1mL 0.05M pH5.0醋酸钠缓冲溶液，置于50℃的水浴中静置孵育5min，然后加入20μL，2mM的FeCl₂，进行结合反应。在50℃下静置反应30分钟；添加20μL，5mM菲咯嗪停止反应，使用96孔板测量562nm处的溶液吸光度。根据公式[(A₀-A_S)/A₀]×100％计算结合率，其中A₀为空白组的吸光度值，A_S为样品的吸光度值，测定结果荧光纳米粒子和铁的结合率为35.11％。

如图1所示，通过透射电镜(TEM)观察到，纳米亚铁离子复合物聚集形成均匀的纳米团簇单元；如图2所示，纳米亚铁离子复合物的最大荧光激发波长和发射波长为330nm和418nm；如图3纳米亚铁离子复合物在室温下溶于水溶液中的荧光寿命为5.70ns。

取本实施例制备的纳米亚铁离子复合物进行细胞实验，人源Caco-2细胞系购自中国科学院上海生物研究所，在37℃、5％CO₂培养箱中，使用体积分数20％胎牛血清和1％青霉素链霉素的MEM培养基中培养Caco-2细胞12小时。采用SP8共聚焦激光荧光显微镜(德国威茨拉尔莱卡)对吖啶橙染色活Caco-2细胞中纳米亚铁离子复合物的体外生物分布进行了研究。结果如图4、5，表明纳米亚铁离子复合物可以进入Caco-2细胞中。

实施例2：

一种运载亚铁离子的荧光纳米粒子的制备方法，包括步骤：

S1、取牛肉，绞碎成肉馅，置于260℃烤制45min，得烤牛肉；取所述烤牛肉500g，浸泡于1L的乙醇中，70Hz超声30min，抽滤取溶液，65℃、80rpm旋转蒸发至100mL，去除乙醇，得粗提物溶液；

S2、取步骤S1所述粗提物溶液，加入其3倍体积的氯仿，震荡混匀，然后静置直至分层，除去下层氯仿，取上层水相A，再加入3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，然后静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相B，加入3倍体积的乙酸乙酯，震荡混匀，然后静置直至分层，除去上层乙酸乙酯，取下层水相C；

S3、使用G25葡聚糖凝胶柱层析对步骤S2所述水相C进行纯化，上样量和柱体积比为1:4mL/cm³，用200倍柱体积的去离子水洗脱(洗脱时所述G25葡聚糖凝胶柱和蠕动泵相连，所述蠕动泵的转速是180rpm)，收集使用365nm激发下产生蓝色荧光的部分的洗脱液，65℃、80rpm旋转蒸发浓缩至所述洗脱液原体积的1/10，得纳米粒子浓缩液；

S4、使用ODS-BP色谱柱纯化步骤S3所述纳米粒子浓缩液，ODS-BP填料粒径为10μm，色谱柱内径为20mm，长度为300mm，流动相为体积分数10％(v/v)的甲醇水溶液，所述纳米粒子浓缩液的上样量为10mL，流速为20mL/min，洗脱时间为45min；检测器为荧光检测器，荧光光谱激发波长为330nm，发射波长为396nm，收集具有荧光的洗脱液，得到高纯度荧光纳米粒子水溶液，65℃、80rpm旋转蒸发至所述荧光纳米粒子水溶液原体积的1/10，-20℃、真空度为5Pa、冻干冷冻干燥48h，得到的粉末状物质即为运载亚铁离子的荧光纳米粒子。

如图6所示，通过透射电镜(TEM)观察到，烤牛肉饼中所提取的荧光纳米粒子，显示球形颗粒，粒径均匀，单分散性好，无明显团聚；如图7所示基于100个颗粒的统计分析，大部分在1.0～5.0nm范围内，平均尺寸约为3.0nm；如图8所示，纳米粒子的最大荧光激发波长和发射波长为330nm和400nm；如图9纳米粒子在室温下溶于水溶液中的荧光寿命为6.55ns。

实施例3：

荧光纳米粒子的稳定性研究

一、测定不同金属离子对荧光强度的影响

按下述方法，分别配制不同金属离子溶液，使终浓度均为1000μmol/L：称取金属化合物固体样品于烧杯中，加水溶解，定容至50mL，获得终浓度均为1000μmol/L的金属离子溶液；其中，所需金属化合物固体重量分别为：ZnSO₄·7H₂O，14.378mg；CaCl₂·2H₂O，7.35mg；MnSO₄·4H₂O，8.45mg；Co(NO₃)·6H₂O，14.55mg；FeCl₂·6H₂O，9.95mg；CuCl₂·2H₂O,8.524mg；MgCl₂·6H₂O，10.165mg；FeCl₃·6H₂O，13.5mg；NiCl₂·6H₂O，11.88mg。

使用实施例1中步骤S4所述的荧光纳米粒子，配制浓度为1mg/mL的荧光钠米粒子水溶液：取1mL所述金属离子溶液，800μL去离子水，200μL荧光纳米粒子水溶液充分混合，使终体积为2mL，使用荧光光谱仪测量在最大激发波长下的荧光强度，每个金属离子测量三次平行，并设置1mg/ml荧光纳米粒子水溶液为空白对照；结果如图10所示，Fe³⁺、Cu²⁺金属离子水溶液能使荧光纳米粒子荧光猝灭，然而其他金属离子对其荧光强度没有明显影响

二、测定不同盐浓度对荧光强度的影响

配制不同浓度的NaCl盐溶液(1～10mg/ml),每个梯度间隔为1；使用实施例1中步骤S4所述的荧光纳米粒子配制浓度为1mg/ml荧光纳米粒子水溶液，取200μL荧光纳米粒子加到不同浓度的盐溶液中，充分混合，使终体积为2ml，使用荧光光谱仪测量在最大激发波长下的荧光强度，每个浓度测量三组平行，并设置1mg/ml荧光纳米粒子水溶液为空白对照组，结果如图11所示，不同NaCl浓度不会对其荧光强度产生较强的影响。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。