一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法
阅读说明：本技术 一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法 (A kind of preparation method of long acting antibiotic promoting healing keratin dressing ) 是由 汤佳鹏 葛彦 刘希文 朱俐 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法,包括(1)将一定量再生人发角蛋白完全溶解于98v/v％甲酸溶液,搅拌均匀,角蛋白溶液；(2)采用冷冻干燥,得到角蛋白冻干海绵；(3)将角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化；(4)将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在重组人表皮生长因子hEGF、二硫苏糖醇和N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的溶液中进行负压闪爆,之后进行接枝反应；(5)将完成接枝反应的角蛋白海绵离心冻干。本发明制备的角蛋白海绵是一种能够诱导皮肤组织损伤部的再生的医疗用材料,能够抑制伤口微生物的生长,刺激皮肤成纤维细胞的增殖,促进伤口愈合。(The invention discloses a kind of preparation methods of long acting antibiotic promoting healing keratin dressing, including (1), and a certain amount of regeneration human hair keratin is dissolved completely in 98v/v% formic acid solution, stirs evenly, keratin solution；(2) using freeze-drying, keratin freeze-drying sponge is obtained；(3) by the plasma treated device processing activation of keratin freeze-drying sponge；(4) the keratin freeze-drying sponge of activation processing is immersed in recombinant human epidermal growth factor hEGF, dithiothreitol (DTT) and N, progress negative pressure is dodged quick-fried in N- bis- (decyl Propylamino)-sulfydryl glycine solution, carries out graft reaction later；(5) the keratin sponge centrifugation freeze-drying of graft reaction will be completed.Keratin sponge prepared by the present invention is a kind of regenerated medical material for capableing of induced skin tissue damage portion, is able to suppress the growth of wound microbes, stimulates the proliferation of skin fibroblasts, promotes wound healing.)
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法。
背景技术
在临床上，由于伤口表面是一个温暖而潮湿的环境，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等病原体在伤口上快速繁殖，造成伤口易感染且不易愈合。为了遏制微生物繁殖，控制伤口感染，大量医用敷料被广泛应用于伤口覆盖保护，并在医用敷料使用的同时考虑加入抗生素或其他抗菌剂，以协助控制止血、保护伤口、减少感染、吸收分泌物、保持体温和促进伤口愈合。
在新型抗菌剂中，载银抗菌敷料因其优良的抗菌性和无耐药性，在医用敷料中的应用已被广泛重视，如应用于烧烫伤外科、创伤外科、多种疾病引起的皮肤溃疡，特别是用于久治不愈的褥疮或其他慢性感染创面。但是纳米银对人体和环境存在一定的危险性。有研究报道纳米银对动物生殖系统有较大影响。因此，需要一种新型的医用敷料，能够持久抗菌，且具有生物相容性和生态相容性。
角蛋白具有可生物降解、生物活性高和相容性好的优势，从人发中提取的角蛋白还具有低免疫排异性。相对于其他本体材料，角蛋白来源几乎不受限制，因而在化妆品领域的研究应用受到越来越多的重视。近年来，人发角蛋白以凝胶、海绵支架、涂层、膜以及复合材料的形式应用于神经材料、皮肤敷料、细胞培养、药物载体以及软组织修复等方面，显示出其在再生医学领域的发展潜力。角蛋白是各种类型上皮细胞的主要结构蛋白，对伤口愈合有重要作用。因此，将再生人发角蛋白用于面膜的基质能够大大减弱其致敏性，生物相容性更佳。但是由于角蛋白的疏水、耐酸、耐碱特性，对其进行化学加工不易，因此分子间作用力较弱，角蛋白材料较松散，机械强度不高、弹性差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法，本发明提供的方法制备得到的角蛋白敷料能够抑制微生物生长，修复皮肤细胞。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法，包括如下步骤：
S1：将再生人发角蛋白完全溶解于98v/v％甲酸溶液，搅拌均匀，得到角蛋白溶液；
S2：将所述角蛋白溶液冷冻干燥，得到角蛋白冻干海绵；
S3：将所述角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，得活化角蛋白冻干海绵；
S4：将所述活化角蛋白冻干海绵浸泡在含有重组人表皮生长因子、二硫苏糖醇和N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的混合溶液中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干得长效抗菌促愈合角蛋白敷料。
优选的，步骤S1中，所述角蛋白溶液中再生人发角蛋白的浓度为10～30g/L。
优选的，步骤S2中，冷冻干燥的温度为-30～-20℃，真空度为0.100～0.024mBar，冻干时间为3～5d。
优选的，步骤S3中，所述等离子处理器处理的条件为：气体采用氮气或氧气，处理功率为250～300W，压强50～60Pa，处理时间为10～15min。
优选的，步骤S4中，所述混合溶液中重组人表皮生长因子的浓度为40～80mg/L，二硫苏糖醇的浓度为4～8g/L，N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的浓度为5～10g/L。
优选的，步骤S4中，所述负压闪爆的真空度为0.100～0.024mBar。
优选的，步骤S4中，所述接枝反应的浸泡浴比为1:100～300，反应温度为0～4℃，反应时间为12～24h。
优选的，步骤S5中，所述离心的重力加速度为10000g，时间为10min，所述冻干的温度为-30～-20℃，真空度为0.100～0.024mBar，冻干时间为3～5d。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1)本发明利用角蛋白中大量的胱氨酸，加入二硫苏糖醇对其二硫键进行重整连接，大大优化了其力学性能，增大了角蛋白敷料拉伸强度和断裂伸长率。
2)同时，抗菌剂N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸也具有巯基能够通过等离子处理接枝到角蛋白和重组人表皮生长因子上，能够使得重组人表皮生长因子具有一定的抗菌活性。敷料使用在皮肤表面，皮肤有拉伸和形变。所以敷料要有一定的强度和柔韧性。另外，抗菌剂接枝到角蛋白上能够使敷料长期抗菌，抗菌剂分子不易发生降解变质；抗菌剂接枝到重组人表皮生长因子上能够将抗菌作用渗透至伤口内部伤口内部有许多组织渗出液，容易滋生细菌，但是抗菌剂释放太多会刺激伤口愈合，抗菌剂太少有达不到抗菌效果，通过重组人表皮生长因子携带抗菌剂可以有效控制抗菌剂释放量。
附图说明
图1本发明实施例及对比例处理下的小鼠L929成纤维细胞增殖率
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
本发明提供了一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法，包括如下步骤：
S1：将再生人发角蛋白完全溶解于98v/v％甲酸溶液，搅拌均匀，得到角蛋白溶液；
S2：将所述角蛋白溶液冷冻干燥，得到角蛋白冻干海绵；
S3：将所述角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，得活化角蛋白冻干海绵；
S4：将所述活化角蛋白冻干海绵浸泡在含有重组人表皮生长因子、二硫苏糖醇和N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的混合溶液中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干得长效抗菌促愈合角蛋白敷料。
具体的，首先将再生人发角蛋白完全溶解于98v/v％甲酸溶液，搅拌均匀，得到角蛋白溶液。角蛋白溶液中再生人发角蛋白的浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L。
得到角蛋白溶液后，将角蛋白溶液冷冻干燥，得到角蛋白冻干海绵。本发明中冷冻干燥的温度优选为-30～-20℃，更优选为-30℃，真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar，冻干时间优选为3～5d，更优选为4d。
得到角蛋白冻干海绵后，经等离子器处理活化，得到活化角蛋白冻干海绵。本发明中等离子器处理的条件为：气体优选采用氮气或氧气，更优选为氧气，处理功率优选为250～300W，更优选为280W，压强优选为50～60Pa，更优选为55Pa，处理时间优选为10～15min，更优选为15min。
得到活化角蛋白冻干海绵后，将活化角蛋白冻干海绵浸泡在含有重组人表皮生长因子、二硫苏糖醇和N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的混合溶液中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干得长效抗菌促愈合角蛋白敷料。本发明混合溶液中重组人表皮生长因子的浓度优选为40～80mg/L，更优选为60mg/L，二硫苏糖醇的浓度优选为4～8g/L，更优选为6g/L，N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的浓优选为5～10g/L，更优选为6g/L。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1：
1、将2g再生人发角蛋白完全溶解于100ml 98％(v/v)甲酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用冷冻干燥，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，得到角蛋白冻干海绵；
3、将角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
4、将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在含有60mg/L重组人表皮生长因子EGF、6g/L二硫苏糖醇和6g/L N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的溶液中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
5、将完成接枝反应的角蛋白冻干海绵离心冻干，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料。
实施例2：
1、将1g再生人发角蛋白完全溶解于100ml 98％(v/v)甲酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用冷冻干燥，温度为-20℃，真空度为0.100mBar，冻干时间为3d，得到角蛋白冻干海绵；
3、将角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氮气，处理功率为250W，压强50Pa，处理时间为10min；
4、将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在含有40mg/L重组人表皮生长因子EGF、4g/L二硫苏糖醇和5g/LN,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的溶液中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.100mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:100，浸泡温度为0℃，浸泡时间为12h；
5、将完成接枝反应的角蛋白冻干海绵离心冻干，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-20℃，真空度为0.100mBar，冻干时间为3d，即得一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料。
实施例3：
1、将3g再生人发角蛋白完全溶解于100ml 98％(v/v)甲酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用冷冻干燥，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为5d，得到角蛋白冻干海绵；
3、将角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为300W，压强60Pa，处理时间为15min；
4、将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在含有80mg/L重组人表皮生长因子EGF、8g/L二硫苏糖醇和10g/LN,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的溶液中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:300，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
5、将完成接枝反应的角蛋白冻干海绵离心冻干，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为5d，即得一种长效抗菌促愈合角蛋白敷料。
对比例1：
1、将2g再生人发角蛋白完全溶解于100ml 98％(v/v)甲酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用冷冻干燥，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，得到角蛋白冻干海绵；
3、将角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
4、将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在含有60mg/L重组人表皮生长因子EGF的溶液中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
5、将完成接枝反应的角蛋白冻干海绵离心冻干，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面活化的角蛋白海绵。
对比例2：
1、将2g再生人发角蛋白完全溶解于100ml 98％(v/v)甲酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用冷冻干燥，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，得到角蛋白冻干海绵；
3、将角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
4、将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在含有6g/LN,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的溶液中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
5、将完成接枝反应的角蛋白冻干海绵离心冻干，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面活化的抗菌角蛋白海绵。
对比例3：
1、将2g再生人发角蛋白完全溶解于100ml 98％(v/v)甲酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用冷冻干燥，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，得到角蛋白冻干海绵；
3、将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在含有60mg/L重组人表皮生长因子EGF和6g/LN,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的溶液中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
4、将完成接枝反应的角蛋白冻干海绵离心冻干，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面活化的抗菌角蛋白海绵。
对比例4：
1、将2g再生人发角蛋白完全溶解于100ml 98％(v/v)甲酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
2、采用冷冻干燥，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，得到角蛋白冻干海绵；
3、将角蛋白冻干海绵经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
4、将活化处理的角蛋白冻干海绵浸泡在含有60mg/L重组人表皮生长因子EGF和6g/L N,N-二(癸基丙胺基)-巯基甘氨酸的溶液中进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
5、将完成接枝反应的角蛋白冻干海绵离心冻干，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为-30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得一种等离子体表面活化的抗菌角蛋白海绵。
成纤维细胞增殖试验：
将实施例与对比例中的角蛋白海绵铺于96孔板底，再将小鼠L929成纤维细胞以1×105/ml的密度种植于96孔板，每孔100μl，每组5个复孔，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养24h后吸除培养液，每孔加入20μL用PBS配成的MTT(5mg/ml)，放置于5％CO2、37℃恒温培养箱中3h，加入150μl DMSO后震荡10min，置于酶标仪570nm读取吸光度OD值，求出各组OD平均值，判断细胞增殖情况，具体如图1所示。
从图1中可以看出，实施例的角蛋白海绵，可以有效促进成纤维细胞增殖，其效果优于对比例促进细胞增殖的效果。
力学性能测试：
取实施例和对比例材料试样浸泡在水中24h，选择5个均匀分布的点，用游标卡尺测量其宽度，在拉力试验机软件中输入试样的测量标距L1(mm)，标距测量精度为±1％，将拉力试验机载荷示值置于零位，把试样夹在拉力试验机夹具上，调整试样，使拉力均匀分布在试样横截面上，对试样施加0.1kPa的预应力或0.5％预伸长，完成预载荷或预伸长后，将伸长测量系统伸长示值清零，然后启动拉力试验机，拉伸速度为500±50mm/min，读取拉伸过程最大载荷F(N)和试样断裂瞬间的两夹具之间的距离L2(mm)，剔除标距外断裂的试样。
计算结果：
(1)计算每个试样的平均厚度a(mm)和平均宽度b(mm)；
(2)根据计算得到的试样平均厚度和平均宽度，可以计算出试样的原始横截面积A(mm2)：A＝a×b；
(3)按下式计算每个试样的拉伸强度TS(MPa)：
TS＝(F/A)×103
式中：TS——试样的拉伸强度，KPa或MPa；F——试样拉伸过程中最大载荷，N；A——试样横截面积，mm2；
(4)断裂伸长率的计算：
e＝(L2-L1)/L1，其中e为断裂伸长率，L1为试样原来长，L2试样拉断时的长度。
实施例1-3和对比例1-3制备得到的产品的拉伸强度和断裂伸长率如表1所示。
表1力学性能测定结果
拉伸强度(MPa)
断裂伸长率(％)
实施例1
0.91±0.05
42.5±2.75
实施例2
0.88±0.04
35.9±3.22
实施例3
0.85±0.05
35.8±4.18
对比例1
0.32±0.04
10.4±1.30
对比例2
0.30±0.06
12.3±2.47
对比例3
0.29±0.02
11.1±3.26
由表1可知，本发明所制备的角蛋白敷料具有更高的拉伸强度和断裂伸长率，其力学强度和柔韧性、弹性都显著优于对比例材料。
抗菌试验：
精确称取0.75g实施例与对比例的角蛋白海绵，置于无菌锥形瓶中，同时制备不加样品组。将7组分别加入70ml 0.03mol/l磷酸盐缓冲液和5ml 1×105/ml金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌菌液，在37℃、200r/min条件下，振荡培养16h，分别于0h、16h取样，用平板计数法测定活菌数，每组重复3次，根据以下公式计算平均抑菌率，结果见表2。
抑菌率X(％)＝(A-B)/×A×100％
式中：A、B分别为0d、7d样品的活菌数。
表2抗菌试验结果
金黄色葡萄球菌抑菌率
大肠杆菌抑菌率
白色念珠菌抑菌率
实施例1
100.00±0.00％
100.00±0.00％
100.00±0.00％
实施例2
98.33±1.02％
94.29±3.29％
95.48±4.29％
实施例3
92.24±4.21％
91.38±3.98％
94.22±3.10％
对比例1
45.23±9.27％
48.84±7.23％
52.49±4.26％
对比例2
32.13±9.41％
40.05±9.20％
49.72±8.26％
对比例3
19.20±2.27％
29.03±4.02％
39.08±9.37％
由表2可知，本发明所制备的角蛋白海绵能很好地抑制细菌的生长，而对比例抑菌效果较差。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。