一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料及制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料及制备方法和应用 (Silk fibroin antibacterial dressing with silver loaded on one side, and preparation method and application thereof ) 是由 葛少华 邵金龙 马保金 崔雅婷 商玲玲 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料及制备方法和应用。银具有良好的抗菌性能可应用于创面的抗菌剂进行添加,但有研究表明银可能同时具有细胞毒性作用从而降低创面细胞活力。针对上述技术问题,本发明提供了一种单侧负载原位生成AgCl颗粒的丝素蛋白抗菌敷料,该抗菌敷料包括银负载层及丝素蛋白层,丝素蛋白层直接接触创面,为创面细胞提供良好的生长环境,与此同时,银负载层通过丝素蛋白层的缓冲作用持续释放Ag～(+),降低对创面细胞毒性的同时还发挥抗菌剂的作用。所述抗菌敷料具有制备工艺简单、促进伤口愈合的优点。(The invention particularly relates to a silk fibroin antibacterial dressing with silver loaded on one side, and a preparation method and application thereof. Silver has good antibacterial performance and can be applied to the addition of an antibacterial agent of a wound surface, but researches show that the silver possibly has a cytotoxic effect at the same time so as to reduce the activity of cells of the wound surface. Aiming at the technical problem, the invention provides a silk fibroin antibacterial dressing with single-side loading and in-situ generation of AgCl particles, which comprises a silver loading layer and a silk fibroin layer, wherein the silk fibroin layer is directly contacted with a wound surface to provide a good growth environment for cells of the wound surface, and meanwhile, the silver loading layer continuously releases Ag through the buffering effect of the silk fibroin layer + Reducing cytotoxicity to wound surfaceAnd also acts as an antimicrobial. The antibacterial dressing has the advantages of simple preparation process and promotion of wound healing.)
技术领域
本发明属于抗菌创面敷料技术领域，具体涉及一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料、所述抗菌敷料的制备方法及所述抗菌敷料作为创面敷料的应用。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。丝素蛋白(silk fibroin，SF)是从蚕丝中提取的天然蛋白质，其具有促进细胞迁移、增殖、血管生成和再上皮化的能力以及与细胞外基质相似结构而被广泛地应用于伤口敷料。以丝素蛋白作为支架材料的敷料通常具有出色的生物相容性和可降解性，低免疫原性和较弱的炎症反应，此外，据报道丝素蛋白敷料还能够促进伤口的愈合。由于大多数伤口直接暴露于环境中，极易受到细菌侵袭，因此，预防和减少细菌感染是促进愈合的一个重要因素。但是，丝素蛋白本身不具有抗菌作用。
银(silver，Ag)具备广谱抗菌特性且不像抗生素那样显示出广泛的耐药性，因此常被用作抗菌剂添加到伤口敷料中。研究发现，真核细胞比原核细胞对银的耐受性更高，在原核细胞中，呼吸链及DNA复制等重要的生化途径位于细胞质膜上，而真核细胞的这些生化途径位于受细胞器保护的线粒体和细胞核内。因此，银的细胞毒性浓度和抗菌浓度之间的差异可作为其抗菌应用的治疗窗口。
尽管如此，银的应用还是存在争议的。一些研究发现含银的敷料会延迟伤口愈合，而另一些研究则证实含银敷料会促进伤口愈合。目前含银敷料对伤口愈合的影响没有一致的结论，可能的原因是，银是一把双刃剑，既具有抗菌特性，同时对细胞也有毒性。因此，如何在维持高抗菌能力的同时降低银对细胞活力的副作用是亟待解决的问题。
目前减少银细胞毒性的方法多是采用绿色生物合成法、降低细胞中活性氧法以及在含银钛板表面涂布胶原蛋白薄膜等方法。逐层组装技术是一种用于沉积薄膜以生成功能材料的方法，所形成的材料具有可控制的结构、性能和功能，可用于各种应用。
发明内容
针对上述研究背景，本发明提出了一种简化的逐层组装技术，在负载银的丝素蛋白膜上复合丝素蛋白层，利用两层结构来降低银的细胞毒性，同时保持其抗菌效果。为此，本发明设计并制备了同时具有负载银的丝素蛋白(Ag-SF)层和纯丝素蛋白(SF)层的复合膜材料(Ag-SF/SF)，并对复合膜的形态，理化性质以及Ag+释放情况进行了表征。通过抗菌实验评价了负载不同银含量的Ag-SF/SF复合膜的抗菌活性。将人包皮成纤维细胞(humanforeskin fibroblasts，HFFs)接种到Ag-SF/SF复合膜上，以探究Ag-SF侧和SF侧的细胞相容性。进一步研究了Ag-SF层与SF层不同厚度比对细胞活性的影响，以阐明双层结构对减少银细胞毒性的影响。通过划痕实验检测Ag-SF/SF复合膜的SF侧在体外对伤口愈合的影响。此外，通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)检测复合膜SF侧细胞的Ⅰ型胶原(collagen I，Col I)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)mRNA表达水平。最后，将Ag-SF/SF复合膜应用于金黄色葡萄球菌感染的大鼠背部皮肤切除伤口夹板模型中，以评估其对感染伤口愈合的作用。
基于上述研究，本发明提供以下技术方案：
本发明首先提供一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料，所述抗菌敷料具有贴合的丝素蛋白层及银-丝素蛋白层。
银所具备的抗菌特性使其广泛应用于伤口敷料中，但其产生的细胞毒性也引起了广泛关注。本发明提出了一种具有单侧银分布抗菌敷料的新颖设计，以减少细胞毒性，同时保持抗菌性能，从而扩大其治疗范围。采用简化的逐层组装技术来制备Ag-SF/SF复合膜，复合膜的SF侧在体外显示出比Ag-SF侧更低的细胞毒性，同时在两侧均保持了相当的抗菌效果。进一步的体内结果表明，Ag-SF/SF抗菌敷料可加速感染伤口的愈合。
皮肤富有弹性且具有一定的运动范围，因此伤口敷料应具有一定的拉伸强度。在本发明的研究中，所制备的SF膜(～7.0MPa)和Ag-SF/SF复合膜(～7.6MPa)均具有较高的杨氏模量，经过形貌测定，该复合膜中所述丝素蛋白的β折叠结构增强了机械性能。
此外，银的添加使复合膜具有抗菌活性，其形态以Ag+形式存在。纳米银存在制备成本高、稳定性不足，并且纳米银本质上作为一种银单质在释放效果上存在不足。为克服上述技术缺陷，本发明采用的解决方法为：提供一种Ag+状态的抗菌产品。本发明具体采用的方式是，以硝酸银作为原料，与反应物中的氯化钙发生置换反应生产AgCl，从而实现了抗菌敷料中银能够长期保持Ag+形态进行释放。进一步的，本发明研究结果表明，所述复合膜中，无论是丝素蛋白侧还是银-丝素蛋白侧都能够发挥抗菌作用，其抗菌效果相当，采用丝素蛋白侧接触感染创面时具有良好的促进愈合效果。
基于上述研究结论，本发明提供的复合膜应用于创面愈合兼具多项生理活性，具有重要的生产意义，并且该复合膜的制备工艺简便，容易实现工业的扩大化生产。因此，第二方面，本发明提供第一方面所述单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将碳酸钠加入煮沸的蒸馏水中溶解，加入剪碎的蚕茧壳不断搅拌至脱胶，脱胶后的丝素蛋白用蒸馏水清洗浸泡以去除表面残留的碳酸钠，清洗干净的丝素蛋白于室温下完全干燥，将氯化钙溶于甲酸中以形成甲酸-氯化钙混合溶液，随后丝素蛋白加入上述混合溶液中并搅拌至丝素蛋白完全溶解，形成丝素蛋白溶液；将硝酸银水溶液加入丝素蛋白溶液中形成银-丝素蛋白(Ag-SF)溶液，所述银-丝素蛋白溶液在模具上分散均匀后进行挥发，挥发一定时间后向分散界面上添加丝素蛋白溶液继续挥发得到所述银-丝素蛋白/丝素蛋白(Ag-SF/SF)的抗菌敷料。
最后，本发明提供所述单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料作为创面敷料的应用，所述创面敷料包括第一方面所述单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明通过简化的逐层组装技术成功制备了Ag-SF/SF复合膜；Ag-SF/SF复合膜的两侧都发挥了抗菌作用，且SF侧能够有效地促进伤口的愈合；当负载银浓度超过0.06mg/mL时，Ag-SF/SF复合膜在两侧均可发挥有效且相当的抗菌性能；细胞活力检测的结果表明，Ag0.12-SF/SF1:3复合膜在SF侧具有良好的细胞相容性，同时在Ag0.12-SF/SF1:3复合膜的SF侧也有很强的抗菌性能；此外，Ag0.12-SF/SF1:3复合膜在体外可促进Col I和TGF-βmRNA的表达，并在体内能够显著促进感染伤口的愈合。
2、本发明的研究提供了一种新的策略，即通过采用简化的逐层组装技术来实现银的单侧分布，以此降低材料的细胞毒性，进而实现扩大含银伤口敷料的治疗窗口，制备的Ag-SF/SF双功能复合膜作为伤口敷料可以有效地修复受损皮肤，因此具有巨大的应用潜力。此外，采用简化的逐层组装技术并不仅限于制备两层结构复合膜，也包括两层及两层以上的结构。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述SF膜和Ag-SF/SF复合膜的形态表征和元素分析结果图；
(A)不同放大倍数下SF膜和Ag-SF/SF复合膜的Ag-SF侧以及SF侧的SEM图像；
(B)元素分布；
(C)颗粒的原子比例。
图2为实施例1中所述SF膜和Ag-SF/SF复合膜的物相、力学性能及Ag-SF/SF复合膜的Ag+释放结果图；
(A)SF膜和Ag-SF/SF复合膜的XRD图谱；
(B)SF膜和Ag-SF/SF复合膜的FTIR图谱；
(C-E)SF膜和Ag-SF/SF复合膜的力学性能分析；
(F)Ag-SF/SF复合膜的Ag+释放曲线。
图3为实施例1中所述样品对金黄色葡萄球菌(A-D)和大肠杆菌(E，F)的抗菌性能检测结果图；
(A)Ag0.03-SF/SF、Ag0.06-SF/SF、Ag0.12-SF/SF和Ag0.24-SF/SF样品的Ag-SF侧和SF侧抑菌环的代表性图片；
(B)Ag-SF/SF样品中Ag-SF侧和SF侧抑菌环的定量分析；
(C)Ag0.12-SF/SF1:3、Ag0.12-SF/SF1:5和Ag0.12-SF/SF1:7样品中Ag-SF侧、SF侧及对照组抑菌环的代表性图片，以银均匀分布的单层膜作为对照组；
(D)不同厚度比Ag0.12-SF/SF样品中Ag-SF侧、SF侧及对照组抑菌环的定量分析；
(E)Ag0.03-SF/SF、Ag0.06-SF/SF、Ag0.12-SF/SF和Ag0.24-SF/SF样品的Ag-SF侧和SF侧抑菌环的代表性图片；
(F)Ag-SF/SF样品中Ag-SF侧和SF侧抑菌环的定量分析。样品的直径为10mm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图4为实施例1中所述细胞相容性检测结果图；
(A)HFFs在TCP、SF膜和Ag-SF/SF膜的Ag-SF侧上培养24h后的活死细胞染色，黄色箭头表示死细胞；
(B，C)HFFs在TCP、SF膜和Ag-SF/SF膜上培养24h后的CCK-8分析结果；
(B)HFFs培养在Ag-SF/SF膜的Ag-SF侧；
(C)HFFs培养在Ag-SF/SF膜的SF侧。与SF相比，**P<0.01，****P<0.0001。
图5为实施例1中所述Ag0.12-SF/SF1:3、Ag0.12-SF/SF1:5和Ag0.12-SF/SF1:7膜细胞相容性的检测结果图；
(A)HFFs在Ag0.12-SF/SF1:3、Ag0.12-SF/SF1:5和Ag0.12-SF/SF1:7膜上培养24h后的活死细胞染色，黄色箭头表示死细胞。以银均匀分布的单层膜作为对照组；
(B)HFFs在SF膜和不同厚度比Ag-SF/SF膜的不同面上培养24h后的CCK-8分析结果。与SF相比，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图6为实施例1中所述划痕实验和基因表达结果评价体外创面愈合情况结果图；
(A，B)为TCP组在划痕0h(A)和24h(B)后不同放大倍数下的显微图像；
(C，D)为SF膜组在划痕0h(C)和24h(D)后不同放大倍数下的显微图像；
(E，F)为Ag0.12-SF/SF1:3膜的SF侧组在划痕0h(E)和24h(F)后不同放大倍数下的显微图像；
(G)HFFs培养7天后Col I的表达水平；
(H)HFFs培养7天后TGF-β的表达水平。与TCP相比，****P<0.0001。
图7为实施例1中所述术后创面的宏观图像和Masson染色图像分析结果图；
(A)术后0、4、7、11和14天，假手术组、SF组和Ag0.12-SF/SF1:3组创面的宏观图像；
(B)定量分析创面宏观图像中剩余创面面积的百分比；
(C)术后4和14天，假手术组、SF组和Ag0.12-SF/SF1:3组创面组织的Masson染色图像；
(D)定量分析Masson图像中的胶原形成。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，银作为抗菌剂应用具有良好广谱抗菌效果，同时不容易产生耐药性，能够有效抑制创面细菌滋生，促进伤口的愈合。与此同时，银也同样具有细胞毒性作用，有研究表明，将银添加至敷料中会妨碍伤口的愈合。为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料，通过丝素蛋白层隔离银直接作用于创面，在保留其抗菌效果的同时，还降低了其细胞毒性作用。
本发明第一方面，提供一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料，所述抗菌敷料具有贴合的丝素蛋白层及银-丝素蛋白层。
进一步的，所述丝素蛋白层与银-丝素蛋白层的层厚度比为1:1～100:1，例如1:1、3:1、5:1、7:1、10:1、20:1、40:1、80:1和100:1等，但不限于列举的比例。
研究表明，Ag-SF:SF的最佳层厚度比为1:3，这时SF层使得复合膜在细胞毒性和抗菌功效之间达到平衡。
上述Ag-SF/SF抗菌敷料中，仅在Ag-SF侧面形成许多颗粒，对出现的颗粒进行元素分析证实为AgCl颗粒；通过SEM的观察表明，Ag-SF/SF复合膜在不同侧面具有不同的性能，这证明通过简化的逐层组装技术成功的制备了具有两层结构的复合膜，为后续研究提供了基础。XRD图谱表明，复合膜的Ag-SF侧在2θ＝27.8°、32.2°和46.2°显示出典型的AgCl衍射峰，其分别指向(111)、(200)和(220)平面(JCPDS号85-1355)；同时，与SF膜相似，Ag-SF/SF复合膜的XRD图谱在2θ＝～21°处也显示出一个宽峰，这是具有β折叠结构的silk II的晶体衍射峰。与XRD图谱一致，FTIR光谱中SF膜和Ag-SF/SF复合膜在1517cm-1和1623cm-1处的特征峰分别属于酰胺II和酰胺I的振动，这也证实了β折叠结构存在于Ag-SF/SF复合膜中。先前研究表明，β折叠结构可以用作连接不同蛋白质链以形成连续网络的物理交联，这赋予了SF支架较高的机械强度。本发明研究证实，该抗菌敷料中的丝素蛋白同样能够形成β折叠构造，从而提供了良好的机械性能。XRD和FTIR结果表明，Ag-SF/SF复合膜保留了丝素蛋白的特征峰，银的加入不会改变丝素蛋白的结构性质。
本发明第二方面，提供第一方面所述单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将碳酸钠加入煮沸的蒸馏水中溶解，加入剪碎的蚕茧壳不断搅拌至脱胶，脱胶后的丝素蛋白用蒸馏水清洗浸泡以去除表面残留的碳酸钠，清洗干净的丝素蛋白于室温下完全干燥；将氯化钙溶于甲酸中以形成甲酸-氯化钙混合溶液，随后丝素蛋白加入上述混合溶液中并搅拌至丝素蛋白完全溶解，形成丝素蛋白溶液；将硝酸银水溶液加入丝素蛋白溶液中形成银-丝素蛋白(Ag-SF)溶液，所述银-丝素蛋白溶液在模具上分散均匀后进行挥发，挥发一定时间后向分散界面上添加丝素蛋白溶液继续挥发得到所述银-丝素蛋白/丝素蛋白(Ag-SF/SF)的抗菌敷料。
优选的，所述丝素蛋白溶液制备方式如下：将丝素蛋白加入甲酸-氯化钙的混合溶液中溶解。
在上述优选技术方案的一种实施方式中，所述甲酸为85～90％质量分数的甲酸溶液。
进一步的，所述氯化钙的浓度为0.2～1g/10～15mL。
进一步的，所述丝素蛋白溶液的浓度为1～2g/10～15mL。
在该系列的实施方式中，所述丝素蛋白的脱胶方式如下：将水加热煮沸，加入碳酸钠溶解，之后加入蚕茧壳煮至脱胶；清洗后，将脱胶的丝素蛋白浸泡一段时间并干燥。
优选的，所述银-丝素蛋白(Ag-SF)的溶液的制备方法如下：将脱胶后的丝素蛋白加入甲酸-氯化钙溶液中搅拌溶解，制备丝素蛋白溶液，随后将硝酸银添加至丝素蛋白溶液中混合均匀。
所述制备方法的一种具体实施方式中，所述银-丝素蛋白(Ag-SF)的溶液置于模具中分散均匀，在通风条件下挥发0.4～0.6h后向模具中添加丝素蛋白溶液继续挥发2～3h，将模具依次浸入水及乙醇溶液中释放模具得到所述银-丝素蛋白/丝素蛋白(Ag-SF/SF)的抗菌敷料。
本发明第三方面，提供一种创面敷料，所述创面敷料包括第一方面所述单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料。
优选的，所述创面敷料中还包括背衬层，所述背衬层包括但不限于离型纸、无纺布、纱布、合成纤维或多聚膜材料中的一种。
优选的，所述创面敷料中还包括其他活性成分，如吸水性成分、抗炎成分或抗微生物成分。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
实验材料和方法：
(一)SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的制备与表征
1.丝素蛋白溶液的制备
将1.2L蒸馏水加热至沸腾之后，加入2.55g碳酸钠溶解，然后加入3g剪碎的蚕茧壳，继续煮40min至脱胶。将脱胶的丝素蛋白用蒸馏水漂洗三次，在1L蒸馏水中浸泡过夜以去除表面残留的碳酸钠，取出后于室温下完全干燥。溶解称量0.2～1g氯化钙，将其溶解于10～15mL甲酸(质量分数85～90％)中，将1～2g脱胶丝素蛋白加入上述溶液中并搅拌至完全溶解以供进一步使用。
2.SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的制备
培养皿作为制备膜的模具。首先，分别制备0.03-0.24mg/mL Ag-SF溶液，将200μL0.03-0.24mg/mL的Ag-SF溶液均匀分散在整个模具中，将其置于通风橱内挥发0.5h，至表面无液体流动性，然后添加600μL SF溶液继续挥发2.5h以形成Ag0.03-SF/SF、Ag0.06-SF/SF、Ag0.12-SF/SF和Ag0.24-SF/SF复合膜。
按照上述步骤制备Ag0.12-SF/SF1:3、Ag0.12-SF/SF1:5和Ag0.12-SF/SF1:7复合膜，在模具中先加入200μL 0.12mg/mL Ag-SF溶液，至表面无液体流动性后再分别加入600μL、1000μL或1400μL SF溶液；SF膜的制备是直接将800μL SF溶液加入模具内，挥发3h。将带有膜的模具浸入蒸馏水中0.5h，然后浸入无水乙醇中1-2h以释放模具。最后，将一部分制备的材料裁成10mm直径的样品，并在无水乙醇中于4℃储存以备进一步使用。
3.SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的表征
本部分采用Ag0.12-SF/SF1:3膜进行材料表征。在扫描电子显微镜(scanningelectron microscope，SEM)下观察SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的形态。通过能量散射X射线(energy dispersive X-ray，EDX)分析Ag-SF/SF抗菌敷料的元素分布。通过X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)图谱和傅立叶变换红外(fourier transform infrared，FTIR)光谱分析Ag-SF/SF抗菌敷料的理化特性。通过万能试验机对SF膜和Ag-SF/SF复合膜(n＝3)的拉伸性能进行测试，统计并分析其断裂应变，杨氏模量和拉伸强度。
4.Ag-SF/SF抗菌敷料Ag+释放检测
将Ag-SF/SF(Ag0.12-SF/SF1:3)抗菌敷料(n＝3)浸泡在2mL磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered solution，PBS)中于37℃恒速搅拌。在1、6、24、72、168、240和336h，分别收集2mL上清液，并用新鲜的PBS溶液进行替换。通过原子吸收光谱(atomicabsorption spectroscopy，AAS)分析估算Ag+的浓度，以评估释放曲线。
(二)体外实验检测Ag-SF/SF抗菌敷料的抗菌性能及其对细胞生物学活性的影响
1.体外抗菌测试
通过抑菌环测试来评估抗菌敷料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果。将菌株和无菌盐水(0.85％NaCl)混合制备细菌悬浮液，使用紫外分光光度计检测使其OD600nm值为0.123，然后稀释10倍。随后，将细菌悬浮液均匀地涂在营养琼脂平板上，将直径为10mm的样品(n＝3)放在涂布细菌的琼脂平板上。在36℃下培养20h后，以尺子作为校准器并拍摄图像，测量透明抑菌环的直径并进行分析。
2.SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料上的细胞相容性检测
将各组样品浸泡在75％的乙醇中过夜，然后在48孔板中用紫外线照射1h进行灭菌，用PBS漂洗三次后，加入PBS浸泡并继续在紫外灯下照射1h，吸弃PBS后加入完全培养基浸泡过夜。将HFFs以3×104个细胞/孔的密度接种到SF膜或Ag-SF/SF抗菌敷料上，以TCP组作为对照。活死细胞染色：细胞培养24h后，根据制造商的说明使用活死细胞染色试剂盒观察细胞状态。CCK-8实验：细胞培养24h后，使用胰蛋白-EDTA消化液将材料表面的细胞消化下来，收集细胞悬液，并重新转移至新的96孔板内，孵育12h后，弃去原有培养液，将10μLCCK-8液和100μL DMEM加入到每个孔中(n＝3)，于37℃下避光培养2-3h后，使用酶联免疫分光光度仪在450nm波长处检测吸光度值。
3.划痕实验检测SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料对HFFs体外创面愈合的影响
将HFFs以3×105个细胞/孔的密度接种到SF膜或Ag-SF/SF抗菌敷料上，以TCP组作为对照，细胞培养次日，待细胞铺满板底，使用10μL无菌枪头垂直于板底划竖线，于37℃培养箱中继续培养24h。在划痕0和24h后置于显微镜下观察并拍摄创面愈合照片。
4.qRT-PCR分析
将HFFs以1×105个细胞/孔的密度接种到6孔板内的SF膜或Ag-SF/SF抗菌敷料(n＝3)上，培养7天以检测Col I和TGF-β基因表达情况。使用TRIzol试剂提取总RNA，并用Nanodrop 2000微量分光光度计测量每个样品的mRNA浓度，然后将mRNA反转录成cDNA，进行实时定量PCR分析。管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用于标准化Col I和TGF-β的mRNA水平。
(三)体内实验检测Ag-SF/SF抗菌敷料对感染伤口愈合的影响
1.皮肤创面切除夹板固定模型的建立
实验使用12只8周龄健康雄性Wistar大鼠，术前12h禁食禁水。盲法是由独立研究人员保留所有样本组的信息来进行的，分组信息是直到收集了所有数据后才公开的。将所有伤口随机分为3组，即假手术对照组，SF组和Ag0.12-SF/SF1:3组(n＝8)，其中Ag0.12-SF/SF1:3复合膜的SF侧接触皮肤感染伤口缺损区，假手术对照组的缺损区不放置任何材料。异氟烷吸入麻醉后，剃去大鼠背部的毛，然后依次用碘伏和75％的乙醇对手术部位进行消毒，用一次性皮肤打孔器在大鼠背部皮肤的两侧打出直径为8mm的四个圆形伤口，将红色圆形硅胶圈(内径12mm，外径22mm，厚度1mm)缝合固定于缺损上方，以防止由皮肤收缩导致的伤口闭合，然后，将10μL溶于0.85％无菌盐水的金黄色葡萄球菌(1×108CFU)细菌悬浮液注射到伤口表面，并用不同的膜覆盖伤口，使用3M透明敷料和绷带进一步固定伤口。分别于术后0、4、7、11和14天拍摄创面愈合照片。在第4天和第14天，注射过量的麻醉药安乐死大鼠，并收集伤口和周围正常皮肤组织，于4％多聚甲醛中固定。按照发明人以前的研究方法量化伤口的减少情况。将伤口面积(％)表示为伤口减少并使用以下公式计算：
2.组织学分析
4％多聚甲醛固定后，将样品进行梯度脱水后包埋在石蜡中，沿着皮肤的表层至深层制备5μm厚的连续切片，每第十九个切片进行Masson染色。所有样品均在奥林巴斯显微镜下观察，并使用ImageJ软件进行测量。使用胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)量化胶原蛋白的形成，染成蓝色的组织区域被认为是胶原蛋白区域，CVF表示为胶原蛋白面积/总面积(％)，具体计算为蓝染组织所占的面积除以直视下组织的总面积。
实验结果：
1.SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的形态表征和元素分析
通过SEM-EDX对SF膜和Ag-SF/SF复合膜的形貌及元素组成进行分析。如图1A所示，SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料都显示出平滑的表面。在Ag-SF/SF抗菌敷料的Ag-SF侧可以看到许多颗粒，EDX结果证实颗粒包含C、N、O、Cl和Ag(图1B)，并且Ag与Cl元素的原子比例接近1：1(图1C)，表明由于AgNO3和CaCl2之间的反应形成了AgCl。
2.SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的物相，力学性能和Ag+释放曲线
XRD图谱用来研究SF和AgCl的晶相(图2A)。SF膜的XRD图谱在2θ＝～21°处有一个典型的衍射峰，在Ag-SF/SF抗菌敷料的Ag-SF侧也观察到该特征衍射峰，同时，Ag-SF/SF抗菌敷料在2θ＝27.8°、32.2°和46.2°处显示出AgCl的特征峰。FTIR分析表明，SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料在1517cm-1和1623cm-1处显示出酰胺II和酰胺I振动的特征峰(图2B)。力学性能结果显示SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的杨氏模量和拉伸强度是相似的(图2C-E)。使用AAS检测Ag+的释放浓度，Ag+释放曲线显示，在早期阶段Ag+释放速率相对较快，而在后期阶段内部Ag+释放速率相对缓慢(图2F)。
3.Ag-SF/SF抗菌敷料的抗菌性能的检测
Ag-SF/SF抗菌敷料的抗菌性能通过抑菌环测试进行定量评估。如图3A所示，在对金黄色葡萄球菌的抑菌环实验中，Ag0.03-SF/SF复合膜未显示出抑菌环，但从Ag0.06-SF/SF复合膜开始，观察到明显的抑菌环。在相同银含量的Ag-SF/SF复合膜中，Ag-SF侧和SF侧显示出相似的抗菌效果，此外，随着银含量的增加，Ag-SF/SF复合膜的抗菌效果逐渐增强，但Ag0.12-SF/SF复合膜的抗菌效果与Ag0.24-SF/SF复合膜的相当(图3B)。为了进一步阐明两层间不同厚度比对抗菌功效的影响，对不同Ag-SF层：SF层厚度比的Ag-SF/SF膜进行了测试，以单层银均匀分布的膜作为对照，结果显示双层结构的膜和单层银均匀分布的膜均显示出明显的抑菌环(图3C)，并且随着SF层厚度的增加，材料的抗菌性能逐渐降低，但在相同层厚度比的情况下，单层膜对照组、双层膜的Ag-SF侧以及SF侧组之间的抗菌性没有显著差异(图3D)。为了证明Ag-SF/SF复合膜的广谱抗菌活性，测试了不同银含量的Ag-SF/SF1:3膜对大肠杆菌的抗菌作用。与对金黄色葡萄球菌的抑菌结果相似，Ag0.12-SF/SF1:3膜的Ag-SF侧和SF侧对大肠杆菌均有较好的抑菌效果(图3E，F)。
4.SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的细胞活性的检测
为了研究SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料的细胞相容性，采用活死细胞染色观察接种到不同膜上的细胞状态，如图4A所示，活细胞被染成绿色，而死细胞被染成红色，与其他组相比，Ag0.24-SF/SF组的活细胞数量明显减少并且出现的死细胞数量更多。此外，CCK-8实验进一步定量评估了Ag-SF/SF抗菌敷料不同侧面的细胞活性，如图4B，C所示，随着银含量的增加，Ag-SF/SF抗菌敷料两侧的细胞毒性都相应增加，然而，观察Ag0.12-SF/SF组的SF侧几乎没有细胞毒性，而在Ag-SF侧却显示出相对明显的细胞毒性，由此证明HFFs在SF侧的细胞活性要高于Ag-SF侧。基于Ag-SF/SF抗菌敷料的SF侧比Ag-SF侧显示出更好的细胞相容性，进一步探讨了分别为1:3、1:5和1:7的Ag0.12-SF：SF不同层厚度比材料对细胞活力的影响，将具有银均匀分布的单层膜作为对照。如图5A，B所示，不论Ag0.12-SF/SF膜的层厚度比为多少，与具有相同厚度的银均匀分布的单层膜相比，Ag0.12-SF/SF膜的SF侧显示出更好的细胞相容性，而在Ag-SF侧表现出一定的细胞毒性。
5.划痕实验检测SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料对HFFs体外创面愈合的影响
如图6A-F所示，建立划痕后，TCP、SF膜和Ag0.12-SF/SF1:3膜的SF侧组均出现一条无细胞的划痕线，但由于SF膜材料具有柔韧性，在SF膜和Ag0.12-SF/SF1:3膜的SF侧上建立的划痕线比TCP组的宽。尽管存在这些差异，SF膜和Ag0.12-SF/SF1:3膜的SF侧组在体外的伤口闭合情况与TCP组是相似的。
6.SF膜和Ag-SF/SF抗菌敷料对HFFs表达Col I和TGF-β基因的影响
Col I是细胞外基质的主要组成成分，是细胞附着、生长和分化的天然基质；TGF-β可以调节细胞增殖、迁移、分化和细胞外基质的产生，并在伤口愈合中起到多方面的作用；因此，进一步评估了Col I和TGF-β的表达水平，以探究Ag-SF/SF抗菌敷料对皮肤再生的潜力。如图6G，H所示，细胞培养7天后，在SF膜和Ag0.12-SF/SF1:3复合膜的SF侧组，Col I和TGF-β的表达水平均高于TCP组。因此，Col I和TGF-β表达水平的提高可以表明Ag-SF/SF抗菌敷料可以促进伤口愈合。
7.Ag-SF/SF抗菌敷料在体内对创面愈合的影响
为探究Ag-SF/SF复合膜对皮肤感染创面愈合的影响，采用了以金黄色葡萄球菌感染的大鼠创面切除夹板固定模型进行体内实验。在实验进行的14天内，所有夹板对创面区域进行了标准化(图7A)，尽管在14天时，所有伤口的愈合率均超过90％，但Ag0.12-SF/SF1:3组的愈合速度明显快于假手术组和SF组(图7B)。Masson染色结果显示，Ag0.12-SF/SF1:3组的胶原蛋白形成量高于假手术组和SF组(图7C，D)，Ag0.12-SF/SF1:3组在第4天新生胶原蛋白量达到50％，在第14天时新生胶原蛋白量达到80％。
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