阅读说明：本技术 一种磁性固相萃取柱及其使用方法 (A kind of Magnetic solid phases extraction column and its application method ) 是由 严义勇 马红圳 邓炀 王嘉欣 刘自天 金虹 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种磁性固相萃取柱及其使用方法。本发明的磁性固相萃取柱,两片筛板之间填充有磁性吸附剂,所述下筛板为磁性筛板；利用了磁性材料易于操控,方便灵活的特点,在与目标分析物相互作用后,磁性材料由于磁力被吸附至下筛板表面堆叠形成磁性材料柱体,造成目标分析物在样品液流过磁性材料柱体时与磁性材料经过第二轮的多次层层碰撞的相互作用,大幅提高样品液被吸附的机率,提高了分离纯化效果；对于含有痕量目标分析物的样品液,可以提高回收率；在提高吸附回收率的同时可以有效降低相互作用时间,提高效率。同时,磁性材料柱体的形成及分散可以通过控制外力或者磁力实现,操作灵活。(The invention discloses a kind of Magnetic solid phases extraction column and its application methods.Magnetic solid phases extraction column of the invention, magnetic adsorbent is filled between two panels sieve plate, and the lower sieve plate is magnetic sieve plate；Magnetic material is utilized to be easily manipulated, convenient, flexible feature, after interacting with target analytes, since magnetic force is adsorbed to, lower floor lever of sieve tray stacks to form magnetic material cylinder magnetic material, cause the interaction repeatedly layer by layer collided of the target analytes when sample liquid flows through magnetic material cylinder with magnetic material by the second wheel, the probability that sample liquid is adsorbed is greatly improved, improves and isolates and purifies effect；For the sample liquid containing trace target analytes, the rate of recovery can be improved；The interaction time can be effectively reduced while improving adsorption recovery rate, improve efficiency.Meanwhile the formation and dispersion of magnetic material cylinder can be realized by control external force or magnetic force, flexible operation.)

一种磁性固相萃取柱及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物化学检测技术领域，特别是涉及了一种磁性固相萃取柱及其使用方法。

背景技术

在检测分析过程中，由于大多数样品的组成较复杂，且目标分析物的含量较低，不能直接用于仪器分析，检测前必须对样品进行有效的处理，分离和富集目标分析物。但样品预处理过程一般都较繁琐，易收到基质干扰，且耗时较长，严重影响检测的效率和可靠性。因此，高效的富集目标分析物至关重要，是整个检测分析过程中的关键步骤。固相萃取（SPE）技术是近年来迅速发展起来的一种基于液相色谱分析机理的样品预处理，具有简单、高效、以自动化和有机溶剂耗量少等优点，已广泛用于检测分析工作中。

近年来，一些分析工作者开始用磁性固相萃取（MSPE）技术进行样品预处理，并取得了很好的应用效果，它避免了普通固相萃取技术繁琐的过柱操作、吸附柱容易堵塞、重复性差等问题，因而具有很好的应用前景。在磁性固相萃取过程中，磁性吸附剂不直接填充到吸附柱中，而是被添加到样品溶液中，将样品溶液中的目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面，再利用外加磁场将吸附了目标分析物的磁性吸附剂从基质中分离出来，最后将目标物分析物脱附即可达到分离富集目标分析物的目的。

但是，本申请的发明人在实现本申请实施例的过程中发现，上述技术至少存在如下技术问题：在分离富集过程中，由于表面吸附必须经由目标分析物与磁性吸附剂表面基团的相互碰撞产生，因此具有一定的样品未捕及概率。在高浓度目标物样品中，可以通过延长相互作用时间，提高磁性吸附剂浓度等方式进行，但对于痕量目标物样品时，回收率通常难以保证。

发明内容

为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种磁性固相萃取柱及其使用方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种磁性固相萃取柱，包括柱管，所述柱管的内部设置有上筛板和下筛板，两片筛板之间填充有磁性吸附剂，所述下筛板为磁性筛板。

进一步地，所述磁性筛板由永磁性材料或非永磁性材料制成。

进一步地，所述永磁性材料包括铝镍钴、铁铬钴、永磁铁氧体、稀土材料中的至少一种；所述非永磁性材料包括镍铁合金、铁钴合金、铁铝合金、铁氧化物中的至少一种。

进一步地，所述柱管的下端设有出液口，所述出液口上设置有开合装置。

进一步地，所述开合装置为阀门或塞子。

进一步地，所述下筛板具有筛孔，所述筛孔的孔径小于所述磁性吸附剂的尺寸。

进一步地，所述下筛板的筛孔的孔径为0.1-800μm，所述下筛板的厚度为1nm-1cm；所述磁性吸附剂的尺寸为1nm-1mm。

本发明还提供上述磁性固相萃取柱的使用方法，包括如下步骤：

S1.提供磁性固相萃取柱，所述磁性固相萃取柱包括柱管，所述柱管的内部设置有上筛板和下筛板，两片筛板之间填充有磁性吸附剂，所述下筛板为磁性筛板；所述柱管的下端设有出液口，所述出液口上设置有开合装置；

S2.关闭所述开合装置，向所述柱管中加入含有目标分析物的样品液，涡旋混合；

S3.在磁场作用下磁性吸附剂在下筛板表面形成柱体；

S4.开启所述开合装置，使样品液流过所述开合装置，得到吸附了目标分析物的磁性吸附剂；

S5.对吸附了目标分析物的磁性吸附剂进行洗脱，得到待测液。

进一步地，所述步骤S1中，所述磁性固相萃取柱的组装方法为：关闭所述柱管下端出液口上设置的开合装置，依次向柱管内装入下筛板、磁性吸附剂分散液及上筛板；开启所述开合装置，采用负压将所述磁性吸附剂分散液抽干，使得磁性吸附剂填充于两片筛板之间。

进一步地，所述步骤S1中，所述磁性固相萃取柱的组装方法为：依次向柱管内装入下筛板、磁性吸附剂粉末及上筛板，使得磁性吸附剂填充于两片筛板之间。

进一步地，所述柱体高度小于所述两片筛板之间的距离。

进一步地，所述磁性筛板由非永磁性材料制成，步骤S3中，将柱管放置于线圈中心，所述线圈的端线串联有直流电源，通电使得所述线圈产生磁场。

进一步地，所述磁性筛板由永磁性材料制成，步骤S3中，由所述磁性筛板产生磁场。

进一步地，步骤S3中，使所述柱管处于垂直状态。

本发明具有如下有益效果：

本发明的磁性固相萃取柱，两片筛板之间填充有磁性吸附剂，所述下筛板为磁性筛板；利用了磁性材料易于操控，方便灵活的特点，在与目标分析物相互作用后，磁性材料由于磁力被吸附至下筛板表面堆叠形成磁性材料柱体，造成目标分析物在样品液流过磁性材料柱体时与磁性材料经过第二轮的多次层层碰撞的相互作用，大幅提高样品液被吸附的机率，提高了分离纯化效果；对于含有痕量目标分析物的样品液，可以提高回收率；在提高吸附回收率的同时可以有效降低相互作用时间，提高效率。同时，磁性材料柱体的形成及分散可以通过控制外力或者磁力实现，操作灵活。磁性材料柱体柱体的分离效率可以通过外置磁场强度调节，适合不同分离要求的调控。

具体实施方式

第一方面，本发明提供一种磁性固相萃取柱，包括柱管，所述柱管的内部设置有上筛板和下筛板，两片筛板之间填充有磁性吸附剂，所述下筛板为磁性筛板。

具体地，所述上筛板和所述下筛板在所述柱管内从上到下设置， 且所述上筛板和所述下筛板之间填充有磁性吸附剂。

本发明中，对于磁性吸附剂的种类不作具体限定，可以根据目标分析物的不同，采用磁性固相萃取中常用的各种磁性吸附剂，其结构和制备方法理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。作为举例，所述磁性吸附剂可以为甲基丙烯酸表面修饰的磁性颗粒，可以吸附样品液中的孔雀石绿、罗丹明B等非法添加；所述磁性吸附剂也可以为二氧化硅表面修饰的磁性颗粒，可以吸附样品液中DNA、蛋白等大分子，也可以吸附氯霉素等抗生素。

本发明中，所述上筛板可以为磁性筛板，也可以为固相萃取柱中常用的非磁性筛板，例如聚乙烯筛板。

本发明中，所述磁性筛板由永磁性材料或非永磁性材料制成。

所述永磁性材料包括铝镍钴、铁铬钴、永磁铁氧体、稀土材料中的至少一种，更优选地，所述永磁性材料为钕铁硼；但不局限于此，也可以是其他未列举在本实施例中的但被本领域技术人员所熟知的其他材料。

所述非永磁性材料包括镍铁合金、铁钴合金、铁铝合金、铁氧化物中的至少一种；但不局限于此，也可以是其他未列举在本实施例中的但被本领域技术人员所熟知的其他材料。

本发明中，对磁性筛板的制备方法不作具体限定，可以采用现有技术中已有的各种磁性筛板的制备方法。

作为进一步改进，所述磁性筛板由非永磁性材料和高分子材料制备而成，所述制备方法为方法一或方法二或方法三；

所述方法一具体包括以下步骤：（1）以非永磁性材料和高分子材料为原料制备磁性微球；（2）将所述磁性微球堆积置于多孔金属基过滤板中心，使用压机进行压制成型。

本发明中，制备磁性微球的方法步骤和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知，本领域技术人员可以采用现有技术中已有的磁性微球的制备方法，作为优选，以非永磁性材料和高分子材料为原料制备磁性微球的具体操作为：（1）以非永磁性材料为原料制备磁珠；（2）将所述磁珠加入到高分子材料的反应体系中，制备合成磁性微球。

其中，制备磁珠的方法步骤和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知，本领域技术人员可以采用现有技术中已有的磁珠的制备方法。以非永磁性材料为四氧化三铁为例，制备磁珠的具体操作为：将六水氯化铁和四水氯化亚铁分别用超纯水溶解后混合，涡旋均匀；倒入到超纯水和氨水的混合液中，搅拌，反应后洗涤至中性，得到四氧化三铁磁珠。

所述步骤（2）的具体操作为：将所述磁珠与苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、水混合，抽真空通氮除氧；搅拌升温，温度稳定后加入氧化苯甲酰，反应；磁铁洗涤收集得到磁性聚苯乙烯微球。

本发明中的方法一中，创造性地将磁性微球堆积置于多孔金属基过滤板中心，使用压机进行压制成型，所制得的磁性筛板的孔径小，磁性分布均匀。

本发明中，所述方法二具体包括以下步骤：（1）提供由高分子材料制备而成的烧结筛板；（2）提供由非永磁性材料制备而成的磁珠分散液；（3）将所述烧结筛板与所述磁珠分散液混合，回流反应，烘干，得到所述磁性筛板。

其中，本发明中对烧结筛板的制备方法不作具体限定，其原理和制备方法为本领域技术人员所熟知，作为举例，所述烧结筛板的制备方法为：将高分子材料投入模具中，将模具置于热压机中，压制成型得到烧结筛板。

其中，所述高分子材料可以为聚乙烯粉，但不局限于此，也可以是其它制备烧结筛板常用的高分子材料。

步骤（2）中，是由非永磁性材料制备磁珠，然后将磁珠分散在乙醇水溶液中，形成磁珠分散液。

本发明的方法二中，创造性地先由高分子材料制备烧结筛板，然后将磁性颗粒粘附在烧结筛板上，所制得的磁性筛板的孔径小，磁性分布均匀。

本发明中，所述方法三具体包括以下步骤：（1）以非永磁性材料和高分子材料为原料制备磁性微球；（2）将所述磁性微球置于金属模具中，将金属模具置于热压机中，压制成型得到所述磁性筛板。

其中，制备磁性微球的方法步骤和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知，本领域技术人员可以采用现有技术中已有的磁性微球的制备方法，作为优选，以非永磁性材料和高分子材料为原料制备磁性微球的具体操作为：（1）以非永磁性材料为原料制备磁珠；（2）将所述磁珠加入到高分子材料的反应体系中，制备合成磁性微球。其中，制备磁珠的方法步骤和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知，本领域技术人员可以采用现有技术中已有的磁珠的制备方法。以非永磁性材料为四氧化三铁为例，制备磁珠的具体操作为：将六水氯化铁和四水氯化亚铁分别用超纯水溶解后混合，涡旋均匀；倒入到超纯水和氨水的混合液中，搅拌，反应后洗涤至中性，得到四氧化三铁磁珠。

所述步骤（2）的具体操作为：将所述磁珠与苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、水混合，抽真空通氮除氧；搅拌升温，温度稳定后加入氧化苯甲酰，反应；磁铁洗涤收集得到磁性聚苯乙烯微球。

本发明中，对金属模具的尺寸不作具体限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行设定，作为举例，所述金属模具的尺寸为20*20*0.1cm。

本发明中对热压机工作的具体参数不作具体限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行设定。

本发明中的方法三中，以非永磁性材料和高分子材料为原料制备磁性微球，再将所述磁性微球置于金属模具中，将金属模具置于热压机中，压制成型得到所述磁性筛板，所制得的磁性筛板的孔径小，磁性分布均匀。

本发明中，所述柱管的下端设有出液口，所述出液口上设置有开合装置。

所述开合装置可以为阀门，也可以为塞子，但不局限于此，也可以是其它结构，只要能够控制出液口的打开和关闭。

本发明中，所述下筛板具有筛孔，所述筛孔的孔径小于所述磁性吸附剂的尺寸；所述下筛板的筛孔的孔径为0.1-800μm，所述下筛板的厚度为1nm-1cm；所述磁性吸附剂的尺寸为1nm-1mm。

本发明中，对上筛板的筛孔的孔径、厚度等不作具体限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行设定。

本发明的磁性固相萃取柱，两片筛板之间填充有磁性吸附剂，所述下筛板为磁性筛板；利用了磁性材料易于操控，方便灵活的特点，在与目标分析物相互作用后，磁性材料由于磁力被吸附至下筛板表面堆叠形成磁性材料柱体，造成目标分析物在样品液流过磁性材料柱体时与磁性材料经过第二轮的多次层层碰撞的相互作用，大幅提高样品液被吸附的机率，提高了分离纯化效果；对于含有痕量目标分析物的样品液，可以提高回收率；在提高吸附回收率的同时可以有效降低相互作用时间，提高效率。同时，磁性材料柱体的形成及分散可以通过控制外力或者磁力实现，操作灵活。磁性材料柱体柱体的分离效率可以通过外置磁场强度调节，适合不同分离要求的调控。

第二方面，本发明还提供上述磁性固相萃取柱的使用方法，包括如下步骤：

S1.提供磁性固相萃取柱，所述磁性固相萃取柱包括柱管，所述柱管的内部设置有上筛板和下筛板，两片筛板之间填充有磁性吸附剂，所述下筛板为磁性筛板；所述柱管的下端设有出液口，所述出液口上设置有开合装置；

S2.关闭所述开合装置，向所述柱管中加入含有目标分析物的样品液，涡旋混合；

S3.在磁场作用下磁性吸附剂在下筛板表面形成柱体；

S4.开启所述开合装置，使样品液流过所述开合装置，得到吸附了目标分析物的磁性吸附剂；

S5.对吸附了目标分析物的磁性吸附剂进行洗脱，得到待测液。

其中，所述步骤S1中，所述磁性固相萃取柱的组装方法可以为：关闭所述柱管下端出液口上设置的开合装置，依次向柱管内装入下筛板、磁性吸附剂分散液及上筛板；开启所述开合装置，采用负压将所述磁性吸附剂分散液抽干，使得磁性吸附剂填充于两片筛板之间。

所述步骤S1中，所述磁性固相萃取柱的组装方法还可以为：依次向柱管内装入下筛板、磁性吸附剂粉末及上筛板，使得磁性吸附剂填充于两片筛板之间。

本发明中，对步骤S2中柱管的状态不作具体限定，可以为水平状态，也可以以任意角度倾斜放置，只要使得样品液不溅出即可。

需要说明的是，为了使得涡旋混合时样品液不溅出，在涡旋混合前，将柱管上端盖紧。

本发明中，对步骤S3中所述柱管的状态不作特别限定，作为优选，使所述柱管可以处于垂直状态，这样设置的作用在于：磁性吸附剂由于重力作用自然下降在下筛板上，容易被后续磁力聚集形成柱体。

当所述磁性筛板由非永磁性材料制成，步骤S3中，将柱管放置于线圈中心，所述线圈的端线串联有直流电源，通电使得所述线圈产生磁场；当所述磁性筛板由永磁性材料制成，步骤S3中，由所述磁性筛板产生磁场。

现有技术中的固相萃取柱会将固相萃取吸附剂通过两个筛板压紧，固相萃取吸附剂的高度等于筛板间的距离，两个筛板直接接触填料，然后利用流动相进行分析样品在柱子上的柱层析进行分离纯化。但是上述固相萃取柱对颗粒容忍度很低，在分析样品进行柱层析过程中，必须要对颗粒清除得十分干净，否则会造成堵柱的现象，导致实验失败。因此在使用过程中经常需要进行高速离心，过滤等操作，较为繁琐；上述固相萃取柱在填装过程中，需要将填料准确放置于细小管道中，并施加一定压力使筛板压紧固相萃取吸附剂。这给生产带来一定的难度，特别对于较低量的固相萃取吸附剂而言，在生产过程中，经常由于压力不够恒定，而导致固相萃取吸附剂密度不一致，柱层析结果重现性欠佳的情况；而较小的管道对生产填装也提出了较高的设备要求。

本发明中，所述柱体高度小于所述两片筛板之间的距离。这样，样品液可以在萃取柱中形成湍流，这样使得固相萃取柱对颗粒的容忍度大大提高，大幅度降低样品前处理的难度、流程，有效避免了堵塞现象的出现，有效提高了固相萃取的工作效率；同时，在填装填料过程中，上筛板无需下压至填料表面，可以通过高度控制夹板位置，减少压力传感难度，减少因压力不均导致密度不一，进而导致实验结果重复性欠佳的问题。

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。

实施例1

一种磁性固相萃取柱的使用方法，包括如下步骤：

S1.提供容量为1ml的柱管，所述柱管的下端设有出液口，所述出液口上设置有阀门；关闭所述柱管下端出液口上设置的阀门，依次向柱管内装入下筛板、磁性吸附剂分散液及上筛板；开启所述阀门，采用负压将所述磁性吸附剂分散液抽干，使得磁性吸附剂填充于两片筛板之间；其中，所述上筛板为聚乙烯筛板，所述下筛板为磁性筛板，所述磁性筛板由钕铁硼制成；所述上筛板和下筛板之间的距离为1cm；所述磁性吸附剂分散液的体积为0.6ml，其中含有30mg甲基丙烯酸表面修饰的磁性颗粒；

S2.关闭所述阀门，向所述柱管中加入1ml含有目标分析物的样品液，将柱管上端盖紧，涡旋混合；

S3.使所述柱管处于垂直状态，在磁场作用下磁性吸附剂在下筛板表面形成柱体；所述柱体高度小于所述两片筛板之间的距离；

S4.开启所述阀门，使样品液流过所述阀门，得到吸附了目标分析物的磁性吸附剂；

S5.对吸附了目标分析物的磁性吸附剂进行洗脱，得到待测液。

实施例2

一种磁性固相萃取柱的使用方法，包括如下步骤：

S1.提供容量为3ml的柱管，所述柱管的下端设有出液口，所述出液口上设置有阀门；关闭所述柱管下端出液口上设置的阀门，依次向柱管内装入下筛板、磁性吸附剂分散液及上筛板；开启所述阀门，采用负压将所述磁性吸附剂分散液抽干，使得磁性吸附剂填充于两片筛板之间；其中，所述上筛板为聚乙烯筛板，所述下筛板为磁性筛板，所述磁性筛板由聚乙烯及四氧化三铁制成；所述上筛板和下筛板之间的距离为2cm；所述磁性吸附剂分散液的体积为3ml，其中含有120mg二氧化硅表面修饰的磁性颗粒；

S2.关闭所述阀门，向所述柱管中加入2ml含有目标分析物的样品液，将柱管上端盖紧，涡旋混合；

S3.使所述柱管处于垂直状态，将柱管放置于线圈中心，所述线圈的端线串联有直流电源，通电使得所述线圈产生磁场，在磁场作用下磁性吸附剂在下筛板表面形成柱体；所述柱体高度小于所述两片筛板之间的距离；

S4.开启所述阀门，使样品液流过所述阀门，得到吸附了目标分析物的磁性吸附剂；

S5.对吸附了目标分析物的磁性吸附剂进行洗脱，得到待测液。

对比例1

基于实施例1，不同之处仅在于：所述下筛板为聚乙烯筛板。

对比例2

基于实施例1，不同之处仅在于：本对比例2中填充于两片筛板之间的为非磁性吸附剂。

对比例3

采用传统的磁性固相萃取技术，将磁性吸附剂不直接填充到柱管中，而是被添加到含有目标分析物的样品液中，涡旋混合，将样品液中的目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面，再利用外加磁场将吸附了目标分析物的磁性吸附剂从基质中分离出来，最后将目标物分析物脱附。

试验例

样品液的制备：取加标2ppm苯并芘的辣椒粉3克，经粉碎机再次粉碎后，加入含5%DMSO的乙腈溶液5mL，1000rpm离心1分钟，然后取1毫升离心后的上清液与2毫升超纯水混匀，得到样品液。洗脱时均加入1毫升1%甲酸甲醇。分别采用实施例1及对比例1-3的方法进行处理，记录样品液完全流出下端出液口的时间，利用液相色谱测定回收率，测定结果参见表1。

*其中对比例1-2在4分钟后因堵塞没有流动，15分钟后利用负压加压7分钟后使之完全留出。

由此可见，本发明中的磁性固相萃取柱，两片筛板之间填充有磁性吸附剂，所述下筛板为磁性筛板，在与目标分析物相互作用后，磁性材料由于磁力被吸附至下筛板表面堆叠形成磁性材料柱体，提高了分离纯化效果，对于含有痕量目标分析物的样品液，可以提高回收率。固相萃取柱中仅含有磁性吸附剂或磁性筛板，对于含有痕量目标分析物的样品液，均难以保证回收率。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。