具体实施方式

色谱系统设计用于使用树脂的至少一个填充柱来纯化目标产物(例如蛋白质、来自细胞培养/发酵的生物分子、天然提取物)，以创建纯化步骤。在装载与非装载步骤(例如清洗和洗脱)之间切换每个柱。

在图1中，示出配置成使用分离过程来纯化目标产物的生物过程纯化系统10的概述。该生物过程纯化系统包括与细胞培养11、保持12、捕获13、病毒灭活14、精制（polish）15和递送（delivery）16相关的多个步骤。

细胞培养步骤11可以是灌注类型培养，该灌注类型培养包括在灌注培养中连续添加用于细胞生长的养分，并且例如使用交替切向过滤(ATF)过滤器设置通过排放和过滤连续去除产物和废物。该步骤可包括对于活细胞密度(VCD)的过程控制，以及过程中的下一个步骤在VCD达到预定值时开始。可通过适配被馈送给培养的细胞培养介质的成分或者通过直接对培养添加某些成分来控制VCD。备选地，细胞培养具有批类型。

例如通过过滤、离心或另一种技术在无细胞提取过程中利用包含目标产物的样本。

保持步骤12是可选步骤，该步骤取决于过程需要，例如如果过滤器在捕获步骤13之前是联机的话。该步骤可包括对重量的过程控制，以及过程中的下一个步骤在达到预定体积值时或者备选地在某个时间段之后或者在达到预定质量时开始。保持步骤可用于从灌注细胞培养或者从批培养来收集一定体积的过滤进料。

捕获步骤13包括至少一个色谱柱，所述至少一个色谱柱可在捕获步骤之前使过滤器联机。捕获步骤13可包括连续色谱设置，如图2中所图示，该连续色谱设置可例如作为周期逆流色谱来运行，其具有直接地或者经由保持步骤12来自细胞培养步骤11的包含目标产物的样本的连续馈送。捕获步骤包括一个或多个批洗脱，以及使用联机UV传感器的过程控制操控馈送浓度和树脂容量中的变化。下一个步骤在达到预定量值(例如体积、质量或时间)时开始。

在病毒灭活步骤14中，对于病毒灭活的不同选项根据过程需要是可用的。一个选项是要在滞留罐（hold up tank）中使用具有低pH的批模式30-60分钟。该步骤可包括对体积、时间、温度和pH的过程控制。下一个步骤在达到预定时间时开始。

精制步骤15可以是具有连接批步骤的直通处理(STP)或者具有连续装载步骤的连续色谱或者它们的组合。流率被调整成由生产者细胞所要求的灌注速率，这意味着流率通过先前步骤来确定。该步骤可包括对于UV、流量和体积的过程控制，以及下一个步骤在达到预定体积和量时开始，备选地在达到超时时开始。

递送步骤16可包括超过滤步骤之前的病毒去除步骤，例如病毒过滤器。递送步骤可用作来自精制步骤的样本的批添加的浓缩步骤。递送步骤可包括产物的连续或批递送，并且可包括废物的连续或批去除。该步骤可包括对于pH、传导率、吸收率、体积和压力的过程控制，以及在达到预定义环境中的预定产物浓度时实现递送。

自动化层17用于操控用于过程中的下一个步骤的判定点。作为联机传感器和脱机传感器的不同类型的传感器(未示出)被集成到过程流程中，以监测可用于为自动化层17提供可用来操控判定点的数据的不同参数。传感器包括但不限于仅测量流量、VCD、重量、压力、UV、体积、pH、传导率、吸收率等。

应当注意，UV吸收是可被监测以检测所纯化样本的组成的参数的示例。但是，可使用操作在其他频率范围(例如IR、荧光、x射线等)中的其他参数。

捕获步骤13可包括连续色谱设置20(如图2中所图示)或者单柱240(如图4中所图示)。连续色谱通过减少占用面积并且改进生产率来支持过程强化。另外，连续色谱特别适合于不稳定分子的纯化，因为短过程时间帮助确保目标产物的稳定性。

在图2中，包含目标产物的样本经由入口21被馈入连续色谱20中，以及洗脱目标产物在出口22处是可用的。连续色谱20包括多个柱A、B、N，以及每个柱被提供有柱入口23和柱出口24。每个柱的柱入口23和柱出口24被连接到阀系统25，该阀系统25配置成将柱循环地连接到入口21和出口22，以实现目标产物的连续纯化。结合图3a-3c来描述具有三个柱的系统配置的示例。

连续色谱20进一步被提供有缓冲剂入口26和废物出口27，以便能够执行所要求操作。联机传感器28可在每个柱的柱出口24之后被提供，或者被指配给过程流程并且集成到阀系统25中。重要参数(例如UV)被测量，以控制过程，如以下所述。另一个联机传感器28’可在每个柱的柱入口23之前被提供，以便能够直接评估每个柱的性能。联机入口传感器26还可被提供，以监测被馈入连续色谱20中的样本的组成。

连续色谱还可包括脱机传感器29，所述脱机传感器29被设计成从过程来提取材料，并且此后在材料作为废物被处置之前评估所选参数。

连续色谱包括至少二个(例如至少三个)柱，以及结合图3a-3c来描述三个柱(3C)设置中的操作原理。3C设置以两个并行流为特征（feature）：一个用于装载区中的两个柱的装载，以及一个用于非装载步骤，例如第三柱的洗脱和再生。

在图示步骤1的图3a中，柱A和B处于装载区中。柱A能够在没有样本损失的情况下被过载，因为柱B捕捉来自柱A的贯流。以这样的方式，最大化树脂结合容量的利用。

在图示步骤2的图3b中，过载柱A被切换，以及柱B成为第一柱，而柱C成为装载区中的第二柱。过载柱A这时将经受非装载步骤，例如并行工作流程中的洗脱和再生。

在图示步骤3的图3c中，装载区中的过载柱B被切换。这时，柱C成为第一柱，并且柱A成为装载区中的第二柱，而柱B经受并行工作流程中的洗脱和再生。这三个步骤按照循环方式重复进行，直至达到所要求目标产物体积、质量或量(或者直至达到树脂生命期并且柱需要被重新填充或交换)。

图2中所图示的连续色谱设置可利用多于三个柱，并且在四柱(4C)设置中，同样的原理适用。但是，非装载步骤在3C设置中可能变得受到限制，以及非装载步骤能够在两个柱上拆分，并且利用4C设置中的第三流路并行地运行。4C设置允许平衡装载和非装载步骤。更多个柱将引起更灵活的系统，而阀系统25的复杂度变得越来越复杂。但是，一些连续色谱具有十六个或更多个柱。

图4示意示出色谱系统190的一个实施例，该色谱系统190包括两个3路输入阀160和161，其布置成从对于两个系统泵150和151的流体源A1、A2、B1、B2来选择输入流体。色谱系统190可进一步包括：

• 压力传感器200，其用于记录系统泵之后的流路中的系统压力，以及

• 混合器210，其用来确保由泵所供应的流体的适当混合。

这些对应图1中所图示的细胞培养块11，如由虚线110所指示。

该系统进一步包括：

• 注入阀220，其用于将样本注入到流体通路中，

• 柱连接阀230，其用于有选择地连接/断开流体通路中的柱240。

• 柱前（pre-column）压力传感器235和柱后压力传感器236

• 紫外(UV)监测器250，其用于检测来自柱的输出。

• 传导率监测器260，以及

• pH监测器265。

这些对应图1中所图示的捕获块13，如由虚线130所指示。

该系统进一步包括：

• 具有例如连接到馏分收集器280、废物接受器等的两个或更多个输出位置的输出选择阀270，其与图1中的递送块16对应，如由虚线160所指示，以及

• 系统控制器300，其连接到泵和阀以用于控制经过系统的液体流量，并且连接到传感器和监测器以用于监测流量，连接通过点线310来图示，其与图1中的自动化块17对应，如由虚线170所指示。

图4的色谱系统表示可如何设计单柱色谱系统的一般示例，以及其他实施例可具有包括一些组件的两个或更多个组件而潜在地缺少组件的一些组件的不同设计。例如与如图1中所图示的保持12、病毒灭活14和精制15对应的组件。

图5是按照图4的用于液相色谱系统190的简化流程图。在图5中，流路已被拉直，并且一些组件已被去除，以实现更简单视图。在图5中，系统控制器示为仅被连接到泵150、压力传感器200、柱前压力传感器235和柱后压力传感器236，但是它可被连接到如上所述的其他组件。在图5中，该系统包括柱前压力传感器235和柱后压力传感器236两者，由此柱压力由柱前传感器235直接测量，以及通过从柱压力中减去由柱后传感器236所记录的压力来测量增量柱压力。

如以上概述，一些系统没有除了系统压力传感器200之外的压力传感器。图6是这样的液相色谱系统190的简化流程图，其具有用于记录系统压力的一个单压力传感器200。如上所述，这样的系统中的压力控制仅依靠由传感器200的所记录系统压力。图7是按照本发明的一个实施例的液相色谱系统的简化流程图，其中控制器300布置成基于所记录系统压力、流路的特性以及系统中的液体的粘度和流率来估计柱前压力。估计柱前压力可称作图7中通过淡虚线示意示出的“虚拟压力传感器”。

按照一个实施例，虚拟压力信号的计算可基于流道中的压力降的伯努利公式。

流道 ，其中

L = 长度 [mm]

D = 直径 [mm]

Q = 流率 [ml/min]

V = 粘度 [cP]

通过向系统控制器提供流路的长度和直径以及系统中的液体的粘度，它可布置成计算由一直到柱的流路在当前流率下所引起的压力降。在一些系统中，系统压力传感器200与柱240之间的流路的长度和大小可被标准化，使得预定义参数可用于计算。在其他系统中(这是最常见状况)，色谱系统中的组件之间的流路是用户定义的，由此系统的用户必须通过用户界面来输入参数。

按照一个实施例，系统压力传感器200与柱240之间的流路的主要部分可由相同直径的毛细管道来组成，然后流路特性可被估计为管道的总长度，因此从计算中排除来自其他组件(例如阀等)的贡献。在其他实施例中，来自流路中的阀等的贡献被考虑并且可以是系统定义的，而管道等是用户定义的。应当注意，在流路包括不同大小的段(例如不同内径的管道)的情况下，每个段之上的压力降必须被单独计算，并且最终被相加在一起，以提供总压力降。

当一直到柱240的流路中的压力降通过上述计算来估计时，通过从由系统压力传感器200所记录的系统压力中减去压力降来计算虚拟柱前压力。

示例：

如果系统压力为5巴并且流路之上的所计算压力降为2巴，则所计算虚拟柱前压力被估计为3巴。

虚拟压力传感器之后的所有压力贡献将被自动补偿，因为这些将直接影响测量系统压力。因此，例如，如果流量限制器被添加或去除，则测量系统压力将与所计算柱前压力一样发生变化。必须在估计中注意系统压力传感器与柱之间的流路的变化。

按照一个实施例，在粘度不是已知的情况下，控制器可假定使用水，由此能够使用例如下列的已知表达式对不同温度估计粘度：

，

其中，T = 温度 [K]；；；。

在实际状况中，可存在可影响虚拟压力估计的精度的一些因素。如果液体的粘度为未知并且它被假定为水，但是它具有更高粘度，则对于流路的估计值ΔP变得过低。然后对于虚拟压力信号的计算值变得高于实际值，由此压力报警将在实际压力对该柱变得过高之前触发。如果流路中的其他组件(例如混合器、阀等)生成某个背压，则情况也是这样。因此，对于其中粘度低于水的液体，估计将给出比实际压力要低的虚拟柱前压力。但是，这类液体主要用于高压力柱，其中不要求压力信号的高精度，因为大多数这样的柱耐受比它们通常以其被使用的压力要高的压力。按照一个实施例，该系统被布置成通过将相同原理用于柱之后的流路来估计增量柱压力，虚拟柱后压力可被估计并且用来计算虚拟增量柱压力。

如所述，虚拟柱前压力和增量柱压力可用来例如通过相对于预定义或用户定义压力极限监测压力或者通过以预定义柱压力运行色谱系统等来控制色谱系统的操作。

本公开图示一种色谱过程，该色谱过程配置成与至少一个柱一起操作，并且配置用于使用预定义过程来纯化包括目标产物的样本。预定义过程可以是通用过程、验证过程或特殊过程，并且能够由制造商预先定义或者由最终用户来生成。

图9图示适合于制造柱和液相色谱系统的系统中的数据流。如下面更详细描述，柱数据在柱的制造期间被生成，并且被存储在对于色谱系统90可访问的数据库dB中。数据流通过点线来指示，而控制信号通过虚线来指示。

液相色谱系统包括控制器91，该控制器91配置成控制色谱系统的操作以运行预定义过程，检索从数据存储装置dB可访问的柱数据(所述柱数据特定于每个柱)，并且基于柱数据来适配用于每个柱的预定义过程的至少一个过程参数，由此预定义过程适合于每个柱，以得到目标产物并且维持液相色谱系统的性能。

数据存储装置可以是数据库(其被集成在色谱系统中或者从色谱系统外部的源（例如基于云的实现）是可访问的)。另一个备选方案是要将柱数据存储在例如作为存储器芯片的个别柱上，并且经由RFID与色谱系统的通信。

过程参数包括：每个柱之上的压力；进入柱的样本的流量；离开柱的残渣（residue）的流量；和/或样本的已处理体积/时间周期(柱体积/小时)。

按照一些实施例，液相色谱系统配置成与单柱一起操作以用于纯化样本，以及按照一些实施例，液相系统配置成与至少三个柱一起操作以用于样本的连续纯化。

图8图示将柱指配给类型400(又称作系列)的概念。每个个别柱401-1、401-2、401-n在这个示例中属于具有与柱相关的预定生产参数的特定类型400。在这个示例中，生产参数定义所使用柱组件的不同物理性质以及用来制造柱的不同过程性质的范围。

柱包括用于保持树脂和过滤器的器皿（vessel），以及柱组件可包括硬件特定性质、器皿的物理尺寸(例如器皿的高度)、树脂的材料性质(例如粒度和分布)、过滤器的物理性质等。

过程性质涉及柱的制造过程，例如树脂床的高度、压力边界、流量规范（specification）等。树脂床的高度可以是实际高度或者器皿的高度。

生产参数可进一步包括每个柱中的树脂的实际体积。

在一些示例实施例中，液相色谱系统进一步包括传感器92a、92b，所述传感器92a、92b适合于读取传感器参数，其中至少一个过程参数的适配进一步基于传感器读数。在一些实施例中，传感器读数包括下列中的任何：UV、流量和压力。

在一些实施例中，生产参数进一步包括每个柱中的树脂的实际体积。

由系统可访问的数据库可包括对于每个个别柱和/或属于先前在液相色谱系统中用于纯化样本的相同特定类型(即，相同系列)的柱的历史数据。来自控制器的历史数据信息为此目的被存储在数据库中。

图10是图示用于制造用于液相色谱系统的柱的方法的流程图。本公开还包括一种用于制造用于液相色谱系统的柱的方法，所述柱具有入口和出口，并且包括用于保持树脂的器皿。该方法包括：

1)选择(步骤S2)配置成在过程中用于纯化包括目标产物的样本的柱的类型。

2)基于柱的类型来选择(步骤S3)树脂(所述树脂是介质)，所述树脂具有介质性质。介质性质包括预计被用于柱中的介质的测量和计算性质。介质参数被介质制造过程以及制造介质时使用的不同介质组件的容差影响。

3)选择(步骤S4)用于保持树脂的器皿(即，硬件)，所述器皿具有硬件性质。硬件性质包括用来制造柱的不同组件的测量和计算性质，其影响柱的功能，例如物理尺寸(具有容差)和过滤器性质(若被包括的话)。

4)使用基于柱的类型的压力在器皿中填充(步骤S5)树脂以形成树脂床，以建立树脂床的高度。

5)基于介质性质和硬件性质来确定生产参数(步骤S6)以定义用于柱的柱数据，并且将柱数据存储在数据存储装置中，该数据存储装置可供液相色谱系统访问。数据存储装置可被集成在柱中，或者是对于色谱系统可访问的数据库，如上所述。

在一些示例中，柱进一步包括采取被布置在入口与树脂床之间的顶部过滤器形式的硬件，以及该方法进一步包括：基于柱的类型来选择顶部过滤器，所述顶部过滤器具有顶部过滤器性质；以及进一步基于顶部过滤器性质来确定生产参数，以定义柱数据。

在一些示例中，柱进一步包括采取被布置在出口与树脂床之间的底部过滤器形式的硬件，以及该方法进一步包括：基于柱的类型来选择底部过滤器，所述底部过滤器具有底部过滤器性质；以及进一步基于底部过滤器性质来确定生产参数，以定义柱数据。

本公开还包括一种用于液相色谱系统的柱，所述柱具有入口和出口，并且包括用于保持树脂的器皿，其中按照上述方法来制造柱。在图9中图示一种用于制造柱的系统，其中来自系统的输出是柱和柱数据，其被存储在对于色谱系统可访问的数据库dB中。

在一些示例中，柱进一步包括采取配置成存储柱数据的数据存储装置(例如数据芯片)以及配置成将柱数据传递给液相色谱系统的通信装置形式的硬件。

在一些实施例中，通信装置配置成使用RFID与液相色谱系统进行通信。

图11是图示用于控制配置成与至少一个柱一起操作的液相色谱系统的方法的流程图。本公开还包括一种用于控制液相色谱系统的方法，该液相色谱系统配置成与至少一个柱一起操作，并且配置用于使用预定义过程来纯化包括目标产物的样本，其中该方法包括：

A)控制(步骤S12)色谱系统的操作，以运行预定义过程。

B)检索(S13)从数据存储装置可访问的柱数据，所述柱数据特定于每个柱，以及基于柱数据来适配(步骤S15)用于每个柱的预定义过程的至少一个过程参数。

由此预定义过程适合于每个柱，以便从样本得到目标产物并且维持液相色谱系统的性能。

在一些示例中，每个柱具有特定类型，以及数据存储装置包括对于每个柱和/或属于先前在液相色谱系统中用于纯化样本的相同特定类型的柱的历史数据，其中该方法进一步包括基于历史数据来适配预定义过程的至少一个过程参数（步骤S13a）。

在一些示例中，数据存储装置包括与生产每个柱时的生产参数相关的柱数据，所述生产参数包括树脂床的高度、压力边界、流量规范、材料性质、硬件特定性质、过滤器性质和器皿的物理尺寸，其中该方法进一步包括基于生产参数来适配预定义过程的至少一个过程参数（步骤S13b）。

在一些示例中，液相色谱系统进一步包括适合于读取传感器参数的传感器，其中该方法进一步包括进一步基于传感器读数来适配至少一个过程参数(步骤S14a)。传感器读数可包括下列中的任何：UV、流量和压力。

数据存储装置可被选择为数据库，该数据库可被集成在液相色谱系统中。备选方案是要将数据存储装置集成在每个柱中。

除了以上所述之外，填充柱的制备和鉴定还是用来确保纯化过程和最终产物两者的鲁棒性和安全性的重要步骤。柱效率测试在填充床性能的鉴定和监测中起中心作用。即使它不能用作用来预测纯度和回收率（recovery）的单个参数，但它是用来在开始纯化过程之前测试柱和设备性能的快速方式。这个测试还能够用于运行之间，以检查床完整性中的变化。

这个注释提供对柱效率测试背后的理论以及在其中使用的实验测试实践的概述。推荐测试条件，并且论述影响测量效率的关键参数，以便促进鲁棒测试协议的开发。

效率测试是经过柱的示踪物质（tracer substance）的停留时间分布的分析。应用于柱的典型测试信号是脉冲或阶跃信号。为了无干扰地表征色谱柱，示踪物质和洗脱剂条件被选择成使得避免与介质的化学交互和流体流的扰动。所应用的测试信号的最常见类型是脉冲函数。小体积的示踪物质被添加到靠近柱入口的液体流，以及在柱出口处作为色谱峰测量时分析这个脉冲的加宽（broadening）。

柱效率通常根据两个参数来定义：

• 柱之上的峰加宽通过等效数量的理论板(均衡级（stage）)来描述

• 峰对称性通过峰不对称因子A_s来描述

峰加宽通常被描述为板数量N或者等效于理论板高度(HETP)。这个概念等效于串行罐模型，其反映由柱所表示的均衡级的数量。

用于评估脉冲测试(以确定板数量)的广泛使用方法涉及测量最大峰高度的一半处的峰宽度。当应用矩量法时，这种方式是数值曲线积分的备选方案，其中第一矩量是平均数，而第二矩量是保留体积/时间的方差。如图1中概述，针对时间或洗脱体积来绘制脉冲响应，以及半峰高度处的峰宽度被测量并且与洗脱时间或者优选地与最大峰高度处的洗脱体积相关。在最大峰高度处所测量的保留时间或保留体积对应在对称(高斯)峰形状下发现的平均停留时间或体积。用于效率表征的无量纲并且因此方便的参数是减小板高度h。这个参数促进柱效率的比较，而与柱长度和介质的粒径无关。

最佳柱效率通常对应对于生物过程色谱中采用的多孔介质的h ≤ 3的实验确定的减小板高度。当在最佳测试条件下采用柱和系统的优化设置来测试完全填充床时取得这个效率。

在由GE Healthcare所发布的应用注释（application note）28-9372-07 AA中提供柱效率测试的详细说明，通过引用将其完整地结合到本文中。

在本发明的一个实施例中，色谱系统布置成执行自动柱效率测试，以确定诸如h和A_s之类的效率参数，并且进一步向用户提供针对柱效率的指南。这里所提供的自动测试给出用来计算减小板高度的全部可能数据，因为软件将特定参数自动用于给定柱和树脂，以计算柱的效率。这给予用来直接了解所给定柱是否足够良好以供应用使用的可能性。如果不是的话，则将通知用户，使得能够使用更适合的柱。能够应用适当清洁规程，能够重新填充柱，能够由新柱取代该柱，或者能够采取任何其他必要动作。这给出用于液相色谱步骤的更安全和鲁棒规程，因为能够保证柱的效率。

按照一个实施例，色谱系统布置成自动确定诸如减小板高度h和A_s之类的一个或多个效率参数，并且基于结果，指导系统的用户进行相关动作，或者备选地，系统可配置成基于效率参数自动发起一些或全部相关动作。

在一个示例中，系统可配置成自动或半自动发起下列动作的一个或多个，以便改进柱效率：

·当3 < h < 3.5(第1级)时的标准柱清洁规程(例如NaOH 0.5M)

·当3.5 < h < 5(第2级)时的强（intense）柱清洁规程(例如NaOH 1M、酸和/或异丙醇)

·当5 < h < 7(第3级)时的柱重新填充规程

·h < 7(第4级)时取消过程并且指示用户更换树脂

一旦动作完成，系统就优选地配置成自动确定一个或多个效率参数，并且检验改进效率。

在备选实施例中，系统可配置成在未达到预期结果的情况下两次或更多次重复进行上述动作中的一个或多个。该系统可进一步配置成在一个级别的预定尝试之后升级到更高级别。

应当注意，不同级别的上述范围根据树脂类型和柱类型可以是不同的。范围根据其中将使用柱的色谱过程步骤也可以是不同的。例如，与对于中间或精制步骤所制备的柱相比，对于捕获步骤所制备的柱可具有更高h。

色谱系统可被布置成从数据库中的预定义标准数据文件或者从所使用的特定树脂批次（lot）的颗粒大小的测量数据中检索颗粒大小数据以供确定效率参数。批次特定颗粒大小数据可由单独或互连测量单元来确定，或者备选地从包括批次特定颗粒大小数据的数据库——例如基于云的数据库——中检索。

按照一个实施例，自动柱检验进一步包括确定柱增量压力，以检验柱填充性能。在所确定增量压力被确定为过低的情况下，存在用于间隙构建的增加风险，而在增量压力被确定为过高的情况下，可能超出系统压力范围。可从柱数据库和/或系统设定中检索对于增量压力的相关范围。

本公开进一步包括一种包括指令的用于控制液相色谱系统的计算机程序，所述指令在至少一个处理器上执行时使至少一个处理器执行根据上述方法所述的方法。

本公开进一步包括一种携带用于控制如上所限定的液相色谱系统的计算机程序的计算机可读存储介质。