阅读说明：本技术 调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法 (The method that regulation preparation has the hydroxyapatite of superior cell compatibility ) 是由 王友法 陈甲 于 2019-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法,其特征在于,包括以下步骤：步骤1.按照钙磷离子摩尔比为1.5：1,分别配制Ca(NO<Sub>3</Sub>)<Sub>2</Sub>·4H<Sub>2</Sub>O水溶液和(NH<Sub>4</Sub>)<Sub>2</Sub>HPO<Sub>4</Sub>水溶液,并且在Ca(NO<Sub>3</Sub>)<Sub>2</Sub>·4H<Sub>2</Sub>O水溶液中添加小分子氨基酸,氨基酸和钙离子浓度比为4：1或8：1；步骤2.设定滴加混合时的参数,将(NH<Sub>4</Sub>)<Sub>2</Sub>HPO<Sub>4</Sub>和氨基酸的混合水溶液通过蠕动泵缓慢滴加到搅拌中的Ca(NO<Sub>3</Sub>)<Sub>2</Sub>·4H<Sub>2</Sub>O水溶液中；步骤3.将得到的前驱体放入微波消解仪中,设置微波水热参数进行反应；步骤4.将反应后所得到的固体进行离心洗涤,然后冷冻干燥去除多余的水分,得到羟基磷灰石。(The present invention provides a kind of methods that regulation preparation has the hydroxyapatite of superior cell compatibility, which comprises the following steps: step 1. is 1.5:1 according to calcium and phosphorus ions molar ratio, prepares Ca (NO respectively 3 ) 2 ·4H 2 O aqueous solution and (NH 4 ) 2 HPO 4 Aqueous solution, and in Ca (NO 3 ) 2 ·4H 2 Small molecule amino acid is added in O aqueous solution, amino acid and calcium ion concentration ratio are 4:1 or 8:1；Parameter when mixing is added dropwise in step 2. setting, by (NH 4 ) 2 HPO 4 Ca (the NO in stirring is slowly dropped to by peristaltic pump with the mixed aqueous solution of amino acid 3 ) 2 ·4H 2 In O aqueous solution；Obtained presoma is put into microwave dissolver by step 3., and setting microwave hydrothermal parameter is reacted；Obtained solid carries out centrifuge washing after step 4. will react, and then freeze-drying removes extra moisture, obtains hydroxyapatite.)

调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法

技术领域

本发明属于羟基磷灰石制备技术领域，具体涉及调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法。

技术背景

羟基磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)，作为一种广泛存在于动物的骨骼、牙齿中的主要矿物质，是目前在生物医学应用上的首选材料。羟基磷灰石有着良好的理化性能，而影响这些性能的是其晶体本身的表面形貌，尺寸大小，结晶度等。这些因素导致了羟基磷灰石表面性能、力学性能、生物学性能的差异，从而导致了应用方面有所不同。

传统的合成方法有：沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法等。其中化学沉淀法工艺简单，缺点是所合成的晶粒结晶度低，同时合成周期长。溶胶－凝胶法的合成过程简单、成本低。但影响溶胶－凝胶法制备羟基磷灰石的因素很多，难以得到结晶良好、颗粒均匀、纯度高且形状尺寸可控的颗粒。水热法制备的晶粒结晶度高且可调控，而所要求的高温高压条件使其难以规模化生产。并且，这些现有技术制备的羟基磷灰石仍然存在一定生物毒性，会对人体造成额外的副作用，物化性质和细胞相容性有待提高。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法。

本发明为了实现上述目的，采用了以下方案：

本发明提供一种调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.按照钙磷离子摩尔比为1.5：1，分别配制Ca(NO₃)₂·4H₂O水溶液和(NH₄)₂HPO₄水溶液，并且在Ca(NO₃)₂·4H₂O水溶液中添加小分子氨基酸，氨基酸和钙离子浓度比为4：1或8：1；步骤2.设定滴加混合时的参数，将(NH₄)₂HPO₄和氨基酸的混合水溶液通过蠕动泵缓慢滴加到搅拌中的Ca(NO₃)₂·4H₂O水溶液中；步骤3.将得到的前驱体放入微波消解仪中，设置微波水热参数进行反应；步骤4.将反应后所得到的固体进行离心洗涤，然后冷冻干燥去除多余的水分，得到羟基磷灰石。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：在步骤1中，溶液中添加的小分子氨基酸为甘氨酸或丝氨酸，最佳为甘氨酸。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：在步骤1中，氨基酸和钙离子浓度比为8：1。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：在步骤2中，蠕动泵的速率设置为20mL/min。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：在步骤2滴加的过程中，用氨水调节反应体系中的pH为9。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：在步骤3中，微波水热反应的反应参数为：微波功率为300W，10℃/min从室温升至160℃，在160℃反应40min，然后随炉冷却。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：在步骤4中，离心转速是8000rpm，时间是3min，用去离子水离心洗涤3次。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：在步骤4中，冷冻干燥处理为：将离心洗涤后的产物在-20℃的冰箱中冷冻12h，再将放入-45℃的冷冻干燥机中干燥12h。

优选地，本发明提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法还可以具有以下特征：制备得到的羟基磷灰石的长度为50～130nm，宽度为20～30nm。

发明的作用与效果

本发明所提供的制备方法，使用微波热水法，并且采用氨基酸作为调控剂，制备得到羟基磷灰石，整个过程操作简单，制备周期短，并且所得的产物羟基磷灰石的相纯度和结晶度高，分散性良好；而且产物羟基磷灰石粉体对细胞增殖与分化具有积极作用，最高可达约为纯HA的2.39倍，具有优良的细胞相容性以及可降解性。

附图说明

图1为本发明实施例中制得的羟基磷灰石的方法的XRD(X射线衍射分析)图；

图2为本发明实施例中制得的羟基磷灰石的透射电镜微观形貌图，其中(a)为HAG4的形貌图，(b)为HAG8的形貌图，(c)为HAS4的形貌图，(d)为HAS8的形貌图；

图3为本发明实施例中各组浸提液与MC3T3-11细胞培养所得的细胞毒性测试图；

图4为本发明实施例中各组浸提液与MC3T3-11细胞培养1，3，5天后的细胞形貌图；

在上述图中，HAG4、HAG8、HAS4、HAS8依次对应实施例一至四所制得的产物，control组是不加材料的空白组，HA是没有经过调控合成的纯的羟基磷灰石组。

具体实施方式

以下结合附图对本发明涉及的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法的具体实施方案进行详细地说明。

<实施例一>

如图1所示，本实施例一所提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法为：

将3.5423g四水硝酸钙和4.5042g甘氨酸溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；将1.3206g磷酸氢二铵溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；用蠕动泵将磷酸氢二铵以20mL/min的速度缓慢滴入到搅拌中的四水硝酸钙和甘氨酸的混合溶液中去，保持温度为25℃，用氨水调节整个滴加的过程的pH＝9，在10min之内滴完，并在滴完后继续搅拌20min使得溶液体系均匀。将得到的前驱体倒入微波反应釜中，设置微波消解仪的瓦数为300W，温度为160℃，时间为40min。微波水热反应结束后，倒入50ml离心管中，用去离子水进行离心洗涤3次，设置离心机的转速为8000rpm，时间为3min，洗涤多余的铵根离子和甘氨酸。洗涤后放入-20℃的冰箱内冷冻12h；然后取出，放入-45℃冷冻干燥箱中冷冻干燥12h去除水分，得到产物羟基磷灰石粉体。将该产物标记为HAG4。

<实施例二>

如图1所示，本实施例二所提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法为：

将3.5423g四水硝酸钙和9.0084g甘氨酸溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；将1.3206g磷酸氢二铵溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；用蠕动泵将磷酸氢二铵以20mL/min的速度缓慢滴入到搅拌中的四水硝酸钙和甘氨酸的混合溶液中去，保持温度为25℃，用氨水调节整个滴加的过程的PH＝9，在10min之内滴完，并在滴完后继续搅拌20min使得溶液体系均匀。将得到的前驱体倒入微波反应釜中，设置微波消解仪的瓦数为300w，温度为160℃，时间为40min。微波水热反应结束后，倒入50ml离心管中，用去离子水进行离心洗涤3次，设置离心机的转速为8000rpm，时间为3min，洗涤多余的铵根离子和甘氨酸。洗涤后放入-20℃的冰箱内冷冻12h；然后取出，放入-45℃冷冻干燥箱中冷冻干燥12h去除水分，得到产物羟基磷灰石粉体。将该产物标记为HAG8。

<实施例三>

本实施例三所提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法为：

将3.5423g四水硝酸钙和6.3054g丝氨酸溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；将1.3206g磷酸氢二铵溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；用蠕动泵将磷酸氢二铵以20mL/min的速度缓慢滴入到搅拌中的四水硝酸钙和丝氨酸的混合溶液中去，保持温度为25℃，用氨水调节整个滴加的过程的PH＝9，在10min之内滴完，并在滴完后继续搅拌20min使得溶液体系均匀。将得到的前驱体倒入微波反应釜中，设置微波消解仪的瓦数为300w，温度为160℃，时间为40min。微波水热反应结束后，倒入50ml离心管中，用去离子水进行离心洗涤3次，设置离心机的转速为8000rpm，时间为3min，洗涤多余的铵根离子和丝氨酸。洗涤后放入-20℃的冰箱内冷冻12h；然后取出，放入-45℃冷冻干燥箱中冷冻干燥12h去除水分，得到产物羟基磷灰石粉体。将该产物标记为HAS4。

<实施例四>

如图1所示，本实施例四所提供的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法为：

将3.5423g四水硝酸钙和12.6108g丝氨酸溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；将1.3206g磷酸氢二铵溶解于50ml去离子水中，搅拌10分钟；用蠕动泵将磷酸氢二铵以20mL/min的速度缓慢滴入到搅拌中的四水硝酸钙和丝氨酸的混合溶液中去，保持温度为25℃，用氨水调节整个滴加的过程的PH＝9，在10min之内滴完，并在滴完后继续搅拌20min使得溶液体系均匀。将得到的前驱体倒入微波反应釜中，设置微波消解仪的瓦数为300w，温度为160℃，时间为40min。微波水热反应结束后，倒入50ml离心管中，用去离子水进行离心洗涤3次，设置离心机的转速为8000rpm，时间为3min，洗涤多余的铵根离子和丝氨酸。洗涤后放入-20℃的冰箱内冷冻12h；然后取出，放入-45℃冷冻干燥箱中冷冻干燥12h去除水分，得到羟基磷灰石粉体。将该产物标记为HAS8。

取实施例一至四制得的产物依次作为样品HAG4、HAG8、HAS4、HAS8进行性能测试：

如图1所示，通过X射线衍射图可知，实施例一至四所制得的产物的衍射峰与羟基磷灰石PDF标准卡片JCPDS(09-0432)相匹配，结晶度和纯度良好。添加氨基酸调控后，HAG8与HAS8相对于HAG4与HAS4的衍射峰变宽，表明晶体的结晶度变小。

如图2所示，从产物进行投射电镜图可以看出，实施例一至四所制得的产物都具有分散性的晶粒呈明显的棒状形貌。且随着加入前驱体中的氨基酸的物质的量增大，晶粒由HAG4与HAS4的长棒状转变成HAG8与HAS8的短棒状与米粒状。对于两种不同的氨基酸，丝氨酸比甘氨酸缩短晶体的长径比的效果更加明显。

将实施例一至四所制得的产物的浸提液与MC3T3-11细胞共培养，用CCK8法测试其1，3，5天的吸光度，即OD值，OD值与细胞的存活率成正相关。如图3所示，与纯羟基磷灰石相比，氨基酸调控的羟基磷灰石细胞存活率明显高于无HA的空白组(control组)和纯HA的组别，且HAG8组的OD值约为纯HA组别的2.39倍，呈现出良好的细胞相容性。

如图4所示，用荧光显微镜观察细胞在1，3，5天的形貌，结果与细胞毒性测试一致，HAG4与HAG8组的细胞密度明显高于其余组别。

以上实施例仅仅是对本发明技术方案所做的举例说明。本发明所涉及的调控制备具有优异细胞相容性的羟基磷灰石的方法并不仅仅限定于在以上实施例中所描述的内容，而是以权利要求所限定的范围为准。本发明所属领域技术人员在该实施例的基础上所做的任何修改或补充或等效替换，都在本发明的权利要求所要求保护的范围内。