阅读说明：本技术 一种基于液体弹珠的等电聚焦装置及方法 (A kind of isoelectric focusing device and method based on liquid hoodle ) 是由 李菲 牛纪成 李晓光 徐峰 于 2019-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于液体弹珠的等电聚焦装置及方法：用疏水性SiO<Sub>2</Sub>纳米溶胶涂覆培养皿表面,自然晾干；将蛋白质样品、载体两性电解质及羟乙基纤维素的混合溶液滴加在培养皿表面,滚动液滴使疏水性SiO<Sub>2</Sub>纳米颗粒包裹在液滴表面形成液体弹珠,吸出液体弹珠内部分液体后将液体弹珠塑型成柱状分离通道,然后在柱状分离通道的两端分别构建包含酸性溶液、碱性溶液的液体弹珠,最后将柱状分离通道与两端的酸、碱溶液连通并施加直流电压,使蛋白质样品内各组分通过等电聚焦分离。本发明具有成本低、装置小型化、样品制备量大和分离组分易收集的特点。(The invention discloses a kind of isoelectric focusing device and methods based on liquid hoodle: using hydrophobicity SiO 2 Nano sol coats culture dish surface, naturally dry；The mixed solution of protein example, carrier ampholyte and hydroxyethyl cellulose is added dropwise on culture dish surface, rolling drop makes hydrophobicity SiO 2 Nano particle is wrapped in droplet surface and forms liquid hoodle, by liquid hoodle plastotype at column split tunnel after sucking liquid hoodle inner part liquid, then the liquid hoodle comprising acid solution, alkaline solution is constructed respectively at the both ends of column split tunnel, column split tunnel is finally connected to the acid at both ends, aqueous slkali and is applied DC voltage, separates each component in protein example by isoelectric focusing.The present invention has the characteristics that at low cost, device minimizes, sample preparation amount is big and separation component easily collecting.)

一种基于液体弹珠的等电聚焦装置及方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域的蛋白质预处理，具体涉及一种基于液体弹珠的等电聚焦装置及方法。

背景技术

等电聚焦是一种基于蛋白质的等电点分离、富集蛋白质的电泳技术，具有分离效率高的优点。等电聚焦技术应用广泛，在蛋白质分析中发挥着举足轻重的作用；既是蛋白质制备和蛋白质等电点表征的标准技术，又可与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳或者质谱结合，用于复杂蛋白质分析及蛋白质组学研究。

固定化pH梯度胶条(Immobilized pH gradient,IPG)和玻璃/石英毛细管是目前等电聚焦应用最广泛的基体。固定化pH梯度胶条利用一系列弱酸性及弱碱性丙烯酰胺衍生物与丙烯酰胺共价聚合形成固定的、不随环境变化的pH梯度。毛细管等电聚焦通常需用商品化载体两性电解质在溶液中形成pH梯度。施加电压后，由于蛋白质在不同pH环境下所带电荷不同，在电场力的驱动下蛋白质迁移到各自的等电点位置(此时蛋白质不带电荷)，发生聚焦。

尽管IPG等电聚焦和毛细管等电聚焦都具有较高的分离效率，但是涉及到蛋白质样品制备时，凝胶中蛋白质组分的提取问题和毛细管的低样品容量问题，使上述两种等电聚焦技术面临挑战。基于上述问题，适合用于蛋白质样品制备的Off-gel等电聚焦和基于微流控芯片的自由流等电聚焦技术得到发展。但前者分离时间久，后者需要制作结构复杂的微流控芯片而且样品制备量小，使蛋白质样品制备成本提高。

目前，尚未见到利用液体弹珠实现等电聚焦的装置及方法报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于液体弹珠的等电聚焦装置及方法，解决传统等电聚焦技术样品容量低及分离后组分不易收集的问题。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于液体弹珠的等电聚焦装置，该等电聚焦装置包括分离通道及电源加载模块，所述分离通道选自塑型为柱状(直线型)或其他形状类型的包含(即包裹有)第一溶液的液体弹珠，电源加载模块包括与分离通道一端相连的包含碱性溶液的液体弹珠及与分离通道另一端相连的包含酸性溶液的液体弹珠，所述第一溶液包括载体两性电解质和增粘剂。

优选的，所述电源加载模块还包括自所述包含碱性溶液的液体弹珠和包含酸性溶液的液体弹珠内分别引出的用于连接直流电源的引线(其中，碱性溶液连接直流电源负极，酸性溶液连接直流电源正极)。

优选的，所述包含碱性溶液的液体弹珠和包含酸性溶液的液体弹珠通过进行塑型控制各自所含溶液的液面位于所述分离通道所含溶液的液面以下(例如，使液面高度大致相同)，若酸性溶液、碱性溶液的液面高于分离通道的液面，则酸性溶液、碱性溶液更容易流向分离通道，从而影响等电聚焦分离效果。

优选的，所述第一溶液还包括待分离的若干种蛋白质组分，从而形成蛋白质样品溶液。

一种基于液体弹珠的等电聚焦方法，该等电聚焦方法包括以下步骤：

1)将包含蛋白质样品溶液的液体弹珠塑型成分离通道(例如，柱状分离通道)，所述蛋白质样品溶液包括载体两性电解质、增粘剂和待分离的若干种蛋白质组分；

2)将分离通道的一端与经过塑型的包含碱性溶液的液体弹珠相连，将分离通道的另一端与经过塑型的包含酸性溶液的液体弹珠相连，并且所述包含碱性溶液的液体弹珠和包含酸性溶液的液体弹珠各自所含溶液的液面位于所述分离通道所含溶液的液面以下；

3)在与所述分离通道两端对应连通的酸性溶液及碱性溶液之间施加直流电压，使所述蛋白质样品溶液内的蛋白质组分通过等电聚焦分离并按照所述分离通道的pH梯度分布在该分离通道中的对应位置处。

优选的，所述液体弹珠的制备方法包括以下步骤：在培养皿等容器的平整底面上涂覆疏水性SiO₂纳米溶胶，待该溶胶干燥(例如，自然晾干)后得到疏水性SiO₂纳米颗粒涂层，将相应溶液(蛋白质样品溶液、碱性溶液或酸性溶液，溶剂可以为水)滴加在该涂层表面上，然后通过晃动所述容器，使滴加后的溶液(液滴)在所述涂层表面滚动(滚动中疏水性SiO₂纳米颗粒包裹在液滴表面形成一层薄膜)，得到包含相应溶液的液体弹珠。

优选的，所述塑型包括以下步骤：从包含相应溶液的液体弹珠内吸出部分溶液(按照以上方法制备的液体弹珠，其位于液滴表面的单层纳米颗粒经过吸出部分溶液后变为了多层，从而使液体弹珠可进行塑型)，然后用疏水性物体(例如，聚乙烯滴管)对所述液体弹珠进行刻画(例如，将疏水性物体端部伸入液体弹珠内并参照预定形状进行移动)，使液体弹珠改变形状。通过塑型可控制液面高度，例如，当原溶液体积及吸出溶液体积均相同时，由于各液体弹珠覆盖面积可以通过塑型保持大致相同，因此，经过塑型后的形状不同的液体弹珠可以具有大致相同的液面高度。

优选的，所述分离通道的长度为1～20cm，体积为0.1mL～2mL。

优选的，所述增粘剂选自羟乙基纤维素(粘度范围2600～3300mpa·s，25℃)，所述分离通道内的蛋白质样品溶液中含有质量分数0.1％～1％的羟乙基纤维素。

优选的，所述分离通道内的蛋白质样品溶液中含有质量分数0.5％～4％的载体两性电解质，载体两性电解质的pH分布在一定范围内。

优选的，所述酸性溶液选自浓度为1～20mM的磷酸(H₃PO₄)溶液，碱性溶液选自浓度为1～20mM的氢氧化钠(NaOH)溶液。

优选的，所述分离通道两端的直流电压生成的电场强度为10～50V/cm。

优选的，所述等电聚焦方法还包括以下步骤：所述蛋白质组分分离后，分割分离通道的对应分布有分离后蛋白质组分的部分，形成含有对应蛋白质组分的若干个液体弹珠，然后通过吸取或萃取的方式从分割得到的液体弹珠中分别收集分离后的对应蛋白质组分。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过对液体弹珠塑型形成蛋白组分的分离通道，通过引入增粘剂(例如，羟乙基纤维素)，在分离通道内实现利用等电聚焦对蛋白质组分进行高效分离，不仅可分离的蛋白质样品容量高，分离能力强(可分离同种蛋白不同异构体组分)，而且分离后的蛋白质组分容易提取，具有成本低、装置小型化、样品制备量大和分离组分易收集的特点。

本发明通过对液体弹珠塑型，可以在形成分离通道中同时实现蛋白质样品的进样及控制样品容量，通过引入增粘剂(例如，羟乙基纤维素)，在一定长度(体积)的分离通道内经载体两性电解质和两端(酸、碱溶液)一定电场强度的直流电压作用下，可形成分离不同等电点的蛋白质组分的pH梯度泳道，电压作用时间不超过50分钟，不仅分离速度快、样品容量高，且分离组分易收集，具有较高的分离效率和能力。

附图说明

图1为液体弹珠等电聚焦装置构建示意图(a)及其结构原理图(b)。

图2为羟乙基纤维素浓度和电场强度对等电聚焦效果的影响示意图。

图3为分离通道长度对等电聚焦效果的影响示意图。

图4为基于液体弹珠等电聚焦分离多种蛋白组分的效果图(含羟乙基纤维素)。

图5为表征分离通道在电场作用下的pH梯度的取样图。

图6为图5的取样结果所对应的pH梯度曲线。

图7为直接吸取收集蛋白组分的示意图。

图8为萃取收集蛋白组分的示意图。

图9为基于液体弹珠等电聚焦分离多种蛋白组分的效果图(无羟乙基纤维素)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

(一)利用液体弹珠构建等电聚焦装置

如图1a所示，(1)将疏水性SiO₂纳米溶胶涂覆在培养皿表面；(2)待涂覆的疏水性SiO₂纳米溶胶自然晾干后滴加蛋白质样品溶液，形成液滴，该蛋白质样品溶液内含若干种蛋白质组分、载体两性电解质和羟乙基纤维素；(3)滚动液滴，使疏水性SiO₂纳米颗粒包裹在液滴表面形成液体弹珠，吸取该液体弹珠内的部分溶液后得到可塑型的液体弹珠；(4)将液体弹珠塑型成5cm长柱状分离通道；(5)在柱状分离通道两端外侧分别滴加酸性溶液和碱性溶液，所述酸性溶液选用浓度为1～20mM的H₃PO₄溶液，碱性溶液选用浓度为1～20mM的NaOH溶液，按照同样方式获得分别包含酸性溶液、碱性溶液的液体弹珠；(6)对包含碱性溶液和酸性溶液的液体弹珠塑型，然后通过向右、向左分别推动包含碱性溶液、酸性溶液的液体弹珠，使柱状分离通道与其对应端的液体弹珠接触，随着液体弹珠间接触表面的膜层发生融合，相应液体弹珠所含酸性溶液、碱性溶液即可与分离通道对应端部连通(图1b)，从而组装成等电聚焦溶液体系。本发明通过在样品溶液中添加羟乙基纤维素，使样品溶液粘度增大，导致柱状分离通道内样品溶液流动性降低，同时，通过控制液面相对高度(例如，大致相同)，即可使得样品溶液与两端的酸、碱溶液的相互流动对蛋白组分分离的影响降到最低；(7)将电源负极(Cathode)接入位于柱状分离通道一端的碱性溶液，电源正极(Anode)接入位于柱状分离通道另一端的酸性溶液，组成电流回路，以施加直流电压。

(二)装置工作条件优化

(1)羟乙基纤维素浓度(HEC concentration)和电场强度优化

实验条件：以牛血红蛋白为蛋白质样品，配制浓度为0.2mg/L牛血红蛋白溶液，在该溶液中添加终浓度2％(质量分数)的载体两性电解质(pH 3-10)及一定量的羟乙基纤维素，得蛋白质样品溶液。取1000μL蛋白质样品溶液形成液体弹珠，从液体弹珠内吸取500μL蛋白质样品溶液，将剩余500μL蛋白质样品溶液(液体弹珠)塑型成5cm长的柱状分离通道，柱状分离通道两端分别连通10mM的H₃PO₄溶液和10mM的NaOH溶液。

以牛血红蛋白两种异构体之间的分离度(Separation resolution)为评价指标，通过实验探究了羟乙基纤维素浓度(0～1.0％)和电场强度(直流电压在柱状分离通道产生的电场强度为10V/cm～40V/cm)对等电聚焦效果的影响。实验结果：电场强度25V/cm、羟乙基纤维素终浓度0.75％(质量分数)为最优条件，参见图2。

(2)分离通道长度优化

实验条件：配制浓度为0.2mg/L牛血红蛋白溶液，在该溶液中添加2％载体两性电解质(pH 3-10)和0.75％羟乙基纤维素，得蛋白质样品溶液。保持分离通道横截面积(粗细)不变的情况下，将不同体积的蛋白质样品溶液(300μL、400μL、500μL、600μL、700μL)塑型成不同长度(3～7cm)的柱状分离通道，柱状分离通道两端分别连通10mM的H₃PO₄溶液和10mM的NaOH溶液。电场强度为25V/cm。

以牛血红蛋白两种异构体之间的分离度为评价指标，通过实验探究了分离通道长度对等电聚焦效果的影响。实验结果：柱状分离通道长度5cm为最优实验条件，参见图3。

(三)利用等电聚焦装置分离多种蛋白质

配制浓度皆为0.5mg/L的藻蓝蛋白(蓝色，可参考的等电点包括4.75)、牛血红蛋白(黄色，可参考的等电点包括6.8)和细胞色素C(红色，可参考的等电点包括9.6)混合溶液，在该溶液中添加2％载体两性电解质(pH 3-10)和0.75％羟乙基纤维素，得蛋白质样品溶液。将500μL蛋白质样品溶液塑型成5cm长的柱状分离通道，柱状分离通道两端分别连通10mM的H₃PO₄溶液和10mM的NaOH溶液。装置构建完成后以120V恒压直流电源供电，电场强度25V/cm。

如图4所示，在直流电压作用40分钟后，藻蓝蛋白、牛血红蛋白和细胞色素C在柱状分离通道内得到了有效分离并在通道内不同位置处形成聚焦条带；其中，在对应位置处可观测到藻蓝蛋白及牛血红蛋白的不同异构体所形成的不同条带。

(四)以精密pH试纸表征分离通道在直流电压作用下的pH梯度

以仅含2％载体两性电解质(pH 3-10)和0.75％羟乙基纤维素的水溶液作为样品，将样品500μL塑型成5cm长的柱状分离通道，柱状分离通道两端分别连通10mM的H₃PO₄溶液和10mM的NaOH溶液。装置构建完成后以120V恒压直流电源供电。参照(三)完成等电聚焦所需的直流电压加载，结束后将柱状分离通道用疏水处理后的刀片平均切成10段，将精密pH试纸直接***切割后生成的各液体弹珠(如图5所示)检测pH值。

如图6所示，pH值检测结果表明柱状分离通道内形成了从正极加载一端到负极加载一端的逐渐升高的pH梯度。图4所示蛋白组分在柱状分离通道内的位置与相应位置处的pH符合等电聚焦原理。

(五)从液体弹珠内收集分离后的蛋白质组分

本发明将包裹蛋白质样品溶液的液体弹珠塑型成柱状分离通道，然后在柱状分离通道的两端分别构建包含酸性溶液和碱性溶液的液体弹珠，最后将柱状分离通道与两端酸、碱溶液连通并施加直流电压，即可实现对蛋白质样品的等电聚焦，使得各蛋白质组分相互分离。

在从分割后的液体弹珠内收集蛋白质组分时，可采用以下2种方式：以收集液体弹珠内1mL的浓度为1mg/mL的藻蓝蛋白为参照，第一种方式下，可以直接将移液器枪头***液体弹珠内部吸取蛋白质样品溶液，如图7所示；第二种方式下，可以用有机试剂(例如，乙酸乙酯)萃取去除包裹蛋白质溶液的SiO₂纳米颗粒，实现蛋白组分收集，如图8所示。

实施例2

本实施例为柱状分离通道内无羟乙基纤维素下的等电聚焦效果对比实验。

实验条件：配制浓度皆为0.5mg/L的藻蓝蛋白、牛血红蛋白混合溶液，在该溶液中添加2％载体两性电解质(pH 3-10)，得蛋白质样品溶液。将500μL蛋白质样品溶液塑型成5cm长的柱状分离通道，柱状分离通道两端分别连通10mM的H₃PO₄溶液和10mM的NaOH溶液。装置构建完成后以120V恒压直流电源供电。

实验结果：参见图9，藻蓝蛋白和牛血红蛋白在柱状分离通道内都分布在很宽的范围内，无法实现等电聚焦分离，原因在于柱状分离通道内未在直流电压及两端酸、碱溶液存在情况下形成pH梯度。尽管图2中显示羟乙基纤维素浓度为0.25％时，无法对牛血红蛋白不同异构体进行分离，但牛血红蛋白已经可以实现等电聚焦分离。