阅读说明：本技术 棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法 (The culture medium and method of field run plant are generated in Cotton Transformation ) 是由 罗晓丽 肖娟丽 张安红 王志安 刘传亮 马丹 孙瑞斌 刘志红 王少辉 于 2018-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法,通过使用无激素的增殖培养基对诱导筛选培养后的愈伤组织进行增殖培养,缩短胚性愈伤组织继代培养时间,增加胚性愈伤组织继代培养透气性,提高分化培养基固化剂含量,胚状体形成后降低培养基中糖含量,进而保证正常苗的产生率达90％以上。(The invention discloses culture mediums and method that field run plant is generated in Cotton Transformation, Multiplying culture is carried out to the callus after induction screening and culturing by using the proliferated culture medium of no hormone, shorten the embryo callus squamous subculture time, increase embryo callus squamous subculture gas permeability, improve differential medium curing agent content, embryoid reduces sugared content in culture medium after being formed, and then guarantees the generation rate of field run plant up to 90% or more.)

棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法

技术领域

本发明涉及技术领域，更具体的说是涉及棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，然而其种植过程中容易遭受严重病虫害，进而使得每年皮棉产量损失达总产的10％-20％。

随着生物工程技术的发展，研究人员将许多有益的农艺性状、抗病虫和抗逆等性状转化到棉花中，以提高其产量和品质，增加抗虫性、抗病性、抗除草剂和抗逆性，从而提高棉花的种植效率，降低成本，并减轻环境污染。农杆菌介导转化法可以高效地将外源基因整合到棉花基因组中，而外源基因的稳定遗传和高效表达必须以组织培养为基础。棉花体细胞胚发生和再生过程中常伴随着大量的畸形胚和畸形苗，尤其常出现组培苗玻璃化、半玻璃化的现象，这些问题已经成为棉花遗传转化、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。

因此，如何减少棉花遗传转化过程中畸形苗的产生是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了棉花遗传转化中产生正常苗的培养基及方法，通过本发明培养基及培养方法，可使正常苗的发生率达90％以上。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

棉花遗传转化中产生正常苗的培养基，所述培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基包括如下组分：维生素B18-12mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel2.8-3.0g/L和无机盐，pH 6.8；其中，所述无机盐为MS培养基中的无机盐，并且无机盐中的硝酸钾浓度加倍。

优选地，所述培养基还包括分化培养基，所述分化培养基以所述增殖培养基为基础，去掉无机盐中的硝酸铵成分，添加天冬素0.45-0.55g/L，谷氨酰铵0.8-1.2g/L，并且Phytagel浓度为3.5-3.9g/L，葡萄糖浓度为20-25g/L。

优选地，所述培养基还包括成苗培养基，所述成苗培养基以所述分化培养基为基础，并且Phytagel浓度为3.2-3.3g/L，葡萄糖浓度为15-25g/L。

棉花遗传转化中产生正常苗的培养方法，包括以下方法的任意一种或几种：

(1)使用无激素的增殖培养基对诱导筛选培养后的愈伤组织进行增殖培养。

(2)缩短胚性愈伤组织继代培养时间。

(3)增加胚性愈伤组织继代培养透气性。

(4)提高分化培养基固化剂含量。

(5)胚状体形成后降低培养基中糖含量。

二次诱导筛选培养后，将愈伤组织转入增殖培养基时即时抽掉激素可减少畸形苗的数量。胚性愈伤组织在分化培养基上继代培养时间过长会出现愈伤组织褐化死亡和后期畸形苗增加的现象，因此，对胚性愈伤组织继代培养时间进行调整，缩短胚性愈伤组织从体细胞成熟到出苗的时间，可减少褐化死亡和畸形苗的发生。此外，胚性愈伤组织继代培养过程中增加透气性、提高分化培养基固化剂含量，胚状体形成后降低培养基中糖含量均可减少玻璃化、半玻璃化畸形苗的产生。

棉花遗传转化中产生正常苗的培养方法，包括以下步骤：

S1.培育无菌苗，取无菌苗下胚轴切段；

S2.制备浸染液；

S3.使用浸染液侵染下胚轴切段，进行共培养；

S4.对共培养后的下胚轴切段进行诱导筛选培养，获得愈伤组织；

S5.使用无激素的增殖培养基对诱导筛选培养后的愈伤组织进行增殖培养，至愈伤组织分化，形成胚性愈伤组织；

S6.将胚性愈伤组织转入分化培养基进行透气培养，10-15d继代一次，连续继代3-5次直至出现胚状体；

S7.胚状体形成后降低培养基中糖含量，继续继代培养，得到再生植株。

优选地，所述S3具体步骤如下：

使用浸染液浸染下胚轴切段5-10min，将浸染后的下胚轴切段放入共培养培养基上，22-24℃暗培养48h；

所述共培养培养基以所述增殖培养基为基础，添加2,4-D 0.08-0.12mg/L，KT0.08-0.12mg/L。

优选地，所述S4具体步骤如下：

S41.经共培养后的下胚轴段放入第一筛选培养基中，培养2个月，获得愈伤组织；

S42.直径1-2cm的愈伤组织转入第二筛选培养基中二次筛选培养1个月；小于1cm的愈伤组织再次转入第一筛选培养基中二次诱导筛选培养1个月；

所述第一筛选培养基以所述增殖培养基为基础，添加2,4-D 0.08-0.12mg/L，KT0.08-0.12mg/L，卡那霉素90-110mg/L，头孢霉素450-550mg/L；

所述第二筛选培养基以所述增殖培养基为基础，添加卡那霉素90-110mg/L，头孢霉素450-550mg/L。

优选地，所述S5中25d继代一次，连续继代2-3次，直到愈伤组织分化。

优选地，所述S7中再生植株生长至5-8cm后即可作为接穗嫁接到砧木苗上。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开了棉花遗传转化中产生正常苗的培养基，通过对不同培养期培养基中激素、固化剂、糖分等成分的调整降低畸形苗的产生率。进一步地，本申请还公开了棉花遗传转化中产生正常苗的方法，通过对不同培养期培养基、透气性、培养时间的调整使正常苗的产生率达90％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为筛选培养基M3中第一次诱导筛选培养1个月状态图；

图2附图为筛选培养基M3中第一次诱导筛选培养2个月状态图；

图3附图为筛选培养基M3中第二次诱导筛选培养1个月状态图；

图4附图为筛选培养基M4中第二次筛选培养1个月状态图；

图5附图为增殖培养基M1中第一次增殖继代；

图6附图为增殖培养基M1中第二次增殖继代；

图7附图为增殖培养基M1中第三次增殖继代；

图8附图为透气培养；

图9附图为分化培养基M5中第一次分化继代；

图10附图为分化培养基M5中第二次分化继代；

图11附图为分化培养基M5中第三次分化继代；

图12附图为分化培养基M5中第四次分化继代；

图13附图为分化培养基M6中的胚状体培养；

图14附图为分化培养基M6中的胚状体培养；

图15附图为成苗培养基M7中的成苗培养；

图16附图为成苗培养基M7中的成苗培养；

图17附图为本发明培养得到的正常苗；

图18附图为提高固化剂含量后的胚性愈伤组织；

图19附图为提高固化剂含量后的胚状体；

图20附图为未提高固化剂含量所获得的畸形苗；

图21附图为不同继代时间对胚性愈伤组织植株再生的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

试验棉花材料：选择体细胞胚胎发生高的棉花品种：冀合713、珂字312作为无菌苗培育的种子。试验所需培养基如表1。

表1

S1.培育无菌苗：

取各品种的种子，硫酸脱绒，用70％酒精浸泡1-2min，弃去酒精，以无菌水冲洗1次；再放入15％过氧化氢消毒4h，无菌水冲洗3次，然后在26-30℃下无菌水浸泡24h。

待种子萌动露白后在无菌条件下剥去种子种皮，将种仁接种到表1所示的M0培养基上，26-29℃暗培养4d后于2000lx光照，光照时间12h下再培养1d；经过4天暗培养加1天光培养后，无菌苗可以取用,将其下胚轴中部切为5-7mm大小切段作为转化受体的外植体材料。

S2.制备浸染液：

分别挑取携带Bt抗虫基因的农杆菌菌落接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，当OD600值0.3-0.7时备用。将培养过夜的农杆菌培养液稀释数百倍，在含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB固体培养基上划单菌落，28℃条件下培养24h保存，每隔2个月继代活化一次。

转化前挑取单菌落，接种到LB液体培养基中(含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)，于26-28℃振荡培养(180-200rpm)过夜(约24h)至对数生长期(OD600值在0.3-0.5左右为宜，肉眼观察利福平的红色正好褪去，混合单克隆)。

将培养至对数生长期的农杆菌菌液用LB稀释100倍，加入200mg/L的乙酰丁香酮(AS)，26-28℃振荡培养(180-200rpm)0.5-1.0小时备用。

S3.外植体浸染：

用制备好的浸染液浸染切好的下胚轴切段5-10min，然后取出下胚轴切段，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放入共培养培养基M2上，下胚轴切段下培养基表面均铺1-3层灭菌滤纸(湿度不宜过大)，用封口膜封口，22-24℃暗培养48h。

S4.诱导筛选培养：

经共培养后的下胚轴段放入筛选培养基M3，温度28±2℃，光照长度12h/d，光照强度2000Lx，培养2个月，愈伤组织的培养状态如图1、2所示。

然后在无菌条件下将直径1-2cm的愈伤组织转入筛选培养基M4中二次筛选培养一个月(图4)，小于1cm的愈伤组织再次转入筛选培养基M3中二次诱导筛选培养一个月(图3)。

S5.增殖培养：

将经过诱导培养得到的愈伤组织转入无激素的增殖培养基M1，培养条件为28±2℃，冷光源135μmol/m²·s，12h光照，25d继代一次，连续继代3次，直到愈伤组织分化，形成胚性愈伤组织。培养过程中的愈伤组织变化如图5-7。

S6.分化培养

将分化的愈伤组织转入带透气膜(图8)的分化培养基M5(固化剂含量增加)中，培养条件为28±2℃，冷光源135μmol/m²·s，12h光照，15d继代一次，连续继代4次(图9-12)，出现胚状体。

S7.低糖培养：

将胚状体转入分化培养基M6(葡萄糖含量降低)中，培养条件为28±2℃，冷光源135μmol/m²·s，12h光照，25d继代一次，连续继代3-5次(图13、14)；胚状体长成小植株时，再转入成苗培养基M7(葡萄糖含量继续降低)中，培养条件为28±2℃，冷光源135μmol/m²·s，12h光照，25d继代一次，连续继代2-3次(图15、16)，直至再生植株生长到5-8cm(图17)。

在装有营养土或育苗基质的土盆或美植袋中，种上普通棉花种子(抗病、植株生长旺盛)，待棉苗生长至1-3片真叶时(称砧木苗)用劈接法将生长到5-8cm转基因再生植株嫁接到砧木苗上，全株或嫁接苗部位保湿7d左右，逐步取掉保湿的塑膜(先放开小口，再慢慢放大口)或逐渐移走保湿器具，15-20d解开嫁接部位的绳子，细心管理至正常生长。

通过上述方法可使正常苗产生率达90％以上。

实施例2

对分化培养基M5中固化剂含量进行调整，其余同实施例1，结果如表2所示。

表2

注：不同品种同一列中不同字母表示显著性差异(P<0.05)

如图18-19所示，提高固化剂含量，获得了正常的胚性愈伤组织和胚状体，生长状况良好；如图20所示为未提高固化剂含量所获得的畸形苗，玻璃化、半玻璃化现象较为严重。

实施例3

对分化培养基M6中葡萄糖含量进行调整，其余同实施例1，结果如表3所示。

表3

注：同一列中不同字母表示显著性差异(P<0.05)

实施例4

对胚性愈伤组织继代培养的时间进行调整，其余同实施例1，结果如图21所示。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。