阅读说明：本技术 一种红掌的快速培养方法 (A kind of fast culture process of the red palm ) 是由 周国权 郑彬江 郑彬旭 罗志超 于 2019-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种红掌的快速培养方法,包括无菌苗培养、原生质体分离、原生质体培养、原生质体植株再生,其通过在原生质体植株再生阶段,加入等量的第二MS培养基,并通过培养基的组分选择及配比,降低了渗透压和细胞密度,而且,培养板与第三MS培养基的结合使用,确保了植物来自单个细胞,提高了萌芽率及再生速度。(The present invention relates to a kind of fast culture process of red palm, including Aseptic seedling culture, protoplast electrofusion, Protoplast cuhnre, Plant Regeneration from Protoplast, it passed through in the Plant Regeneration from Protoplast stage, the 2nd MS culture medium of equivalent is added, and passes through the component selection and proportion of culture medium, reduces osmotic pressure and cell density, and, culture plate is used in combination with the 3rd MS culture medium, it is ensured that plant comes from individual cells, improves germination rate and reproduction speed.)

一种红掌的快速培养方法

技术领域

本申请属于植物培养技术领域，具体涉及一种红掌的培养方法。

背景技术

红掌是单子叶植物纲天南星科花烛属多年生常绿草本植物。茎节短；叶自基部生出，绿色，革质，全缘，长圆状心形或卵心形。叶柄细长，佛焰苞平出，革质并有蜡质光泽，橙红色或猩红色；肉穗花序黄色，可常年开花不断。花烛原产于哥斯达黎加、哥伦比亚等热带雨林区。常附生在树上，有时附生在岩石上或直接生长在地上，性喜温暖、潮湿、半阴的环境，忌阳光直射。花烛花姿奇特美妍。花期持久，适合盆栽、切花或庭园荫蔽处丛植美化。

原生质体是指用特殊方法脱去了植物细胞壁的、裸露的、 有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。其无细胞壁障碍，可以方便地进行有关遗传操作，并可以对膜，细胞器等进行基础研究；具有全能性，并能进行人工培养发育成完整植株；原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞。

MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白HYPERLINK "https://baike.baidu.com/item/%E6%B0%B4%E8%A7%A3"水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。

现有技术中采用原生质体分离的方法培养红掌，采用的是单一种类的培养基，这种方法再生速度慢、萌芽率低，且芽体生长不稳定，因此，如何提供一种快速培养红掌的方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种再生速度快、萌芽率高、芽体生长稳定的快速培养红掌的方法。具体地，本发明的红掌培养方法依次包括如下步骤：

（1）无菌苗培养：以无激素MS培养基体外培养的红掌幼苗为材料，进行20小时光照；（2）原生质体分离：选择幼叶切成长条，置于装有酶溶液的烧瓶中，酶溶液含有5%（w/v）纤维素酶R-10、0.5%（w/v）果胶酶Y-23以及10%（w/v）甘露醇，搅拌并使酶溶液通过真空泵渗透，然后将酶溶物和幼叶长条倒入培养皿中，在25°C下培养30分钟，搅拌10s，在25°C下再培养30分钟；分离的原生质体通过筛网过滤，并在100 x g下离心10分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在50×g下离心10分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在10%（w/v）甘露醇中洗涤两次；（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以第一MS培养基培养，第一MS培养基中含有MS盐、0.3 mg/L的盐酸硫胺、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，第一MS培养基的pH为5.5；（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第二MS培养基，该第二MS培养基含有MS盐、0.3 mg/L的盐酸硫胺、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、5%（w/v）葡萄糖和3%（w/v）蔗糖，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到培养板，该培养板包括滤纸基板和转移板，该培养板被放置在第三MS培养基上10-20天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上14-20天，以产生2-6 mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。优选地，所述第三MS培养基含有MS盐、维生素、0.5 mg/L BAP、1 mg/L NAA、3%（w/v）蔗糖和0.6%（w/v）琼脂，第三MS培养基的pH为5.8。优选地，所述HSM培养基含有MS盐、维生素B5、1 mg/L BAP、0.1 mg/L NAA和3%（w/v）蔗糖，HSM培养基的pH为5.8。

本发明所取得的有益效果是通过在原生质体植株再生阶段，加入等量的第二MS培养基，并通过培养基的组分选择及配比，降低了渗透压和细胞密度，而且，培养板与第三MS培养基的结合使用，确保了植物来自单个细胞，提高了萌芽率及再生速度。

具体实施方式

实施例1

作为一较佳实施例，通过以下步骤进行红掌的培养：（1）无菌苗培养：以无激素MS培养基体外培养的红掌幼苗为材料，进行20小时光照；（2）原生质体分离：选择幼叶切成长条，置于装有酶溶液的烧瓶中，酶溶液含有5%（w/v）纤维素酶R-10、0.5%（w/v）果胶酶Y-23以及10%（w/v）甘露醇，搅拌并使酶溶液通过真空泵渗透，然后将酶溶物和幼叶长条倒入培养皿中，在25°C下培养30分钟，搅拌10s，在25°C下再培养30分钟；分离的原生质体通过筛网过滤，并在100 x g下离心10分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在50×g下离心10分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在10%（w/v）甘露醇中洗涤两次；（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以第一MS培养基培养，第一MS培养基中含有MS盐、0.3 mg/L的盐酸硫胺、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，第一MS培养基的pH为5.5；（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第二MS培养基，该第二MS培养基含有MS盐、0.3 mg/L的盐酸硫胺、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、5%（w/v）葡萄糖和3%（w/v）蔗糖，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到培养板，该培养板包括滤纸基板和转移板，该培养板被放置在第三MS培养基上10-20天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上14-20天，以产生2-6mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。其中，第三MS培养基含有MS盐、维生素、0.5 mg/L BAP、1 mg/LNAA、3%（w/v）蔗糖和0.6%（w/v）琼脂，第三MS培养基的pH为5.8；HSM培养基含有MS盐、维生素B5、1 mg/L BAP、0.1 mg/L NAA和3%（w/v）蔗糖，HSM培养基的pH为5.8。

对比例1

作为一对比例，通过以下步骤进行红掌的培养：（1）无菌苗培养：以无激素MS培养基体外培养的红掌幼苗为材料，进行20小时光照；（2）原生质体分离：选择幼叶切成长条，置于装有酶溶液的烧瓶中，酶溶液含有5%（w/v）纤维素酶R-10、0.5%（w/v）果胶酶Y-23以及10%（w/v）甘露醇，搅拌并使酶溶液通过真空泵渗透，然后将酶溶物和幼叶长条倒入培养皿中，在25°C下培养30分钟，搅拌10s，在25°C下再培养30分钟；分离的原生质体通过筛网过滤，并在100 x g下离心10分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在50×g下离心10分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在10%（w/v）甘露醇中洗涤两次；（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以第一MS培养基培养，第一MS培养基中含有MS盐、0.3 mg/L的盐酸硫胺、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，第一MS培养基的pH为5.5；（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第一MS培养基，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到培养板，该培养板包括滤纸基板和转移板，该培养板被放置在第三MS培养基上10-20天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上14-20天，以产生2-6 mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。其中，第三MS培养基含有MS盐、维生素、0.5 mg/L BAP、1 mg/L NAA、3%（w/v）蔗糖和0.6%（w/v）琼脂，第三MS培养基的pH为5.8；HSM培养基含有MS盐、维生素B5、1 mg/L BAP、0.1 mg/L NAA和3%（w/v）蔗糖，HSM培养基的pH为5.8。

对比例2

作为另一对比例，通过以下步骤进行红掌的培养：（1）无菌苗培养：以无激素MS培养基体外培养的红掌幼苗为材料，进行20小时光照；（2）原生质体分离：选择幼叶切成长条，置于装有酶溶液的烧瓶中，酶溶液含有5%（w/v）纤维素酶R-10、0.5%（w/v）果胶酶Y-23以及10%（w/v）甘露醇，搅拌并使酶溶液通过真空泵渗透，然后将酶溶物和幼叶长条倒入培养皿中，在25°C下培养30分钟，搅拌10s，在25°C下再培养30分钟；分离的原生质体通过筛网过滤，并在100 x g下离心10分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在50×g下离心10分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在10%（w/v）甘露醇中洗涤两次；（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以第一MS培养基培养，第一MS培养基中含有MS盐、0.3 mg/L的盐酸硫胺、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，第一MS培养基的pH为5.5；（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第二MS培养基，该第二MS培养基含有MS盐、0.3 mg/L的盐酸硫胺、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、5%（w/v）葡萄糖和3%（w/v）蔗糖，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到第三MS培养基上10-20天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上14-20天，以产生2-6 mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。其中，第三MS培养基含有MS盐、维生素、0.5 mg/L BAP、1 mg/L NAA、3%（w/v）蔗糖和0.6%（w/v）琼脂，第三MS培养基的pH为5.8；HSM培养基含有MS盐、维生素B5、1 mg/L BAP、0.1 mg/L NAA和3%（w/v）蔗糖，HSM培养基的pH为5.8。

对实施例1、对比例1及对比例2中的萌芽比例、萌发时间和芽体生长情况进行对比，结果见于下表：

	原生质体再生时间	萌芽比例
			实施例1	35-40天	78%
对比例1	60-80天	55%
			对比例2	45-70天	65%

从上表可以看出，本发明通过在原生质体植株再生阶段，加入等量的第二MS培养基，并通过培养基的组分选择及配比，降低了渗透压和细胞密度，而且，培养板与第三MS培养基的结合使用，确保了植物来自单个细胞，提高了萌芽率及再生速度。