阅读说明：本技术 一种红掌的培育方法 (A kind of breeding method of the red palm ) 是由 郑彬江 周国权 郑彬旭 罗志超 于 2019-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种红掌的培育方法,包括红掌苗培养、原生质体分离、原生质体培养和原生质体再生,与用切片叶片制成的样本相比,研磨技术对叶组织的损伤较小,因此原生质体的产量较高,另外,本发明采用原研的水解酶材料,相比其他细胞壁水解酶,如小豆粕纤维素酶RS和纤维素酶R-10等,当以相同浓度使用时,发现释放原始细胞的效果更优,且通过荧光灯和白炽灯组合供光,室温下光照18小时后,将培养室的温度调整为22℃,然后在黑暗条件下培养10小时,且以特定的光通量密度,改善了育苗效果。(The present invention relates to a kind of breeding methods of red palm, including red palm seedling culture, protoplast electrofusion, Protoplast cuhnre and protoplast regeneration, compared with the sample made of slice blade, grinding technique is smaller to the damage of leaf texture, therefore the yield of protoplast is higher, in addition, the present invention is using the former hydrolase material ground, compared to other cytohydrolists, such as small dregs of beans cellulase RS and cellulase R-10, when being used with same concentrations, it was found that the effect of release initial cell is more excellent, and by fluorescent lamp and incandescent lamp combination for light, at room temperature after illumination 18 hours, the temperature of culturing room is adjusted to 22 DEG C, then it is cultivated 10 hours under dark condition, and with specific pharosage, improve nursery effect.)

一种红掌的培育方法

技术领域

本申请属于植物培养技术领域，具体涉及一种红掌的培育方法。

背景技术

红掌是单子叶植物纲天南星科花烛属多年生常绿草本植物。茎节短；叶自基部生出，绿色，革质，全缘，长圆状心形或卵心形。叶柄细长，佛焰苞平出，革质并有蜡质光泽，橙红色或猩红色；肉穗花序黄色，可常年开花不断。花烛原产于哥斯达黎加、哥伦比亚等热带雨林区。常附生在树上，有时附生在岩石上或直接生长在地上，性喜温暖、潮湿、半阴的环境，忌阳光直射。花烛花姿奇特美妍。花期持久，适合盆栽、切花或庭园荫蔽处丛植美化。

原生质体是指用特殊方法脱去了植物细胞壁的、裸露的、 有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。其无细胞壁障碍，可以方便地进行有关遗传操作，并可以对膜，细胞器等进行基础研究；具有全能性，并能进行人工培养发育成完整植株；原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞。

现有技术中采用原生质体分离的方法培养植物，采用的是切片发获得样本，然而该方法度叶片的损伤大，原生质体产量低，而且，现有技术中的细胞壁水解酶，如小豆粕纤维素酶RS和纤维素酶 R-10等，当以相同浓度使用时，发现释放原始细胞的效果差，因此，如何提供一种产量高、培育效果好的培养红掌的方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产量高、培育效果好的培养红掌的方法。具体地，本发明的红掌培育方法依次包括如下步骤：

（1）红掌苗培养：将红掌种子在培养室中培养，培养条件为：荧光灯和白炽灯组合供光，室温下光照18小时后，将培养室的温度调整为22℃，然后在黑暗条件下培养10小时，恢复光照，之后每天用稀释的营养液浇灌，20天后将完全展开的初生叶用于原生质体分离；

（2）原生质体分离：将完全展开的初生叶从植物上脱离，用蒸馏水清洗后吸干水分，放在混合有金刚砂的蒸馏水中使用医用棉签轻轻研磨，然后再次冲洗磨损的叶子以除去金刚砂，再吸干水分，将磨损的叶子切成1×1μm的正方形，并漂浮在水解酶上，使叶子表面与水解酶接触，该水解酶含有2.5%（w/v）的纤维素酶、0.5%（w/v）果胶酶Y-23、9%（w/v）的甘露醇、0.1 mg/L的氯化钙、2%（w/v）的BSA和5mM的MES，该水解酶的pH为5.8；在120μE/m2·s的光通量密度、28℃下照射4-5小时，并保持震荡，随后通过筛网过滤，并用含有9%（w/v）的甘露醇，0.05 mg/L的氯化钙，0.1％（w/v）BSA的缓冲液洗涤两次，滤液在100x g下离心3分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在100×g下离心5分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在9%（w/v）甘露醇中洗涤两次；

（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以含有MS盐、0.2mg/L的NAA、0.3mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，且pH为5.8的培养基中培养；

（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第二MS培养基，该第二MS培养基含有MS盐、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、5%（w/v）葡萄糖和3%（w/v）蔗糖，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到培养板，并将培养板放置在第三MS培养基上14-21天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上21-28天，以产生2-4 mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。

优选地，步骤（1）中荧光灯和白炽灯能够在叶冠高度处提供420μE/m2·s的光通量密度。

优选地，所述第三MS培养基含有MS盐、维生素、0.5 mg/L BAP、1 mg/L NAA、3%（w/v）蔗糖和0.6%（w/v）琼脂，第三MS培养基的pH为5.8。

优选地，所述HSM培养基含有MS盐、维生素B5、1 mg/L BAP、0.1 mg/L NAA和3%（w/v）蔗糖，HSM培养基的pH为5.8。

本发明所取得的有益效果是与用切片叶片制成的样本相比，研磨技术对叶组织的损伤较小，因此原生质体的产量较高，另外，本发明采用原研的水解酶材料，相比其他细胞壁水解酶，如小豆粕纤维素酶RS和纤维素酶 R-10等，当以相同浓度使用时，发现释放原始细胞的效果更优，且通过荧光灯和白炽灯组合供光，室温下光照18小时后，将培养室的温度调整为22℃，然后在黑暗条件下培养10小时，且以特定的光通量密度，改善了育苗效果。

具体实施方式

实施例1

作为一较佳实施例，通过以下步骤进行红掌的培养：（1）红掌苗培养：将红掌种子在培养室中培养，培养条件为：荧光灯和白炽灯组合供光，室温下光照18小时后，将培养室的温度调整为22℃，然后在黑暗条件下培养10小时，恢复光照，之后每天用稀释的营养液浇灌，20天后将完全展开的初生叶用于原生质体分离；（2）原生质体分离：将完全展开的初生叶从植物上脱离，用蒸馏水清洗后吸干水分，放在混合有金刚砂的蒸馏水中使用医用棉签轻轻研磨，然后再次冲洗磨损的叶子以除去金刚砂，再吸干水分，将磨损的叶子切成1×1μm的正方形，并漂浮在水解酶上，使叶子表面与水解酶接触，该水解酶含有2.5%（w/v）的纤维素酶、0.5%（w/v）果胶酶Y-23、9%（w/v）的甘露醇、0.1 mg/L的氯化钙、2%（w/v）的BSA和5mM的MES，该水解酶的pH为5.8；在120μE/m2·s的光通量密度、28℃下照射4-5小时，并保持震荡，随后通过筛网过滤，并用含有9%（w/v）的甘露醇，0.05 mg/L的氯化钙，0.1％（w/v）BSA的缓冲液洗涤两次，滤液在100x g下离心3分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在100×g下离心5分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在9%（w/v）甘露醇中洗涤两次；（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以含有MS盐、0.2mg/L的NAA、0.3mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，且pH为5.8的培养基中培养；（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第二MS培养基，该第二MS培养基含有MS盐、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、5%（w/v）葡萄糖和3%（w/v）蔗糖，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到培养板，并将培养板放置在第三MS培养基上14-21天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上21-28天，以产生2-4 mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。

对比例1

作为一对比例，通过以下步骤进行红掌的培养：（1）红掌苗培养：将红掌种子在培养室中培养，培养条件为：荧光灯和白炽灯组合供光，室温下光照18小时后，将培养室的温度调整为22℃，然后在黑暗条件下培养10小时，恢复光照，之后每天用稀释的营养液浇灌，20天后将完全展开的初生叶用于原生质体分离；（2）原生质体分离：将完全展开的初生叶从植物上脱离，用蒸馏水清洗后吸干水分，将叶子切片，切成1×1μm的正方形，并漂浮在水解酶上，使叶子表面与水解酶接触，该水解酶含有2.5%（w/v）的纤维素酶、0.5%（w/v）果胶酶Y-23、9%（w/v）的甘露醇、0.1 mg/L的氯化钙、2%（w/v）的BSA和5mM的MES，该水解酶的pH为5.8；在120μE/m2·s的光通量密度、28℃下照射4-5小时，并保持震荡，随后通过筛网过滤，并用含有9%（w/v）的甘露醇，0.05 mg/L的氯化钙，0.1％（w/v）BSA的缓冲液洗涤两次，滤液在100x g下离心3分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在100×g下离心5分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在9%（w/v）甘露醇中洗涤两次；（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以含有MS盐、0.2mg/L的NAA、0.3mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，且pH为5.8的培养基中培养；（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第二MS培养基，该第二MS培养基含有MS盐、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、5%（w/v）葡萄糖和3%（w/v）蔗糖，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到培养板，并将培养板放置在第三MS培养基上14-21天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上21-28天，以产生2-4 mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。

对比例2

作为另一对比例，通过以下步骤进行红掌的培养：（1）红掌苗培养：将红掌种子在培养室中培养，培养条件为：荧光灯和白炽灯组合供光，室温下光照18小时后，将培养室的温度调整为22℃，然后在黑暗条件下培养10小时，恢复光照，之后每天用稀释的营养液浇灌，20天后将完全展开的初生叶用于原生质体分离；（2）原生质体分离：将完全展开的初生叶从植物上脱离，用蒸馏水清洗后吸干水分，放在混合有金刚砂的蒸馏水中使用医用棉签轻轻研磨，然后再次冲洗磨损的叶子以除去金刚砂，再吸干水分，将磨损的叶子切成1×1μm的正方形，并漂浮在水解酶上，使叶子表面与水解酶接触，该水解酶含有2.5%（w/v）的纤维素酶、0.5%（w/v）果胶酶Y-23、9%（w/v）的甘露醇、0.1 mg/L的氯化钙，该水解酶的pH为5.8；在120μE/m2·s的光通量密度、28℃下照射4-5小时，并保持震荡，随后通过筛网过滤，并用含有9%（w/v）的甘露醇，0.05 mg/L的氯化钙，0.1％（w/v）BSA的缓冲液洗涤两次，滤液在100x g下离心3分钟，使原生质体在20%（w/v）蔗糖溶液中悬浮，将10%（w/v）甘露醇溶液轻轻地滴于悬浮液的顶部，在100×g下离心5分钟后，将界面处的完整原生质体通过吸管吸出，在9%（w/v）甘露醇中洗涤两次；（3）原生质体培养：原生质体在培养皿中以含有MS盐、0.2mg/L的NAA、0.3mg/L的BAP、10%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）蔗糖，且pH为5.8的培养基中培养；（4）原生质体植株再生：每5天向步骤（3）的培养皿中加入等量的第二MS培养基，该第二MS培养基含有MS盐、0.5mg/L的NAA、0.1 mg/L的BAP、5%（w/v）葡萄糖和3%（w/v）蔗糖，直到群落长到0.2-0.3mm，然后将群落转移到培养板，并将培养板放置在第三MS培养基上14-21天，然后将单个愈伤组织放置在第三MS培养基上21-28天，以产生2-4 mm的愈伤组织，再将愈伤组织转移到HSM培养基中再生，萌芽后，转移到无激素MS培养基，然后在7-10天后移栽入土壤。

对实施例1、对比例1及对比例2中的原生质体产量进行测定，结果发现，实施例1的原生质体产量为4.15×10⁶个/mL，对比例1、2分别为2.20×10⁵个/mL、2.40×10⁵个/mL。从上述数据可以看出，本发明与用切片叶片制成的样本相比，研磨技术对叶组织的损伤较小，因此原生质体的产量较高，另外，本发明采用原研的水解酶材料，相比其他细胞壁水解酶，如小豆粕纤维素酶RS和纤维素酶 R-10等，当以相同浓度使用时，发现释放原始细胞的效果更优，改善了育苗效果。