阅读说明：本技术 一种产乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用 (A kind of Aspergillus terreus bacterial strain producing aconitic acid and its construction method and application ) 是由 吕雪峰 黄雪年 耿策 张伟 于 2019-07-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高产乌头酸的基因工程菌株,所述基因工程菌株的出发菌株为土曲霉,所述基因工程菌株为将土曲霉中的顺乌头酸脱羧酶(cadA)进行基因突变所得到的。所述基因工程菌株以产衣康酸的土曲霉菌株作为出发菌株,通过遗传改造实现了乌头酸的积累,获得一种产乌头酸细胞工厂,从而可以建立一种通过微生物发酵生产反式乌头酸的绿色工艺。(The invention discloses a kind of engineering strain of high yield aconitic acid, the starting strain of the engineering strain is Aspergillus terreus, and the engineering strain is that aconitate decarboxylase (cadA) the progress gene mutation in Aspergillus terreus is obtained.The engineering strain is to produce the Aspergillus terreus bacterial strain of itaconic acid as starting strain, the accumulation of aconitic acid is realized by genetic modification, a kind of production aconitic acid cell factory is obtained, so as to establish a kind of friendly process for producing trans-aconitic acid by microbial fermentation.)

一种产乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种产生乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用。

背景技术

乌头酸(丙烯-1，2，3-三羧酸，1,2,3-Propenetricarboxylic acid)因从乌头属植物中提取而得名，是一种不饱和三羧酸。因其含有不饱和双键和丰富的羟基，因此可以作制备聚合材料的单体化合物，也可以作为其他化合物的合成前体，如三甲基反式乌头酸等。

乌头酸有顺、反式两种构型，其中，顺乌头酸(CAS:585-84-2)是三羧酸循环中乌头酸酶催化柠檬酸异构化生成异柠檬酸的中间产物。

乌头酸酶作为三羧酸循环中的关键酶，抑制乌头酸酶活性可以干扰三羧酸循环，从而影响生命活动。反式乌头酸(CAS：4023-65-8)作为顺式乌头酸的立体异构体，可以作为竞争性抑制剂干扰乌头酸酶活性，从而产生特殊的生理功能。多项研究表明反式乌头酸在线虫防治等方面具有较好的效果，因此在生物农药开发方面很好的潜力。

目前，反式乌头酸主要是通过化学合成的方法生产，工艺复杂，副产物多，成本高，而且没有形成规模化生产。反式乌头酸的有效供应将促进下游应用和产品开发的主要因素。本发明以产衣康酸的土曲霉菌株作为出发菌株，通过遗传改造实现了乌头酸的积累，获得一种产乌头酸细胞工厂，从而可以建立一种通过微生物发酵生产反式乌头酸的绿色工艺。

发明内容

本发明提供了一种高产乌头酸的基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)。

本发明的基因工程菌株为将土曲霉中的顺乌头酸脱羧酶(cadA)进行基因突变所得到的。

本发明所述的突变包括通过基因缺失、基因***或基因取代导致的基因功能至少部分失活的方式；在优选的实施方式中，所述至少部分失活为基因功能全部失活。

在优选的实施方式中，对cadA进行基因突变为将cadA基因进行完全敲除，所述工程菌株的基因组中不再保留cadA基因的任何片段。

所述cadA是指土曲霉中的顺乌头酸脱羧酶，本发明中不对该基因的序列做强制性的限定；在优选的实施方式中，所述cadA的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；在其他的实施方式中，所述cadA还包括与所示序列具有高度同源性的序列，优选的，所述高度同源性包括与目的序列的同源性至少99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％的序列。

在一个实施方式中，所述出发菌株土曲霉为可以产生衣康酸的土曲霉；如，土曲霉CICC40205，土曲霉NRRL1960，土曲霉DSM23081，土曲霉TN484，土曲霉TN484-M1。

在优选的实施方式中，所述出发菌株为土曲霉CICC40205。

另一方面，本发明还提供了利用所述基因工程菌株生产乌头酸的方法，所述方法包括将所述菌株接种至培养基中进行发酵的步骤。

在一个实施方式中，发酵条件如下：菌株的接种量为1×10⁴-1×10⁷个孢子/mL培养基，优选，2×10⁵个孢子/mL培养基；发酵温度为28-45℃，优选，30-37℃，更优选，35-37℃；发酵时间为至少24h，优选，至少60h，更优选，至少80h，更优选，至少90h，更优选，至少96h。

在一个实施方式中，所述乌头酸包括顺式乌头酸和反式乌头酸。

在优选的实施方式中，所述乌头酸为反式乌头酸。

本发明的基因工程菌株相对于对照菌株来说，能够积累乌头酸，包括顺乌头酸和反式乌头酸；通常来讲，微生物中产生的顺式乌头酸会在乌头酸异构酶的作用下转化为反式乌头酸，但是，本发明中的土曲霉中缺乏该异构酶，本发明通过后处理条件的优化使得该基因工程菌株中积累的顺式乌头酸可以转化为反式乌头酸，从而可以提高基因工程菌株中的反式乌头酸的产量。

本发明的基因工程菌株在发酵前期即能够生产乌头酸，其中，顺式乌头酸的比例较高；发明人发现，随着发酵时间延长，顺式乌头酸的比例会逐渐降低，反而会大量的积累反式乌头酸。

另外，本发明采用通过高温处理的方式，可以提高反式乌头酸积累的速率。优选的，所述高温处理为发酵周期结束后，对发酵液进行高温处理。

在一个实施方式中，高温处理的温度为90-160℃，更优选，100-150℃，更优选，100-130℃，更优选，110-125℃，更优选，121℃。

进一步的，高温处理的时间为5-120min，优选，10-90min，更优选，10-60min，更优选，15-30min。

进一步的，高温处理在压力存在的情况下进行，所述压力选自0.1Mpa-0.15Mpa。

另一方面，本发明还提供了一种提高基因工程菌株所生产的总乌头酸中反式乌头酸占比的方法，所述方法包括利用本发明的基因工程菌株在培养基中进行发酵的步骤，所述总乌头酸包括顺式乌头酸和反式乌头酸。

在一个实施方式中，所述反式乌头酸在总乌头酸中的质量占比至少为50％，优选，至少为60％，更优选，至少为70％，更优选，至少为80％，更优选，至少为85％。

进一步的，菌株的接种量为1×10⁴-1×10⁷个孢子/mL培养基，优选，2×10⁵个孢子/mL培养基；发酵温度为28-45℃，优选，30-37℃，更优选，35-37℃；发酵时间为至少24h，优选，至少60h，更优选，至少80h，更优选，至少90h，更优选，至少96h。

另一方面，本发明还提供了基因工程菌的构建方法。

本发明所述的构建方法包括对出发菌株土曲霉进行cadA基因突变的步骤。

在一个实施方式中，所述构建方法还包括对土曲霉ku80基因进行突变的步骤；进一步的，还包括对pyrG基因进行突变的步骤。

附图说明

图1为顺乌头酸和反式乌头酸的化学结构；

图2为构建的At-ΔcadA工程菌株的基因组PCR验证结果；

图3为菌株发酵产有机酸的HPLC分析图；

图4为工程菌株摇瓶发酵产乌头酸的时间曲线图。

图5为工程菌株10L发酵罐中生产顺式乌头酸(CAA)、反式乌头酸(TAA)产量及反式乌头酸占比的时间曲线。

图6为工程菌株10L发酵罐中分批补料发酵及发酵参数优化后的顺式乌头酸(CAA)、反式乌头酸(TAA)产量和反式乌头酸占比及残糖、糖酸转化率比较

图7为工程菌株10L发酵罐的发酵液不同后处理工艺乌头酸组份的HPLC分析图。

图8为工程菌株10L发酵罐的发酵液不同后处理工艺乌头酸组份：顺式乌头酸(CAA)、反式乌头酸(TAA)产量及反式乌头酸占比比较。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。

按以下培养基配方配制培养基备用：

PDA平板培养基：39g/L马铃薯土豆琼脂培养基PDA干粉，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟，待冷却至约60℃制备平板。

PDB培养基：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟。

有机酸发酵培养基IPM：100g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，0.2g L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mgL^-1FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，40mg L^-1ZnSO₄，40mg L^-1CuSO₄，用硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌30min。

实施例1、cadA基因打靶元件cadA-KO1的构建

根据土曲霉基因组信息设计并合成如下引物：

U-cadA-F:5’-agccgctaccagccgaagcaatag-3’；

U-cadA-R:5’-GTTCAATCACCATCTCCCTTAatcgtcagtatactttgtagac-3’；

D-cadA-F:5’-CGTATTTCTCCGCCTGTGTG aaggttactccatctcatagc-3’；

D-cadA-R:5’-tcgactatagctggattgatcac-3’。

以土曲霉(Aspergillus terreus)CICC 40205基因组DNA为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas,产品目录号:EP0501)进行PCR扩增，用引物对U-cadA-F/U-cadA-R可以扩增获得大小约为1.2kb的cadA基因的上游同源臂U-cadA，用引物对D-cadA-F/D1-cadA-R可以扩增获得大小为1.2kb的cadA基因下游同源臂D-cadA。以质粒pXH-106为模板，用引物对pyrGAn-F(5’-taagggagatggtgattgaactag-3’)和pyrGAn-R(5’-cacacaggcggagaaatacgaagc-3’)进行PCR扩增黑曲霉pyrG_An基因表达元件作为筛选标记，即pyrG_An片段。

将所有PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并进行割胶回收纯化。用融合PCR的方法将U-cadA片段、pyrG_An片段和D-cadA片段进行融合，并以该融合PCR的产物作为模板，以C-cadA-F(5’-ttggtaatggaacatttgtctg-3’)和C-cadA-R(5’-cacagcaagacctggctatcag-3’)作为引物对扩增获得大小约为3.5kb的cadA基因打靶元件cadA-KO片段，可用于cadA的基因敲除工作。

实施例2、cadA基因缺失土曲霉菌株At-ΔcadA的构建

土曲霉At-Δku80是针对土曲霉CICC40205进行ku80基因敲除的工程菌株，At-Δku80-ΔpyrG则是在At-Δku80菌株基础上敲除了pyrG基因之后得到的尿嘧啶营养缺陷型工程菌株(吕雪峰等，一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，ZL201510275491.5)。

将工程菌株At-Δku80-ΔpyrG的孢子接种至50mL IPM液体培养基中，使孢子浓度约为10⁷个/mL，在200rpm、32℃培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中，根据菌丝重量加入适量酶解液(每1g菌丝加入10ml酶解液)，在30℃、60rpm处理1-3h。将上述酶解后的混合液用300目尼龙布或擦镜纸过滤，收集滤液。在4℃、4000rpm离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC组成：1.0M山梨醇，50mM Tris-HCl(pH 8.0)，50mM CaCl₂)洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×10⁷个/mL，得到原生质体悬液。向150μl该原生质体悬液中加入10μl的DNA片段cadA-KO(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC(PSTC组成：40％PEG4000，1.2M山梨醇，50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM CaCl₂)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL的PDB顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS平板上进行再生筛选培养，在30℃、黑暗条件下培养5-7天。

从转化筛选平板上挑取生长状况良好的转化子转接至PDA平板上，在30℃培养5天进行传代纯化。将稳定传代转化子的孢子接种于IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA，用引物对U-cadA-F/D-cadA-R进行PCR验证，同时用At-Δku80-ΔpyrG菌株的基因组作为对照。阳性转化子能扩增出大小约为4.2kb的条带，对照能扩增大小约为3.5kb的条带。结果如图2所示，M为DNAMarker，1-3泳道分别为3个候选转化子，泳道wt为对照菌株At-Δku80-ΔpyrG，条带a为未敲除的野生型cadA条带，条带b为敲除cadA后的目的条带(其中具有pyrG_An筛选标记)。选取阳性转化子进行单孢分离纯化，并再次和再次用引物对U-cadA-F/D-cadA-R进行基因组PCR验证，获得cadA完全敲除的纯种转化子，记为At-ΔcadA。

实施例3、土曲霉菌株At-ΔcadA发酵产乌头酸的摇瓶分析

选取基因工程菌株At-ΔcadA转化子和对照菌株At-Δku80分别接种至土曲霉产孢斜面培养基(10g L^-1葡萄糖，2g L^-1NaNO₃，0.2g L^-1,KH₂PO₄，20mg L^-1FeSO₄，5g L^-1MgSO₄，0.5g L^-1NaCl，40mg L^-1ZnSO₄，40mg L^-1CuSO₄，0.5％麸皮，1.5％琼脂，115℃灭菌15min，然后分装至试管，再115℃灭菌25min，制备斜面)，32℃培养7天获得成熟的孢子。再分别将一支斜面上的孢子接种至一瓶衣康酸发酵培养基中(500ml三角瓶中装有55ml培养基)，接种量约为终浓度2x10⁵个孢子/mL，每株菌摇瓶发酵12瓶，37℃，220rpm发酵96h，中途取样5次，每次每个菌株取出两瓶。

取上清液经0.45μm滤器过滤后采用高效液相色谱分析方法(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC)检测有机酸含量。色谱柱:Bio-rad Aminex HPX-87H,300mmx 7.8mm；流动相：5mmol/L硫酸；流速：0.5ml/min；柱温：55℃；检查温度：35℃；紫外检测器(210nm)。结果如图3所示，对照菌株At-Δku80产生大量衣康酸，乌头酸含量极少，未检测到。而改造后的工程菌株At-ΔcadA则完全不合成衣康酸，但是大量积累乌头酸，包括顺式乌头酸和反式乌头酸。

如图4所示，工程菌株At-ΔcadA随着发酵时间延长大量积累乌头酸，在第96小时可达到8.8g/L。另外，随着发酵时间延长，发酵液中的反式乌头酸所占比例也逐步增加。由此可见，通过本发明的基因工程技术确实可以构建产乌头酸工程菌株，该菌株可以用于开发产乌头酸At-ΔcadA发酵工艺，尤其是产反式乌头酸的发酵工艺。

实施例4、土曲霉发酵产乌头酸的10L罐分批发酵工艺

选取基因工程菌株At-ΔcadA转化子接种于土曲霉产孢斜面培养基(10g L^-1葡萄糖，2g L^-1NaNO₃，0.2g L^-1,KH₂PO₄，20mg L^-1FeSO₄，5g L^-1MgSO₄，0.5g L^-1NaCl，40mg L^{- 1}ZnSO₄，40mg L^-1CuSO₄，1.5％琼脂，115℃灭菌15min，分装至平板，冷却)放置32℃培养箱7天之后孢子成熟，通过100目滤纸过滤菌丝体，收集孢子悬浮于无菌水，并以10⁸个/ml接种1ml于种子发酵培养基55ml(150g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，0.2g L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^-1FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，40mg L^-1ZnSO₄，40mg L^-1CuSO₄，0.5g L^-1NaCl，用浓硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌10min，冷却备用)，37℃摇床220rpm发酵20小时，再将种子于无菌操作发酵罐正压状态接种于10L发酵培养基(120g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，0.2g L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^-1FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，40mg L^-1ZnSO₄，40mg L^-1CuSO₄，0.5g L^-1NaCl，用浓硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌10min，循环水降温至37℃)，发酵过程控制参数37℃，DO不低于10％，搅拌转速不高于300rpm，通气比为1.0vvm，无pH控制，加消泡剂为2％泡敌(聚醚)20ml，发酵周期为96h。下罐之后通过HPLC检测反式乌头酸及顺式乌头酸产量如图5所示反式乌头酸TAA产量8.51g L^-1较实施案例3中摇瓶发酵6.4g L^-1提高了29％。

实施例5、土曲霉发酵产乌头酸的10L罐优化产量分批补料发酵工艺

选取同样的At-ΔcadA转化子接种于土曲霉产孢斜面培养基放置32℃培养箱7天之后孢子成熟，通过100目滤纸过滤菌丝体，收集孢子悬浮于无菌水，并以10⁸个/ml接种1ml于种子发酵培养基55ml，37℃摇床220rpm发酵20小时，再将种子于无菌操作发酵罐正压状态接种于10L发酵培养基(100g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，0.2g L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^{- 1}FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，40mg L^-1ZnSO₄，40mg L^-1CuSO₄，0.5g L^-1NaCl，用浓硫酸调整pH至3.5，115℃灭菌10min，循环水降温至37℃)，发酵过程控制参数37℃，DO不低于10％，搅拌转速不高于350rpm，通气比为1.0vvm，加消泡剂为2％泡敌(聚醚)20ml，pH控制在48h之后加NH₃H₂O高于1.5，并于84h和96h补料100g/L葡萄糖各500ml，发酵周期为121h。下罐之前检测残糖含量和反式乌头酸及顺式乌头酸产量，与分批不补料发酵相比如图6所示，分批补料发酵比不补料发酵的添加底料总糖浓度还低，但是反式乌头酸产量从8.5g L^-1提高到9.2g L^-1，提高了7.23％，从残糖浓度及糖酸转化率来比较都是分批补料葡萄糖的发酵工艺要优于不补料实施案例4的工艺。

实施例6、发酵液后处理提高反式乌头酸含量

将10L土曲霉发酵罐中的产乌头酸发酵液在发酵周期结束时采用0.1Mpa下100℃灭菌20min、0.12Mpa下121℃灭菌15min及0.15Mpa下160℃10min不同温度处理，分别检测乌头酸总含量变化及反式乌头酸、顺式乌头酸的含量及比例变化。如图7和图8所示三种高温处理均可提高反式乌头酸的比例。其中0.15Mpa下160℃处理10min会降低总乌头酸的含量并生成一个新的额外组份。121℃灭菌处理15min，反式乌头酸所占比例从80.9％提高到约90.2％。在保证总产量不损失，不增加额外组份的情况下反式乌头酸的比例最高，该工艺操作可以用于发酵后处理提高反式乌头酸含量及稳定产品品质浓度的工艺。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种产乌头酸的土曲霉菌株及其构建方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 490

<212> PRT

<213> Aspergillus terreus

<400> 1

Met Thr Lys Gln Ser Ala Asp Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Thr Ala

1 5 10 15

Glu Ile Cys His Trp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Asp Asp Ile Pro Ser

20 25 30

Asp Val Leu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Asp Gly Ile Ala Cys

35 40 45

Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Lys Tyr Val Gln Ala

50 55 60

Thr Met Ser Phe Glu Pro Pro Gly Ala Cys Arg Val Ile Gly Tyr Gly

65 70 75 80

Gln Lys Leu Gly Pro Val Ala Ala Ala Met Thr Asn Ser Ala Phe Ile

85 90 95

Gln Ala Thr Glu Leu Asp Asp Tyr His Ser Glu Ala Pro Leu His Ser

100 105 110

Ala Ser Ile Val Leu Pro Ala Val Phe Ala Ala Ser Glu Val Leu Ala

115 120 125

Glu Gln Gly Lys Thr Ile Ser Gly Ile Asp Val Ile Leu Ala Ala Ile

130 135 140

Val Gly Phe Glu Ser Gly Pro Arg Ile Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Ser

145 150 155 160

Asp Leu Leu Asn Asn Gly Trp His Cys Gly Ala Val Tyr Gly Ala Pro

165 170 175

Ala Gly Ala Leu Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Leu Thr Pro Asp Ser

180 185 190

Met Glu Asp Ala Leu Gly Ile Ala Cys Thr Gln Ala Cys Gly Leu Met

195 200 205

Ser Ala Gln Tyr Gly Gly Met Val Lys Arg Val Gln His Gly Phe Ala

210 215 220

Ala Arg Asn Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala Tyr Gly Gly Tyr Glu

225 230 235 240

Ala Met Lys Gly Val Leu Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Lys Met

245 250 255

Phe Thr Lys Gly Asn Gly Arg Glu Pro Pro Tyr Lys Glu Glu Glu Val

260 265 270

Val Ala Gly Leu Gly Ser Phe Trp His Thr Phe Thr Ile Arg Ile Lys

275 280 285

Leu Tyr Ala Cys Cys Gly Leu Val His Gly Pro Val Glu Ala Ile Glu

290 295 300

Lys Leu Gln Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Leu Asn Arg Ala Asn Leu Ser

305 310 315 320

Asn Ile Arg His Val Tyr Val Gln Leu Ser Thr Ala Ser Asn Ser His

325 330 335

Cys Gly Trp Ile Pro Glu Glu Arg Pro Ile Ser Ser Ile Ala Gly Gln

340 345 350

Met Ser Val Ala Tyr Ile Leu Ala Val Gln Leu Val Asp Gln Gln Cys

355 360 365

Leu Leu Ala Gln Phe Ser Glu Phe Asp Asp Asn Leu Glu Arg Pro Glu

370 375 380

Val Trp Asp Leu Ala Arg Lys Val Thr Pro Ser His Ser Glu Glu Phe

385 390 395 400

Asp Gln Asp Gly Asn Cys Leu Ser Ala Gly Arg Val Arg Ile Glu Phe

405 410 415

Asn Asp Gly Ser Ser Val Thr Glu Thr Val Glu Lys Pro Leu Gly Val

420 425 430

Lys Glu Pro Met Pro Asn Glu Arg Ile Leu His Lys Tyr Arg Thr Leu

435 440 445

Ala Gly Ser Val Thr Asp Glu Ser Arg Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu

450 455 460

Val Leu Ser Leu Asp Arg Leu Thr Asp Ile Thr Pro Leu Leu Glu Leu

465 470 475 480

Leu Asn Cys Pro Val Lys Ser Pro Leu Val

485 490