一种能够大量表达南极假丝酵母脂肪酶b的黑曲霉重组菌株及其构建方法及应用
阅读说明：本技术 一种能够大量表达南极假丝酵母脂肪酶b的黑曲霉重组菌株及其构建方法及应用 (Aspergillus niger recombinant strain capable of expressing candida antarctica lipase B in large quantity and construction method and application thereof ) 是由 赵正阳 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了高产脂肪酶B的黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用。一种构建重组黑曲霉表达菌的方法,构建包含脂肪酶B的重组表达盒,该重组表达盒为包含脂肪酶B基因序列、启动子、终止子、筛选标记、上下游同源序列等元件的基因片段。按照本发明所述的方法构建的产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株。本发明所述的产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株在表达脂肪酶B中的应用。本发明通过基因工程的手段,构建了脂肪酶B的表达盒,并将其导入黑曲霉表达宿主菌,实现了脂肪酶B的高效分泌表达,获得了高产脂肪酶B表达菌株。通过对发酵条件的优化,该菌株液体发酵的上清液粗酶液表达水平可达4g/L。脂肪酶B合成性酶活可达10600unit/L。(The invention discloses an Aspergillus niger recombinant expression strain with high lipase B yield, a construction method and application thereof. A method for constructing recombinant Aspergillus niger expression bacteria is to construct a recombinant expression cassette containing lipase B, wherein the recombinant expression cassette is a gene fragment containing lipase B gene sequence, promoter, terminator, screening marker, upstream and downstream homologous sequence and other elements. The lipase B-producing Aspergillus niger recombinant expression strain constructed according to the method of the invention. The invention relates to application of a recombinant expression strain of a lipase B-producing Aspergillus niger in expression of lipase B. The expression cassette of the lipase B is constructed by means of genetic engineering and is introduced into an Aspergillus niger expression host bacterium, so that the efficient secretory expression of the lipase B is realized, and the high-yield lipase B expression strain is obtained. By optimizing the fermentation conditions, the expression level of the crude enzyme liquid of the supernatant liquid fermented by the strain liquid can reach 4 g/L. The activity of the lipase B synthetic enzyme can reach 10600 unit/L.)
技术领域
本发明属于基因工程育种领域，涉及一种高产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株的构建及应用。
背景技术
脂肪酶B是一种具有双重脂类催化作用的生物催化剂。首先，脂肪酶B能够催化脂类水解，分解成醇类和脂肪酸类。其次，脂肪酶B在特定的条件下，还能够催化醇类和脂肪酸类物质脱水缩合，生成脂类。同时，在特定的条件下，它还可以催化脂类物质同相应的酸类物质或者醇类物质发生转酯化反应，生成新的脂类物质。因此，其与常规水解型脂肪酶是不同的。其被应用干酪制造、脂类改性、脂类水解，医药中间体生产，食品加工，生物柴油和润滑油生产等多种工业生产中。然而，由于其表达量相对较低，导致其价格较高，限制了其在工业界的广泛应用。因此，开发一种能够大量生产脂肪酶B的方法成为工业界的迫切需求。
脂肪酶B的生产来源主要是微生物发酵表达。然而，目前的发酵表达水平相对较低。比如，在《南极假丝酵母脂肪酶b高效表达及在选择性酰化方面的应用研究》中，表达量仅仅为0.24g/L。黑曲霉作为非常高效的工业生物发酵菌株，被用来表达一些需求量很大的工业化酶，比如糖化酶等。因此，使用黑曲霉表达脂肪酶B成为一种有潜在的高产可能性的工业化生产方法。然而，目前报道的使用黑曲霉作为宿主进行脂肪酶B表达的研究，表达量仍然很低(请参考：2019年文献《南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用》)。因此，发明一种能够更加高效的生产脂肪酶B的黑曲霉表达菌株，就显得尤为重要。
发明内容
本发明开发的使用黑曲霉作为宿主表达脂肪酶B的方法，以及相应的黑曲霉改造方法，实现了大量表达脂肪酶B的目标。表达量达到4g/L。合成性活性更是达到10600unit/L。
本发明提供了一种构建脂肪酶B重组黑曲霉表达菌株的方法。
本发明还提供了一种脂肪酶B重组表达载体。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含脂肪酶B基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含脂肪酶B基因序列、启动子、终止子、信号肽、筛选标记等元件的基因片段。
所述的脂肪酶B基因为曲霉、或青霉属来源脂肪酶B酶基因；优选为南极假丝酵母来源脂肪酶B基因；更进一步优选为具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述的宿主细胞为黑曲霉。
启动子可以是黑曲霉内源启动子：如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子等；也可以是外源启动子：如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子；本发明优选黑曲霉糖化酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶启动子。
与启动子3’末端连接的可以是调控序列：如合适的前导序列(5’UTR)，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。
为了分泌表达特定蛋白，需要信号肽序列介导，在黑曲霉中常用的信号肽序列有糖化酶信号肽，酸性淀粉酶信号肽，黑曲霉植酸酶信号肽，米曲霉TAKA淀粉酶信号肽，在本发明中利用的是脂肪酶B基因序列本身编码的信号肽。
优选的终止子从如下酶的基因获得：黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
特定的基因在与启动子，调控序列，信号肽序列及终止子相连接后形成表达盒。通过常规方法导入到黑曲霉基因组中，可以随机插入到基因组中，也可以定点整合到某个或多个基因座上。可选的基因座有gla(糖化酶)，amya(中性淀粉酶)，amyb(中性淀粉酶)，aa(酸性淀粉酶),agda(α葡萄糖苷酶)，agdb(α葡萄糖苷酶)。
所述表达盒优选地可以与一个或多个选择性标记连接，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞或菌株。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦)乙酰转移酶)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉的amdS或hyg。
所述表达盒优选地可以与一个或多个反向选择标记(负选择标记)连接。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶),hsvTK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)。
所述的表达盒优选核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
所述的表达盒通过常规方法导入随机插入到宿主黑曲霉基因组中，或定点整合到宿主黑曲霉的某个或多个基因座上。
所述的基因座选自糖化酶gla，中性淀粉酶amya，中性淀粉酶amyb，酸性淀粉酶aa,α葡萄糖苷酶agda，α葡萄糖苷酶agdb。
所述的宿主为敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因的黑曲霉。
按照本发明所述的方法构建的产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株。
一种重组表达载体，包含所述的含有脂肪酶B基因的表达盒。
本发明所述的产脂肪酶B黑曲霉重组表达菌株在生产脂肪酶B中的应用。
本发明的有益效果
本发明通过基因工程的手段，构建了脂肪酶B的表达盒，并将其导入黑曲霉表达宿主菌，实现了脂肪酶B的高效分泌表达，获得了高产脂肪酶B黑曲霉表达菌株。通过对发酵条件的优化，该菌株液体发酵表达水平可达10600unit/L。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：p-ZYAN01质粒图谱；
图2：p-ZYAN02-CALB质粒图谱；
图3：不同宿主表达脂肪酶B的对比，以及与其他研究的对比。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：p-ZYAN02-CALB质粒的构建
制备该质粒主要包含以下两个步骤：1.制备中间质粒p-ZYAN01。2.线性化中间质粒p-ZYAN01，并将脂肪酶B基因表达盒及上下游同源片段整合进p-ZYAN01，组成p-ZYAN02-CALB质粒
制备中间质粒p-ZYAN01方法如下：
p-ZYAN01主要由如下几部分及必须的连接序列结合而成，或者由以下几部分直接结合而成。
(1)pUC57质粒XbaI-PscI双酶切后得到的2305bp片段；
(2)hyg基因表达盒，序列见SEQ ID NO.3；
(3)amds表达盒，序列见SEQ ID NO.4。
将pUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段，hyg基因表达盒，以及amds表达盒，三个基因片段序列片段通过Gibson Master Mix Kit(E2611，New England Biolabs)进行重组，得到重组质粒p-ZYAN01(图1)。将脂肪酶B表达盒整合到黑曲霉糖化酶基因座以进行表达，使用糖化酶启动子和糖化酶终止子。构建脂肪酶B整合表达质粒p-ZYAN02-CALB。整合质粒构建方法如下：将p-ZYAN01质粒通过业界通用的方法进行线性化；以黑曲霉基因片段SEQ ID NO.5为5’端同源片段，以黑曲霉基因片段SEQ ID NO.6为3’端同源片段，每个片段长2000bp。将上述线性化的p-ZYAN01载体、同源片段和脂肪酶B表达盒片段通过GibsonMaster Mix Kit(E2611，New England Biolabs)进行重组，得到整合质粒p-ZYAN02-CALB，该整合质粒包含脂肪酶B表达盒，该表达盒包含了黑曲霉糖化酶启动子序列，南极假丝酵母来源的脂肪酶B序列以及黑曲霉糖化酶终止子序列，经测序确认序列，质粒图谱见图示2。
实施例2：脂肪酶B表达盒的转化整合
本实施例出发菌株为ZYAN05，是由常规菌株经敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因后获得的。黑曲霉中上述基因敲除/敲入方法可参考专利C N103937766A或CN 104962594A实施例中公开的技术方法实现。即参照Delmas(Appl EnvironMicrobiol.2014,80(11):3484-7)等人描述的方法。具体地，利用环状DNA载体，包含有上述5’及3’同源序列，选择标记，以及大肠杆菌复制序列。将环状载体转入到黑曲霉中，通过选择获得重组菌株。
采用原生质体转化法将p-ZYAN02-CALB质粒导入黑曲霉菌株ZYAN05，具体操作步骤如下：原生质体的制备：在营养丰富的TZ液体培养基(牛肉膏粉0.8％；酵母浸膏0.2％；蛋白胨0.5％；NaCl 0.2％；蔗糖3％；pH5.8)中培养黑曲霉菌丝体。通过mira-cloth(Calbiochem公司)从培养液中过滤菌丝体并用0.7M NaCl(pH5.8)洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1％(Sigma)、蜗牛酶1％(Sigma)和溶壁酶(Sigma)0.2％的酶解液(pH5.8)中，30℃，65rpm酶解3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经3000rpm，4℃温和离心10min后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用STC溶液(1MDSorbitol、50mM CaCl2、10mM Tris，pH7.5)洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC溶液中。
将环状p-ZYAN02-CALB质粒10μl(浓度为：100ng/μl)加入到100μl原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min；然后分3次共加入900μl PEG溶液，混匀后室温放置25min；3000rpm，常温离心10min，弃上清，原生质体附着于管壁上，将其重悬于1ml STC溶液中。把该悬浮液与预先降温至45℃左右的培养基(乙酰胺0.3％、蔗糖20％、琼脂0.7％)混合并铺平板；待平板凝固后放入34℃培养箱中培养；24h后在平板上再铺一层含300ng/μl潮霉素(Hygromycin)的固体培养基(琼脂1％，其余成分同上)，继续将平板置于34℃培养箱中培养4-5天后，长出上层培养基的转化子称为整合转化子。随机挑取几个整合转化子分别传代于含300ng/μl潮霉素(Hygromycin)的固体培养基上，34℃恒温培养3天后，收集菌丝体用液氮冷冻后研磨粉碎，然后用真菌基因组提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取整合转化子基因组DNA，最后对整合转化子基因组DNA进行PCR鉴定。PCR产物经测序后确认整合到糖化酶基因座。阳性转化子经PCR产物测序后确认后得到重组表达菌株。
实施例4重组表达菌种液体发酵生产脂肪酶B
斜面培养：将所述黑曲霉重组表达菌株取一接种环菌苔接种于PDA固体斜面，35℃下恒温培养60h；摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始pH5.5、35℃、摇床转速200rpm条件下培养72h左右。下表是250ml摇瓶3批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为合成性酶活10600unit/L，上清液粗蛋白量4g/L。
批次
发酵周期(h)
发酵酶活(unit/L)
粗蛋白量(g/L)
1
72
9995
3.8g/L
2
78
12030
4.4g/L
3
75
9775
3.8g/L
所述斜面培养基如下：蔗糖20g，NaNO3 2g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，K2HPO4 1g，琼脂20g，将上述各组分溶于1000mL水中，调节pH至5.5,121℃灭菌20min，备用。
所述摇瓶种子培养基如下：麦芽汁200mL，豆饼粉5g，调节pH至5.5,121℃灭菌20min，备用。
同时，使用未改造的黑曲霉菌种进行同样的摇瓶培养，取上清液进行检测，未检测到脂肪酶B合成性酶活。使用两种菌种的上清液进行SDS-PAGE测试(测试方法为行业通用的常规方法)，经改造的黑曲霉菌种的发酵上清液产生出大量的脂肪酶B(图示3A，箭头所示)。而相应的，未改造的黑曲霉脂肪酶B菌种没有产生能检测到的脂肪酶B蛋白条带。同时，对照研究(《南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用》)的SDS-PAGE中脂肪酶B条带显示，其表达量远远低于本发明的表达量，如图示3B所示，图3B摘引自文章：南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用。作者：张玲敏，王斌，潘力。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180917-178)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京正扬生物科技有限公司
<120> 一种能够大量表达南极假丝酵母脂肪酶B的黑曲霉重组菌株及其构建方法及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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