具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种六价铬还原菌株，所述菌株是通过在出发菌株黑曲霉中过表达六价铬还原酶编码基因chrB和/或铬转运蛋白编码基因sulB和/或超氧化物酶编码基因sodA获得的。

较优地，所述出发菌株黑曲霉为黑曲霉S469。

上述出发菌株S469是发明人前期获得的授权专利(中国专利，专利号：ZL201810985901.9)中所用菌株。

较优地，控制基因转录的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA和丙酮酸激酶基因启动子PpkiA，其他的可在黑曲霉中发挥转录作用的启动子也可实现使上述基因表达上调的目的。

较优地，所述六价铬还原酶编码基因chrB的DNA序列为SEQ NO.1以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.2以及相似性80％以上的氨基酸序列。

较优地，所述铬转运蛋白编码基因sulB的DNA序列为SEQ NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列。

较优地，所述超氧化物酶编码基因sodA的DNA序列为SEQ NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。

如上所述的六价铬还原菌株在还原六价铬方面中的应用。

上述用于高效还原Cr(Ⅵ)菌株具备还原含Cr(Ⅵ)水溶液、工业废水中Cr(Ⅵ)等水体中Cr(Ⅵ)的能力。

上述用于高效还原合成含Cr(Ⅵ)水溶液、工业废水中Cr(Ⅵ)菌株经过菌株改造或工艺改良，可满足还原其他介质中Cr(Ⅵ)的能力。

如上所述的六价铬还原菌株的获得方法，步骤如下：

在黑曲霉中使六价铬还原酶编码基因chrB，铬转运蛋白编码基因sulB和超氧化物酶编码基因sodA中的一种或两种以上的表达量上调。

一种利用如上所述的六价铬还原菌株的生物法还原Cr(Ⅵ)方法，步骤如下：

将六价铬还原菌株培养后收集菌体，加入到含Cr(Ⅵ)的水体中进行孵育。

较优地，水体中含Cr(Ⅵ)的浓度为0-100mg/L，孵育温度为10-40℃，搅拌速率为0-300rpm，处理时间10-96h。

较优地，具体方法为：应用上述方法获得的黑曲霉菌株，收获其孢子，以2×10⁶个/mL接种于黑曲霉液体培养基中，10-40℃，100-300rpm条件下培养36-72h收获菌体。滤布过收获菌体，PBS缓冲液冲洗菌体2-4次，然后将菌体转接至含有0-100mg/LCr(Ⅵ)的水体中，10-40℃，100-300rpm条件下共同孵育96h，取上清液测定六价铬的剩余量，Cr(Ⅵ)的去除率大于90％。

较优地，上述Cr(Ⅵ)还原技术中黑曲霉液体培养基主要成分如下：0％～10％蔗糖，0％～0.6％(NH₄)₂SO₄，0％～0.2％MgSO₄·7H₂O，0％～0.2％KH₂PO₄，0％～0.1％酵母提取物。

具体地，相关制备及检测如下：

实施例1

过表达铬还原酶基因chrB质粒的获取：

质粒pLH864(图1)是由pLH454(本申请人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)载体经改造而来。所述基因chrB序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA控制转录。

具体获取过程如下：以S469菌株cDNA为模板，chrB-F、chrB-R为引物进行PCR扩增chrB基因序列片段，其核苷酸序列为SEQ NO.1，长度为606bp，其氨基酸序列为SEQ NO.2，长度为201aa；应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将chrB基因序列片段与经Kpn I单酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经单酶切验证(图2)获得质粒pLH864。扩增chrB基因序列片段设计引物为chrB-F、chrB-R(表1)。

实施例2

铬还原酶基因chrB过表达黑曲霉菌株的获取：

将含有质粒pLH864的农杆菌与黑曲霉宿主菌株S469在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的chrB基因过表达菌株chrB/OE。

实施例3

过表达硫酸转运蛋白基因sulB质粒的获取：

质粒pLH969(图3)是由pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)载体经改造而来。所述基因sulB序列片段由黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA控制转录。

具体获取如下：以S469菌株cDNA为模板，sulB-F、sulB-R为引物进行PCR扩增sulB基因序列片段，其核苷酸序列为SEQ NO.3，长度为2193bp；其氨基酸序列为SEQ NO.4，长度为730aa；应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将sulB基因序列片段与经EcoR I和BamH I双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图4)获得质粒pLH969。扩增sulB基因序列片段设计引物为sulB-F、sulB-R(表1)。

实施例4

硫酸转运蛋白基因sulB过表达黑曲霉菌株的获取：

将含有质粒pLH969的农杆菌与实施例2中黑曲霉chrB/OE菌株的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的chrB,sulB基因共过表达菌株(chrB,sulB)/OE。

实施例5

过表达超氧化物歧化酶基因sodA质粒的获取：

质粒pLH1032(图5)是由pLH509(发明人前期授权专利，专利号：ZL201810985901.9)载体经改造而来。所述基因sodA序列片段由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制转录。

具体获取过程如下：以S469菌株cDNA为模板，sodA-F、sodA-R为引物进行PCR扩增sodA基因序列片段，其核苷酸序列为SEQNO.5，长度为465bp；其氨基酸序列为SEQNO.6，长度为154aa；应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将sodA基因序列片段与经EcoR I和Kpn I双酶切线性化后的出发载体pLH509进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图6)获得质粒pLH1032。扩增sodA基因序列片段设计引物为sodA-F、sodA-R(表1)。

实施例6

超氧化物歧化酶基因sodA过表达黑曲霉菌株的获取：

将含有质粒pLH1032的农杆菌与实施例4中黑曲霉(chrB,sulB)/OE菌株的孢子在IM平板共培养，然后将共培养物转接于含有200μM头孢噻肟，100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL链霉素，250μg/mL潮霉素B的CM平板中，28℃培养直至形成单克隆。挑取单克隆转接于含有潮霉素B的PDA平板，筛选潮霉素B抗性转化子提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上切除，获得潮霉素敏感的sodA基因过表达菌株(chrB,sulB,sodA)/OE。

实施例7

定性、定量分析Cr(Ⅵ)对黑曲霉菌株S469和(chrB,sulB,sodA)/OE细胞中ROS水平的影响。

显微观察和活性氧定量分析：

(1)在黑曲霉液体培养基中接种2×10⁶个/mL上述黑曲霉孢子，10-40℃，100-300rpm摇床培养36-72h后，添加0-50μg/mL六价铬处理5-12h；

(2)4℃条件下，3000rpm离心，收集菌丝体。PBS清洗菌丝体3次，与10mM DCFH-DA(活性氧测定试剂6-羧基-2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯)于37℃黑暗条件下共同孵育20-30min，每隔3-5min，颠倒混匀；

(3)孵育结束后，用PBS清洗菌丝体3-5次。

(4)取部分处理后的菌丝置于载玻片上，制片，荧光显微镜观察，并拍照记录(图7)。

(5)PBS重悬经DCFH-DA标记的菌体，分装到96孔板中(每个孔分装200μL)，三个平行。将96孔板放入多功能酶标仪成像系统，测定荧光强度(图8)。

实施例8

生物法还原水体中Cr(Ⅵ)技术：

收集上述黑曲霉(chrB,sulB,sodA)/OE菌株的孢子，以2×10⁶个/mL接种于50mL黑曲霉液体培养基中，10-40℃，100-300rpm条件下培养36-72h后，滤布过滤收获菌体，PBS缓冲液冲洗菌体2-4次，然后将菌体转接至含有0-100mg/L Cr(Ⅵ)的PBS加酵母浸出物培养基中，10-40℃，100-300rpm条件下共同孵育96h，每隔一定的时间取样，12000rpm，离心10-20min，利用二苯碳酰二肼分光光度法(GB/T 7467-1987)测定上清液中Cr(Ⅵ)的浓度变化，Cr(Ⅵ)去除率大于99％(图9)。

优选的，上述Cr(Ⅵ)还原技术中黑曲霉液体培养基主要成分如下：0％～10％蔗糖，0％～0.6％(NH₄)₂SO₄，0％～0.2％MgSO₄·7H₂O，0％～0.2％KH₂PO₄，0％～0.1％酵母提取物。

PBS缓冲液的成分：0％～1.5％NaCl，0％～0.1％KCl，0％～0.5％Na₂HPO₄，0％～0.1％KH₂PO₄。

实施例9

高效还原Cr(Ⅵ)菌株还原含Cr(Ⅵ)的某电镀企业废水的技术：

从天津某电镀企业取车间总废水排放口取一定量含Cr(Ⅵ)废水，测定其Cr(Ⅵ)浓度为83.6mg/L。收获实施例6中黑曲霉(chrB,sulB,sodA)/OE菌株孢子，以2×10⁶个/mL接种于50mL黑曲霉液体培养基中，10-40℃，100-300rpm条件下培养36-72h后，滤布过滤收获菌体，将菌体转接至上述取自电镀企业的含Cr(Ⅵ)废水中，并设置不添加黑曲霉菌体的对照组。10-40℃，100-300rpm条件下共同孵育96h，每隔一定的时间取样，12000rpm，离心10-20min，利用二苯碳酰二肼分光光度法(GB/T 7467-1987)测定上清液中Cr(Ⅵ)的浓度变化。如图10所示，未添加黑曲霉菌丝体的废水中，Cr(Ⅵ)浓度未发生明显变化。加入黑曲霉菌丝体的废水中Cr(Ⅵ)浓度降到5.02mg/L，还原率达94％，能快速有效地去除废水中的六价铬(图10)。

表1实施例中所用引物序列

其中，(1)上述LB培养基组分为：

0％～2％胰蛋白胨，0％～1％酵母浸出物，0％～2％NaCl，pH调至7.0-7.2，固体培养基加1.5％(W/V)的琼脂粉。121℃灭菌20min。灭菌完毕冷却至50-60℃左右时加入卡那霉素至终浓度100μg/mL。

(2)上述PDA培养基组分为：马铃薯100-500g，切成小块，加500-3000mL水煮沸20-40min，用双层纱布滤成清液。然后加入10-50g葡萄糖完全溶解，加水定容至500-3L。固体培养1.5％(W/V)的琼脂粉。121℃，20min高压灭菌。

(3)上述IM培养基组分为：

15～20g琼脂粉，加水至905.7mL，121℃灭菌20min，微波加热待琼脂完全溶解后，加入：0％～0.1％K buffer，0％～5％MN buffer，0％～0.2％1％CaCl₂·2H₂O，0％～2％0.01％FeSO₄，0％～1％IM Trace elements，0％～1％20％NH₄NO₃，0％～2％50％甘油，0％～6％1M MES，0％～1％20％葡萄糖。

所述IM培养基中所需试剂的配制：

1)K buffer：将1.25M K₂HPO₄加入到1.25M KH₂PO₄使得pH为4.8。

(a)：1.25M KH₂PO₄：KH₂PO₄17.01g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。

(b)：1.25M K₂HPO₄：K₂HPO₄21.77g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。

2)MN buffer：0％～0.6％MgSO₄·7H₂O，0％～0.3％NaCl，加入去离子水溶解，121℃灭菌20min。

3)1％CaCl₂：CaCl₂·2H₂O1g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。

4)0.01％FeSO₄：FeSO₄·7H₂O 0.01g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。

5)IM Trace elements：0％～0.05％ZnSO₄·7H₂O，0％～0.05％CuSO₄·5H₂O，0％～0.05％H₃BO₃，0％～0.05％MnSO₄·H₂O，0％～0.05％Na₂MoO₄·2H₂O，加入去离子水溶解，121℃灭菌20min。

6)20％NH₄NO₃：加入NH₄NO₃20g，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。

7)50％甘油：甘油50mL，加入去离子水定容至100mL，121℃灭菌20min。

8)1M MES：MES 19.524g，加入去离子水定容至100mL，加入NaOH调节pH为5.5，过滤除菌。黑暗下保存一个月，或分装后与-20℃下保存。

9)20％葡萄糖：葡萄糖20g，加入ddH₂O定容至100mL，115℃灭菌20min。

(4)上述CM培养基组分为：

15～20g琼脂粉，加水到897mL，121℃灭菌20min。微波加热待琼脂完全溶解后，加入：0％～5％ASP+N，0％～5％50％葡萄糖，0％～0.5％1M MgSO₄，0％～0.5％CM Traceelements，0％～5％10％酪蛋白水解物，0％～10％10％酵母浸出物。

所述CM培养基中所需试剂的配制：

1)ASP+N：0％～0.5％KCl(350mM)，0％～1.5％KH₂PO₄(550mM)，0％～5％NaNO₃(3.5M)，加入去离子水溶解，pH5.5(5MKOH)，121℃灭菌20min。

2)50％葡萄糖：葡萄糖50g，加入ddH₂O定容至100mL，115℃灭菌20min。

3)1M MgSO₄：MgSO₄24.648g，加入ddH₂O定容至100mL，121℃灭菌20min。

4)CM Trace elements：0％～0.5％ZnSO₄·7H₂O(76mM)，0％～0.3％H₃BO₃(178mM)，0％～0.1％MnCl₂·4H₂O，0％～0.1％FeSO₄·7H₂O，0％～0.05％CoCl₂·6H₂O，0％～0.05％CuSO₄·5H₂O，0％～0.04％Na₂MoO₄·2H₂O，0％～1％EDTA，加入去离子水溶解，121℃灭菌20min。

5)10％酪蛋白水解物：酪蛋白水解物10g，加入ddH₂O定容至100mL，121℃灭菌20min。

6)10％酵母浸出物：酵母浸出物10g，加入ddH₂O定容至100mL，121℃灭菌20min。

(5)上述MM培养基组分：0％～5％Vogel'sSalts，0％～3％葡萄糖，0％～3％琼脂，蒸馏水溶解。121℃灭菌20min。

所述MM培养基中所需试剂的配制：

1)Vogel's 50×salts：0％～20％柠檬酸钠，0％～40％KH₂PO₄，0％～20％NH₄NO₃，0％～3％MgSO₄·7H₂O，0％～0.2％CaCl₂·2H₂。0％～1％微量元素溶液，0％～0.5％生物素溶液，蒸馏水溶解，加0％～0.1％氯仿作为防腐剂，室温下保存。

2)微量元素溶液：0％～0.1％柠檬酸·H₂O，0％～0.1％ZnSO₄·7H₂O，0％～0.2％Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O，0％～0.05％CuSO₄·5H₂O，0％～0.01％MnSO₄·H₂O，0％～0.01％H₃BO₃，0％～0.1％Na₂MoO₄·2H₂O，蒸馏水溶解，加0％～0.1％氯仿作为防腐剂，室温下保存。

3)生物素溶液：0％～0.5％生物素，蒸馏水溶解，-20℃保存。

序列表

SEQ.NO.1：chrB的核苷酸序列606bp

ATGCCTCCCTCTATCGGCCTCATAATCTGCAGCCAACGCACTCCACGCGCAGGCCCTCAAATCGCCACCTTCATTCACAATACTATTCGTGAATCCTACCCCCCCGAAACAGCCACAATTACGACCATTGACCTAGCAAAATGGAACCTTCCACTCTACAATGAGTCGGGGATGCCATCGTTCATCAACTCAGCGGACGAGTACGAGCACGAGCACACAAAGGCCTGGTCACGGGAGATATCGCGCCACGAAGCGTTTATTTTCGTCACACCGCAGTATAACTGGGGGTATCCCGCAAGCGTGAAGAATGCGATTGATTACTTGTTCCATGAGTGGAAGGGAAAGGCGGCGTTGGTGGTGAGCTATGGGGGGCATGGGGGCGGGAAGGCGGCGGCGCAATTGAGGCAGGTGTTGCAGGGGGTGAGGATGAGGCCATTGGAGAGGATGGTCGAGCTGAGGTTTCCGGAGATCGAGGAAGTTAAGAGGGCCGCTAAGGGGGAGGATCTGGGACTGAATGGTGAGGGAGGGTATTGGGCTGGGGAGAGGGAGGGGATTAAGGCTGCGTTTGGGGAATTGATTGCTGCGCTGGAGGGAGAGGCTGAATAG

SEQ.NO.2：chrB的氨基酸序列201aa

MPPSIGLIICSQRTPRAGPQIATFIHNTIRESYPPETATITTIDLAKWNLPLYNESGMPSFINSADEYEHEHTKAWSREISRHEAFIFVTPQYNWGYPASVKNAIDYLFHEWKGKAALVVSYGGHGGGKAAAQLRQVLQGVRMRPLERMVELRFPEIEEVKRAAKGEDLGLNGEGGYWAGEREGIKAAFGELIAALEGEAE

SEQ.NO.3：sulB的核苷酸序列2193bp

ATGACGGATCCCAATCCGCAGGGCGGACACCTCGAACACCGCTCTTTGCGGGATTGGCTTGCCAACTTCTTCCGAGCACCTTTGTCAAACAGTTCTGCAGATTCTCCGCCTGAACGGATTCCCGAGACCTTAGAACCGAATGATAGAACCCGCTTGTTGAAATTGGACGATGGTCAAGGTCCCGCATACGGTACAAGAGATGGTTTATCGACGCCGCAGGTTGACGGTGGGCCTGAAGGACATATTCGGAACGGGAATGGAAGCCCGACGTTCGTACAAGGGCCGGAGAACCTGCCTCCCAGGACTGGGTCAGGCCTGGCATGGCCTGTGAAGAACCATAAGACTATGTACCTCTCATACTACATCCCGTTCTTCAACTGGATCACACAATATCGCTGGTCTTTCCTCCGAGGCGACTTAATTGCAGCCTTGACAATCGCGTCAATCTACATTCCCATGGCCCTATCTTTGGCTTCGAACCTCGCCCATGCACCAGCCATCAACGGCCTTTACTCATTCGTTTTCATGCCACTGCTTTATGCAATTCTAGGAAGCAGTCCTCTGCTCGTTGTTGGTCCGGAAGCAGCTGGGTCGCTATTGACGGGAACAATCGTTAAAACTAGCGTCAAACAAGGCCACTCGCAGGAGGATGATGAGGCCGCAAGCGCAATGGTTGTAGGCATAGCCACTGCCATGGCAGGAGCAATGATACTAGTCGCTGGACTGACTAGGCTGGGTTTCCTGGACAATGTACTCAGTCGGCCTTTTTTGAGAGGCTTCATTACTGCCATTGGCTTTGTCATCTTTGTTGACCAGCTCATCCCGGAGGTTGGACTGGCAGACTTGGCCAAAGAGGCCGGTGTCAGTCATGGCAGCACAGTGCAGAAGCTTGTCTTTCTTGCTGGGAATATCAAAAGCTGTCATGGTCTTACAGCTGCTGTATCCTTCGGAAGTTTTGCAATCATTATGCTCTTTCGAACAATCAAAAAAGCACTAGAACCACGATACCCTCAGGTCGTATACTTCCCCGACCGTATCCTTGTCGTGATCCTCTCGGCCATTCTGACCTGGCGTCTTGGTTGGTACGAGCAGGGGCTGGAAGTTCTGGGGTCGGTTCAGAACACTGCCACTGGGCTCTTCGCCTTCAGGTGGCCCTTCCAAATCAAACATCTGAAGCATGTGCGCACCGCCATGAGCACCTCCTTCATCATTGCTATCCTTGGCTTCTTCGAGTCCTCGGTTGCTGCCAAGGGGCTCGGGGAGAGACGAGACGGGGTCCAAGGCATGTCTGTCAGTGCGAATAGGGAGATGGTTGCTCTGGGCGTTGCTAATGTGGTTGGGGGCTGCTTTATGGCTCTCCCTGCCTTTGGTGGATACGGACGGAGCAAAGTCAACGCCTCTACGGGCGCTCGCTCTCCTATGAGCAGTATCTTCCTCAGTATTATCACCTTCATTGTTATTATGGTGCTCTTGCCGTACCTATACTATCTTCCTAAAGCTGTACTATGCTCTACGATATCGGTCGTCGCATACAGTCTTATAGAGGAATGTCCTCACGACGTTGCCTTCTTCATCCGGCTGCGTGGTTGGACAGAGCTTGCATTGATGCTTCTCATCTTCGTCTCCACTATATTCTACTCGCTGGAGCTGGGTATCGCGCTTGGCATTGGGCTCTCAATCCTGATCCTTATTCGCCACTCCACCCAGCCTCGCATACAGATTCTCGGGAAAATAGCTGGAACACCCGACCAATACGATAACGCCGAAATGCATGCGGAAAATGTGGAGCTCATTGACGGTGCCCTTGTTGTTAAGATCCCCGAGCCGCTCACCTTCGCCAACACTGGCGATCTCAAGAATCGCTTGCGCCGCCTAGAGTTCTACGGCTCAAATCGCGCACATCCGTCCCTTCCACGGTTGCGCCCCCCGGAATCAAATAAGAATGTTATCTTCGACGTTCACGGTGTTACGAGCATTGATGGCTCCGGTACGCAGGTCCTCTCCGAGATCGTTAATGATTACATCAATCTCGGAGTAAGCGTGTATTTCTGTCGGCTTTCGAACCGCAGCGTCTTCCGCATGTTCGAAAGAAGCGGCATAGTCGACCGGTGTGGAGGCATGTCTCATTTTGTCACCGGTGTTGATGAGGCGCTTCGGCTCGCTGAGTCGGAAGGCCATGCATCGGAACCTTGA

SEQ.NO.4：sulB的氨基酸序列730aa

MTDPNPQGGHLEHRSLRDWLANFFRAPLSNSSADSPPERIPETLEPNDRTRLLKLDDGQGPAYGTRDGLSTPQVDGGPEGHIRNGNGSPTFVQGPENLPPRTGSGLAWPVKNHKTMYLSYYIPFFNWITQYRWSFLRGDLIAALTIASIYIPMALSLASNLAHAPAINGLYSFVFMPLLYAILGSSPLLVVGPEAAGSLLTGTIVKTSVKQGHSQEDDEAASAMVVGIATAMAGAMILVAGLTRLGFLDNVLSRPFLRGFITAIGFVIFVDQLIPEVGLADLAKEAGVSHGSTVQKLVFLAGNIKSCHGLTAAVSFGSFAIIMLFRTIKKALEPRYPQVVYFPDRILVVILSAILTWRLGWYEQGLEVLGSVQNTATGLFAFRWPFQIKHLKHVRTAMSTSFIIAILGFFESSVAAKGLGERRDGVQGMSVSANREMVALGVANVVGGCFMALPAFGGYGRSKVNASTGARSPMSSIFLSIITFIVIMVLLPYLYYLPKAVLCSTISVVAYSLIEECPHDVAFFIRLRGWTELALMLLIFVSTIFYSLELGIALGIGLSILILIRHSTQPRIQILGKIAGTPDQYDNAEMHAENVELIDGALVVKIPEPLTFANTGDLKNRLRRLEFYGSNRAHPSLPRLRPPESNKNVIFDVHGVTSIDGSGTQVLSEIVNDYINLGVSVYFCRLSNRSVFRMFERSGIVDRCGGMSHFVTGVDEALRLAESEGHASEP

SEQ.NO.5：sodA的核苷酸序列465bp

ATGGTCAAGGCTGTCGCTGTTATCCGTGGAGACTCTAAGGTCTCCGGCACTGTCACTTTCGAGCAGGCCAACGAGAACACCCCCACCACCATCTCCTGGAACATCACTGGCCACGACGCCAACGCTGAGCGTGGCTTCCACGTCCACCAGTTCGGTGACAACACCAACGGCTGCACCTCCGCTGGCCCTCACTTCAACCCCTTCGGCAAGACCCACGGTGCTCCCGAGGACGACGAGCGTCACGTCGGTGACCTTGGCAACTTCAAGACCGATGCCGAGGGTAACGCCGTTGGTTCCAAGCAGGACAAGCTGGTGAAGCTCATCGGTGCTGAGAGCGTCCTGGGCCGGACCCTGGTCGTCCACGCTGGTACTGATGACCTTGGCCGTGGTGGCAACGAGGAGTCCAAGAAGACCGGTAACGCTGGTCCTCGTCCCGCTTGCGGTGTCATTGGCATTGCTGCTTAA

SEQ.NO.6：sodA的氨基酸序列154aa

MVKAVAVIRGDSKVSGTVTFEQANENTPTTISWNITGHDANAERGFHVHQFGDNTNGCTSAGPHFNPFGKTHGAPEDDERHVGDLGNFKTDAEGNAVGSKQDKLVKLIGAESVLGRTLVVHAGTDDLGRGGNEESKKTGNAGPRPACGVIGIAA

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种六价铬还原菌株、方法及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 606

<212> DNA/RNA

<213> chrB的核苷酸序列(Unknown)

<400> 1

atgcctccct ctatcggcct cataatctgc agccaacgca ctccacgcgc aggccctcaa 60

atcgccacct tcattcacaa tactattcgt gaatcctacc cccccgaaac agccacaatt 120

acgaccattg acctagcaaa atggaacctt ccactctaca atgagtcggg gatgccatcg 180

ttcatcaact cagcggacga gtacgagcac gagcacacaa aggcctggtc acgggagata 240

tcgcgccacg aagcgtttat tttcgtcaca ccgcagtata actgggggta tcccgcaagc 300

gtgaagaatg cgattgatta cttgttccat gagtggaagg gaaaggcggc gttggtggtg 360

agctatgggg ggcatggggg cgggaaggcg gcggcgcaat tgaggcaggt gttgcagggg 420

gtgaggatga ggccattgga gaggatggtc gagctgaggt ttccggagat cgaggaagtt 480

aagagggccg ctaaggggga ggatctggga ctgaatggtg agggagggta ttgggctggg 540

gagagggagg ggattaaggc tgcgtttggg gaattgattg ctgcgctgga gggagaggct 600

gaatag 606

<210> 2

<211> 201

<212> PRT

<213> chrB的氨基酸序列(Unknown)

<400> 2

Met Pro Pro Ser Ile Gly Leu Ile Ile Cys Ser Gln Arg Thr Pro Arg

1 5 10 15

Ala Gly Pro Gln Ile Ala Thr Phe Ile His Asn Thr Ile Arg Glu Ser

20 25 30

Tyr Pro Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr Thr Ile Asp Leu Ala Lys Trp

35 40 45

Asn Leu Pro Leu Tyr Asn Glu Ser Gly Met Pro Ser Phe Ile Asn Ser

50 55 60

Ala Asp Glu Tyr Glu His Glu His Thr Lys Ala Trp Ser Arg Glu Ile

65 70 75 80

Ser Arg His Glu Ala Phe Ile Phe Val Thr Pro Gln Tyr Asn Trp Gly

85 90 95

Tyr Pro Ala Ser Val Lys Asn Ala Ile Asp Tyr Leu Phe His Glu Trp

100 105 110

Lys Gly Lys Ala Ala Leu Val Val Ser Tyr Gly Gly His Gly Gly Gly

115 120 125

Lys Ala Ala Ala Gln Leu Arg Gln Val Leu Gln Gly Val Arg Met Arg

130 135 140

Pro Leu Glu Arg Met Val Glu Leu Arg Phe Pro Glu Ile Glu Glu Val

145 150 155 160

Lys Arg Ala Ala Lys Gly Glu Asp Leu Gly Leu Asn Gly Glu Gly Gly

165 170 175

Tyr Trp Ala Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Ala Ala Phe Gly Glu Leu

180 185 190

Ile Ala Ala Leu Glu Gly Glu Ala Glu

195 200

<210> 3

<211> 2193

<212> DNA/RNA

<213> sulB的核苷酸序列(Unknown)

<400> 3

atgacggatc ccaatccgca gggcggacac ctcgaacacc gctctttgcg ggattggctt 60

gccaacttct tccgagcacc tttgtcaaac agttctgcag attctccgcc tgaacggatt 120

cccgagacct tagaaccgaa tgatagaacc cgcttgttga aattggacga tggtcaaggt 180

cccgcatacg gtacaagaga tggtttatcg acgccgcagg ttgacggtgg gcctgaagga 240

catattcgga acgggaatgg aagcccgacg ttcgtacaag ggccggagaa cctgcctccc 300

aggactgggt caggcctggc atggcctgtg aagaaccata agactatgta cctctcatac 360

tacatcccgt tcttcaactg gatcacacaa tatcgctggt ctttcctccg aggcgactta 420

attgcagcct tgacaatcgc gtcaatctac attcccatgg ccctatcttt ggcttcgaac 480

ctcgcccatg caccagccat caacggcctt tactcattcg ttttcatgcc actgctttat 540

gcaattctag gaagcagtcc tctgctcgtt gttggtccgg aagcagctgg gtcgctattg 600

acgggaacaa tcgttaaaac tagcgtcaaa caaggccact cgcaggagga tgatgaggcc 660

gcaagcgcaa tggttgtagg catagccact gccatggcag gagcaatgat actagtcgct 720

ggactgacta ggctgggttt cctggacaat gtactcagtc ggcctttttt gagaggcttc 780

attactgcca ttggctttgt catctttgtt gaccagctca tcccggaggt tggactggca 840

gacttggcca aagaggccgg tgtcagtcat ggcagcacag tgcagaagct tgtctttctt 900

gctgggaata tcaaaagctg tcatggtctt acagctgctg tatccttcgg aagttttgca 960

atcattatgc tctttcgaac aatcaaaaaa gcactagaac cacgataccc tcaggtcgta 1020

tacttccccg accgtatcct tgtcgtgatc ctctcggcca ttctgacctg gcgtcttggt 1080

tggtacgagc aggggctgga agttctgggg tcggttcaga acactgccac tgggctcttc 1140

gccttcaggt ggcccttcca aatcaaacat ctgaagcatg tgcgcaccgc catgagcacc 1200

tccttcatca ttgctatcct tggcttcttc gagtcctcgg ttgctgccaa ggggctcggg 1260

gagagacgag acggggtcca aggcatgtct gtcagtgcga atagggagat ggttgctctg 1320

ggcgttgcta atgtggttgg gggctgcttt atggctctcc ctgcctttgg tggatacgga 1380

cggagcaaag tcaacgcctc tacgggcgct cgctctccta tgagcagtat cttcctcagt 1440

attatcacct tcattgttat tatggtgctc ttgccgtacc tatactatct tcctaaagct 1500

gtactatgct ctacgatatc ggtcgtcgca tacagtctta tagaggaatg tcctcacgac 1560

gttgccttct tcatccggct gcgtggttgg acagagcttg cattgatgct tctcatcttc 1620

gtctccacta tattctactc gctggagctg ggtatcgcgc ttggcattgg gctctcaatc 1680

ctgatcctta ttcgccactc cacccagcct cgcatacaga ttctcgggaa aatagctgga 1740

acacccgacc aatacgataa cgccgaaatg catgcggaaa atgtggagct cattgacggt 1800

gcccttgttg ttaagatccc cgagccgctc accttcgcca acactggcga tctcaagaat 1860

cgcttgcgcc gcctagagtt ctacggctca aatcgcgcac atccgtccct tccacggttg 1920

cgccccccgg aatcaaataa gaatgttatc ttcgacgttc acggtgttac gagcattgat 1980

ggctccggta cgcaggtcct ctccgagatc gttaatgatt acatcaatct cggagtaagc 2040

gtgtatttct gtcggctttc gaaccgcagc gtcttccgca tgttcgaaag aagcggcata 2100

gtcgaccggt gtggaggcat gtctcatttt gtcaccggtg ttgatgaggc gcttcggctc 2160

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<210> 4

<211> 730

<212> PRT

<213> sulB的氨基酸序列(Unknown)

<400> 4

Met Thr Asp Pro Asn Pro Gln Gly Gly His Leu Glu His Arg Ser Leu

1 5 10 15

Arg Asp Trp Leu Ala Asn Phe Phe Arg Ala Pro Leu Ser Asn Ser Ser

20 25 30

Ala Asp Ser Pro Pro Glu Arg Ile Pro Glu Thr Leu Glu Pro Asn Asp

35 40 45

Arg Thr Arg Leu Leu Lys Leu Asp Asp Gly Gln Gly Pro Ala Tyr Gly

50 55 60

Thr Arg Asp Gly Leu Ser Thr Pro Gln Val Asp Gly Gly Pro Glu Gly

65 70 75 80

His Ile Arg Asn Gly Asn Gly Ser Pro Thr Phe Val Gln Gly Pro Glu

85 90 95

Asn Leu Pro Pro Arg Thr Gly Ser Gly Leu Ala Trp Pro Val Lys Asn

100 105 110

His Lys Thr Met Tyr Leu Ser Tyr Tyr Ile Pro Phe Phe Asn Trp Ile

115 120 125

Thr Gln Tyr Arg Trp Ser Phe Leu Arg Gly Asp Leu Ile Ala Ala Leu

130 135 140

Thr Ile Ala Ser Ile Tyr Ile Pro Met Ala Leu Ser Leu Ala Ser Asn

145 150 155 160

Leu Ala His Ala Pro Ala Ile Asn Gly Leu Tyr Ser Phe Val Phe Met

165 170 175

Pro Leu Leu Tyr Ala Ile Leu Gly Ser Ser Pro Leu Leu Val Val Gly

180 185 190

Pro Glu Ala Ala Gly Ser Leu Leu Thr Gly Thr Ile Val Lys Thr Ser

195 200 205

Val Lys Gln Gly His Ser Gln Glu Asp Asp Glu Ala Ala Ser Ala Met

210 215 220

Val Val Gly Ile Ala Thr Ala Met Ala Gly Ala Met Ile Leu Val Ala

225 230 235 240

Gly Leu Thr Arg Leu Gly Phe Leu Asp Asn Val Leu Ser Arg Pro Phe

245 250 255

Leu Arg Gly Phe Ile Thr Ala Ile Gly Phe Val Ile Phe Val Asp Gln

260 265 270

Leu Ile Pro Glu Val Gly Leu Ala Asp Leu Ala Lys Glu Ala Gly Val

275 280 285

Ser His Gly Ser Thr Val Gln Lys Leu Val Phe Leu Ala Gly Asn Ile

290 295 300

Lys Ser Cys His Gly Leu Thr Ala Ala Val Ser Phe Gly Ser Phe Ala

305 310 315 320

Ile Ile Met Leu Phe Arg Thr Ile Lys Lys Ala Leu Glu Pro Arg Tyr

325 330 335

Pro Gln Val Val Tyr Phe Pro Asp Arg Ile Leu Val Val Ile Leu Ser

340 345 350

Ala Ile Leu Thr Trp Arg Leu Gly Trp Tyr Glu Gln Gly Leu Glu Val

355 360 365

Leu Gly Ser Val Gln Asn Thr Ala Thr Gly Leu Phe Ala Phe Arg Trp

370 375 380

Pro Phe Gln Ile Lys His Leu Lys His Val Arg Thr Ala Met Ser Thr

385 390 395 400

Ser Phe Ile Ile Ala Ile Leu Gly Phe Phe Glu Ser Ser Val Ala Ala

405 410 415

Lys Gly Leu Gly Glu Arg Arg Asp Gly Val Gln Gly Met Ser Val Ser

420 425 430

Ala Asn Arg Glu Met Val Ala Leu Gly Val Ala Asn Val Val Gly Gly

435 440 445

Cys Phe Met Ala Leu Pro Ala Phe Gly Gly Tyr Gly Arg Ser Lys Val

450 455 460

Asn Ala Ser Thr Gly Ala Arg Ser Pro Met Ser Ser Ile Phe Leu Ser

465 470 475 480

Ile Ile Thr Phe Ile Val Ile Met Val Leu Leu Pro Tyr Leu Tyr Tyr

485 490 495

Leu Pro Lys Ala Val Leu Cys Ser Thr Ile Ser Val Val Ala Tyr Ser

500 505 510

Leu Ile Glu Glu Cys Pro His Asp Val Ala Phe Phe Ile Arg Leu Arg

515 520 525

Gly Trp Thr Glu Leu Ala Leu Met Leu Leu Ile Phe Val Ser Thr Ile

530 535 540

Phe Tyr Ser Leu Glu Leu Gly Ile Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ser Ile

545 550 555 560

Leu Ile Leu Ile Arg His Ser Thr Gln Pro Arg Ile Gln Ile Leu Gly

565 570 575

Lys Ile Ala Gly Thr Pro Asp Gln Tyr Asp Asn Ala Glu Met His Ala

580 585 590

Glu Asn Val Glu Leu Ile Asp Gly Ala Leu Val Val Lys Ile Pro Glu

595 600 605

Pro Leu Thr Phe Ala Asn Thr Gly Asp Leu Lys Asn Arg Leu Arg Arg

610 615 620

Leu Glu Phe Tyr Gly Ser Asn Arg Ala His Pro Ser Leu Pro Arg Leu

625 630 635 640

Arg Pro Pro Glu Ser Asn Lys Asn Val Ile Phe Asp Val His Gly Val

645 650 655

Thr Ser Ile Asp Gly Ser Gly Thr Gln Val Leu Ser Glu Ile Val Asn

660 665 670

Asp Tyr Ile Asn Leu Gly Val Ser Val Tyr Phe Cys Arg Leu Ser Asn

675 680 685

Arg Ser Val Phe Arg Met Phe Glu Arg Ser Gly Ile Val Asp Arg Cys

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Gly Gly Met Ser His Phe Val Thr Gly Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu

705 710 715 720

Ala Glu Ser Glu Gly His Ala Ser Glu Pro

725 730

<210> 5

<211> 465

<212> DNA/RNA

<213> sodA的核苷酸序列(Unknown)

<400> 5

atggtcaagg ctgtcgctgt tatccgtgga gactctaagg tctccggcac tgtcactttc 60

gagcaggcca acgagaacac ccccaccacc atctcctgga acatcactgg ccacgacgcc 120

aacgctgagc gtggcttcca cgtccaccag ttcggtgaca acaccaacgg ctgcacctcc 180

gctggccctc acttcaaccc cttcggcaag acccacggtg ctcccgagga cgacgagcgt 240

cacgtcggtg accttggcaa cttcaagacc gatgccgagg gtaacgccgt tggttccaag 300

caggacaagc tggtgaagct catcggtgct gagagcgtcc tgggccggac cctggtcgtc 360

cacgctggta ctgatgacct tggccgtggt ggcaacgagg agtccaagaa gaccggtaac 420

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<210> 6

<211> 154

<212> PRT

<213> sodA的氨基酸序列(Unknown)

<400> 6

Met Val Lys Ala Val Ala Val Ile Arg Gly Asp Ser Lys Val Ser Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Phe Glu Gln Ala Asn Glu Asn Thr Pro Thr Thr Ile Ser

20 25 30

Trp Asn Ile Thr Gly His Asp Ala Asn Ala Glu Arg Gly Phe His Val

35 40 45

His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His

50 55 60

Phe Asn Pro Phe Gly Lys Thr His Gly Ala Pro Glu Asp Asp Glu Arg

65 70 75 80

His Val Gly Asp Leu Gly Asn Phe Lys Thr Asp Ala Glu Gly Asn Ala

85 90 95

Val Gly Ser Lys Gln Asp Lys Leu Val Lys Leu Ile Gly Ala Glu Ser

100 105 110

Val Leu Gly Arg Thr Leu Val Val His Ala Gly Thr Asp Asp Leu Gly

115 120 125

Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Lys Lys Thr Gly Asn Ala Gly Pro Arg

130 135 140

Pro Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Ala

145 150

<210> 7

<211> 36

<212> DNA/RNA

<213> chrB-F(Unknown)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA/RNA

<213> chrB-R(Unknown)

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<210> 9

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<212> DNA/RNA

<213> sulB-F(Unknown)

<400> 9

acatctaaac aatggaattc acggatccca atccg 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA/RNA

<213> sulB-R(Unknown)

<400> 10

cagtaacgtt aagtggatcc tcaaggttcc gatgc 35

<210> 11

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> sodA-F(Unknown)

<400> 11

tcatccgtca agatggaatt cgtcaaggct gtcgctgtta tc 42

<210> 12

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> sodA-R(Unknown)

<400> 12

tccagatctc tgcagggtac cttaagcagc aatgccaatg acac 44