阅读说明：本技术 一种积累大黄素的基因工程菌株及其构建方法和应用 (A kind of engineering strain accumulating rheum emodin and its construction method and application ) 是由 吕雪峰 黄雪年 齐飞飞 张伟 于 2019-07-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种能够积累大黄素的基因工程菌株,所述基因工程菌株的出发菌株为能够产生大黄素或其下游衍生物的土曲霉,所述基因工程菌株为将土曲霉中的O-甲基转移酶基因(gedA)进行突变而制备得到的基因工程菌株,相对于出发菌株,所述基因工程菌株能够用于积累大黄素。(The invention discloses the engineering strains that one kind can accumulate rheum emodin, the starting strain of the engineering strain is that can generate rheum emodin or the downstream Aspergillus terreus of derivative, the engineering strain is the engineering strain for being mutated the O- methyl transferase gene (gedA) in Aspergillus terreus and being prepared, relative to starting strain, the engineering strain can be used in accumulating rheum emodin.)

一种积累大黄素的基因工程菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种能够积累大黄素的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

大黄是一种重要的中药，在多种中药复方中均有使用，大黄素(CAS:518-82-1)是其主要有效成分。近年来关于大黄素及其衍生物生物活性的研究结果显示其在预防和治疗多种疾病中方面还具有重要潜在医药价值。除此之外，大黄素还是一种天然色素，还可用于保健和日用化工品中，如有人把它用于护发和护肤品中。目前，大黄素主要是从大黄、虎杖等植物中提取，有效成分含量低、副产物多，而且植物种植耗时费力、受环境因素影响较大，使得大黄素的生产成本高、供应量少，从而限制了其下游应用开发。在一些真菌培养物中也发现过大黄素及其衍生物，但是含量很低。进一步的生物化学和分子生物学研究显示这些真菌中确实存在大黄素生物合成途径，但是大黄素只是整个合成途径的一个中间产物，并未大量积累。

从基因组水平而言，很多微生物具有很大的次级代谢产物合成能力，有合成多种次级代谢产物的合成基因或基因簇。但是，天然产物的生物合成机制十分复杂，不仅受多种环境因素的影响，还受内部信号转导、全局调控和特异性转录调控等复杂的调控网络调控。因此，在通常条件下大部分次级代谢产物合成途径都处于非活跃状态，不能合成或只能少量合成相关产物。在土曲霉中，大黄素是地曲霉素生物合成的一个中间体，在正常条件下只有极少量的合成且不能有效积累。本发明通过对真菌进行基因工程改造，使其能够高效积累大黄素，并用于发酵合成大黄素，从而开发一种制备大黄素的新方法。

发明内容

本发明提供了一种能够积累大黄素的基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)。

优选的，所述基因工程菌株的出发菌株为能够产生大黄素或其下游衍生物的土曲霉；在一个实施方式中，大黄素的下游衍生物包括Questin，Ethyl asterrate，Hydroxysulochrin，ω-Hydroxyemodin-5-methylether，Monomethylosoic acid，Sulochrin，Asterric acid中的一种或任意几种。

所述基因工程菌株为通过将土曲霉中的O-甲基转移酶基因(gedA)进行突变所得到的基因工程菌株。

本发明所述的突变包括通过基因缺失、基因***或基因取代导致的基因功能至少部分失活的方式；在优选的实施方式中，所述至少部分失活为基因功能全部失活。

优选的，所述gedA基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。应当理解，本发明所述gedA基因编码的氨基酸序列还包括与目的序列具有高度同源性的序列但不丧失原核苷酸序列或氨基酸序列的活性的序列，优选的，所述高度同源性包括与目的序列的同源性至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、或70％的序列。

本发明通过对出发菌株土曲霉中的gedA基因的突变，使得改造后的土曲霉能够高效的积累大黄素。

需要说明的是，本发明改造的gedA基因的目的是实现大黄素在土曲霉中的积累；所述出发菌株可以为任意的能够产生大黄素的土曲霉，比如，天然的能够产生大黄素的土曲霉，也可以为经过人工改造的能够产生大黄素的土曲霉工程菌株。

本发明中，通过将土曲霉中的转录调控因子ATEG_08453进行过表达实现了土曲霉中大黄素生产通路的激活，在其他的实施方式中，也可以通过其他通路的改造使得土曲霉能够生产大黄素。

本发明中的过表达包括通过引入额外的目的基因的拷贝，增加目的基因在细胞中的拷贝数来提高基因的表达量，或者通过对基因的启动子进行替换以提高目的基因的表达量。

在一个实施方式中，所述过表达包括将土曲霉中的ATEG_08453的启动子替换为强启动子的步骤；优选的，所述强启动子为启动子PgpdAt。

在另一个实施方式中，所述过表达包括在土曲霉中引入额外的ATEG_08453拷贝的步骤。

在一个实施方式中，所述的“引入”包括将目的基因构建到外源表达载体上，将外源表达载体转入到土曲霉中以过表达ATEG_08453；优选的，所述外源表达载体包括pXH2-1，pXH43，pTRII，pGSF957。

在另一个实施方式中，所述的“引入”包括将目的基因***到土曲霉的基因组中；优选的，所述***到土曲霉的基因组中可以采用同源重组双交换的方法；在一个实施方式中，可以采用将目的基因以及同源臂***到载体上，然后将载体转入到土曲霉中，利用同源臂与土曲霉基因组发生同源重组双交换从而将目的基因***到合适的基因组的位置；在其他的实施方式中，还可以采用基因编辑的方式，例如，利用CRISPR/Cas9系统在期望的基因组位点上进行切割，同时将目的基因作为外源供体***到切割位点上。

在优选的实施方式中，将额外的ATEG_08453拷贝***到土曲霉基因组时，所述额外的ATEG_08453拷贝在强启动子的作用下进行表达；优选的，所述强启动子为启动子PgpdAt。

在优选的实施方式中，所述额外的ATEG_08453拷贝***到土曲霉基因组时，***的位置为ku80基因内部的任意位置；在优选的实施方式中，利用所述额外的ATEG_08453拷贝替换ku80基因的CDS区域以实现ATEG_08453在土曲霉基因组上的***。

进一步的，所述出发菌株为ku80基因突变的土曲霉菌株。

本发明所述的突变包括通过基因缺失、基因***或基因取代导致的基因功能至少部分失活的方式；在优选的实施方式中，所述至少部分失活为基因功能全部失活。

进一步的，所述土曲霉包括土曲霉ATCC20542、CICC40205、NIH2624、NRRL1960。

进一步的，所述启动子PgpdAt的序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述ATEG_08453序列包括如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。

应当理解，本发明所述的序列还包括与目的序列具有高度同源性的序列但不丧失原核苷酸序列或氨基酸序列的活性的序列，优选的，所述高度同源性包括与目的序列的同源性至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％的序列。

另一方面，本发明还提供了上述基因工程菌株的构建方法。

进一步的，所述构建方法包括通过常规的方法在出发菌株中进行目的基因突变和/或外源序列的引入的步骤。

一方面，所述构建方法包括利用强启动子替换ATEG_08453原有的启动子的步骤；优选的，所述强启动子为启动子PgpdAt。

另一方面，所述构建方法包括将额外的ATEG_08453基因拷贝引入到土曲霉中的步骤；在一个实施方式中，所述引入包括将ATEG_08453基因构建到表达载体上，然后将表达载体转入到土曲霉的步骤；在其他的实施方式中，所述引入包括将额外的ATEG_08453基因拷贝***到土曲霉基因组中的步骤。优选的，所述额外的ATEG_08453基因拷贝在强启动子的作用下进行表达；所述强启动子优选为启动子PgpdAt，PcitA，PgpdA，PtrpC，Pgpk，Pmpgd。

上述启动子均是本领域已知的启动子，如期刊文献Huang X et al.Cloning,characterization and application of a native glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase promoter for Aspergillus terreus.J Ind Microbiol Biotechnol2014,41:585–592.公开了PgpdAt。期刊文献Huang X et al.Direct production ofitaconic acid from liquefied corn starch by genetically engineeredAspergillus terreus.Microbial Cell Factories 2014,13:108，以及期刊文献Dave Ket al.Utility of Aspergillus niger citrate synthase promoter or heterologousexpression.J Biotechnol 2011,155:173–177公开了PcitA。文献Kim JG et al.Genetictransformation of Monascus purpureus DSM1379.Biotechnol Lett,2003,25:1509–1514公开了Pmgpd和Ptrp(即PtrpC)。文献Punt PJ,et al.Functional elements in thepromoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encodingglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.Gene,1990,93:101–109公开了PgpdA。文献Nara,F.et al.Cloning and sequencing of the 3-phosphoglycerate kinase(PGK)genefrom Penicillium citrinum and its application to heterologous geneexpression.Curr Genet,1993,23(2):132-140公开了Ppgk。

进一步的，所述构建方法还包括对土曲霉中的O-甲基转移酶基因(gedA)进行突变的步骤。

另一方面，本发明还提供了上述产大黄素的基因工程菌株在生产大黄素中的应用。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1.ATEG_08452的BLAST分析结果(A)及其与真菌次级代谢转录激活因子mdpA的序列比对结果(B)。

图2.质粒pXH2-1(A)和pXH-106(B)图谱

图3.转录调控因子过表达工程菌株构建示意图，其中，A：构建策略示意图；TFs是指拟过表达的转录调控基因，即ATEG_08438、ATEG_08442、

ATEG_08452、ATEG_08453，ATCC20542-_OETFs为分别过表达这些转录调控因子的工程菌株；B：用引物Uku80-F/Dku80-R引物对进行基因组PCR验证结果，M为DNA marker，泳道1为出发菌株ATCC20542-ΔpyrG，

泳道2为过表达ATEG_08438的工程菌株ATCC20542-_OE08438，

泳道3为过表达ATEG_08442的工程菌株ATCC20542-_OE08442，

泳道4为过表达ATEG_08452的工程菌株ATCC20542-_OE08452，

泳道5为过表达ATEG_08453的工程菌株ATCC20542-_OE08453。

图4.过表达调控因子工程菌株与野生型菌株次级代谢产物HPLC分析

图5.工程菌株发酵产大黄素及大黄素衍生物的结构

图6.转录调控因子ATEG_08453启动子替换激活策略图，其中：A：转录调控因子ATEG_08453启动子替换实验策略示意图，ATCC20542-_PR08453为启动子替换后的工程菌株；B：用引物U-08453-F/D-08453-R引物对进行基因组PCR验证结果，M为DNA marker，泳道1为出发菌株ATCC20542-ΔpyrG，b为野生型条带，泳道2、3为启动子替换后的工程菌株ATCC20542-_PR08453，a即其阳性PCR条带。

图7.调控因子ATEG_08453启动子替换工程菌株与野生型菌株次级代谢产物HPLC分析

图8.pDONR-ptrA质粒图谱

图9.pDONR-ptrA-gedA质粒图谱

图10.pDONR-ptrA-gedF质粒图谱

图11.敲除gedA工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedA的PCR验证

图12.敲除gedF工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedF的PCR验证

图13.工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedA发酵合成大黄素的HPLC分析图

图14.工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedA合成大黄素的紫外吸收分析比对结果

图15.工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedA合成的大黄素的质谱图分析结果

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。

IPM液体培养基：60g/L葡萄糖，2g/L NH₄NO₃，20mg/L(NH₄)₂HPO₄，20mg/L FeSO₄，0.4g/L MgSO₄，4.4mg/L ZnSO₄，0.5g/L玉米浆，余量为去离子水，pH 3.5，121℃高压灭菌20分钟。

酶解液：称取0.4g纤维素酶(Sigma产品，产品目录号：C1184)、0.4g裂解酶(Sigma产品，产品目录号：L1412)、0.2g蜗牛酶(生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号：SB0870)溶解于50mL的0.6M MgSO₄水溶液中，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01)，凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。

PDB顶层琼脂：24g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉(BD公司产品，产品目录号：7114771)，1.2M山梨醇，4g/L琼脂糖，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟后48℃保温。

PDA平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟，待冷却至约60℃制备平板。

PDAS平板：39g/L马铃薯土豆培养基PDA干粉(BD公司产品，产品目录号：633840)，1.2M山梨醇，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟，待冷却至约60℃制备平板。

SMP种子培养基：9g/L葡萄糖，10g/L蔗糖，1g/L酵母抽提物，1g/L蛋白胨，1g/L乙酸钠，0.04g/L KH₂PO₄，0.1g/L MgSO₄，5g/L豆粕，1.5g/L碳酸钙，pH6.8，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟。

SMP发酵培养基：70g/L葡萄糖，20g/L蔗糖，1.5g/L酵母抽提物(安琪酵母股份有限公司产品，产品目录号：FM888)，20g/L蛋白胨，7g/L乙酸钠，0.5g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄，5g/L豆粕，5g/L碳酸钙，0.1mL/L泡敌，pH6.2，余量为去离子水，121℃高压灭菌20分钟。

实施例1、土曲霉高效基因打靶平台的构建

土曲霉ATCC20542是一株研究次级代谢产物的菌株，本实施例参照发明专利“一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用，ZL201510275491.5”)的实施例2敲除土曲霉ATCC20542的ku80，构建了基因打靶高效的曲霉菌ATCC20542-Δku80(ATCC20542,Δku80::ptrA)，进一步参照该专利申请的实施例5敲除pyrG基因构建了可基于尿嘧啶营养缺陷型进行遗传转化筛选的底盘细胞菌株曲霉菌ATCC20542-ΔpyrG(ATCC20542,Δku80::ptrA,ΔpyrG)，除了将宿主菌替换为土曲霉ATCC20542，上述操作与专利ZL201510275491.5的实施例中的步骤完全一致。

实施例2、在土曲霉ATCC20542中通过调控因子过表达方式激活大黄素生物合成途径

1)构建转录调控因子激活DNA元件

设计并合成如下引物：

Uku80-F：5’-agcacaaacatattgatcagc-3’；

pyrGAn-R:5’-ggatcctcccagagtgtaagcatcaaatcgtcgtaccgca-3’；

trpC-F3:5’-aagcttgagatccacttaacgttactgaaatcatc-3’；

Dku80-R:5’-gaaggcgaaaagtagtctcgtg-3’；

PgpdAt-F743:5’-ttacactctgggaggatccaggtac-3’；

PgpdAt-R1:5’-tgtgatgattgatgagttgttg-3’。

为了扩增转录调控因子ATEG_08438、ATEG_08442、ATEG_08452和ATEG_08453的DNA序列，设计引物如下：

08438-F：ACAACTCATCAATCATCACATGTCTGTCCAGAAACGCGCAC,

08438-R：GTTAAGTGGATCTCAAGCTTCACAGACTGGCTGGTCTTGGG；

08442-F：ACAACTCATCAATCATCACATGTTCATCACACTGAAATGTC，

08442-R：GTTAAGTGGATCTCAAGCTTCTACGGATGGCTCACGGCAAA；

08452-F：ACAACTCATCAATCATCACATGCTGCTGTGTGATTCCCTTAG,

08452-R：GTTAAGTGGATCTCAAGCTTTTAGAACGAAGATGGCAACGCG；

08453-F：ACAACTCATCAATCATCACATGTCTGCAGAAGGACACAAGC，

08453-R：GTTAAGTGGATCTCAAGCTT TATTCTGCTAATTGCAACATC。

以土曲霉ATCC20542的基因组DNA为模板，分别用引物对08438-F/08438-R、08442-F/08442-R、08452-F/08452-R、08453-F/08453-R进行PCR扩增，获得基因ATEG_08438、ATEG_08442、ATEG_08452和ATEG_08453的DNA片段。所述基因ATEG_08438、ATEG_08442、ATEG_08452和ATEG_08453的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5所示。

其中，ATEG_08453、ATEG_08442和ATEG_08438是Zn(II)2Cys6 transcriptionfactor类调控因子，ATEG_08452经BLAST分析显示其与两个真菌次级代谢产物调控因子具有很高的相似性(图1)。

以质粒pXH-106(图谱如图2所示)为模板，分别用引物对Uku80-F/pyrGAn-R和TtrpC-F3/Dku80-R进行PCR扩增得到上游同源臂Uku80-pyrGAn和下游同源臂TtrpC-Dku80。以质粒pXH2-1(图谱如图2所示)为模板，用引物对PgpdAt-F743/PgpdAt-R1进行PCR扩增，得到启动子PgpdAt，其序列如SEQ ID No.1所示。

用融合PCR的方法将Uku80-pyrGAn、启动子PgpdAt、调控因子基因(ATEG_08438或ATEG_08442或ATEG_08452或ATEG_08453)和TtrpC-Dku80进行融合，以融合产物为模板，用引物对C-ku80-F3(5’-ttccagagacgaatgactaacaag-3’)和C-ku80-R3(5’-gcgaaaggatcttgtgatcaatgc-3’)进行PCR扩增，分别获得过表达调控因子ATEG_08438、ATEG_08442、ATEG_08452、ATEG_08453的打靶元件Uku80-pyrGAn-PgpdAt-08438-TtrpC-Dku80、Uku80-pyrGAn-PgpdAt-08442-TtrpC-Dku80、Uku80-pyrGAn-PgpdAt-08452-TtrpC-Dku80、Uku80-pyrGAn-PgpdAt-08453-TtrpC-Dku80。

如图3A所示，该片段可利用上下游同源臂Uku80和Dku80于ku80基因位点上发生同源重组，分别引入四个调控因子的表达元件，实现用强启动子PgpdAt分别过表达调控因子(ATEG_08438、ATEG_08442、ATEG_08452和ATEG_08453)。

2)过表达调控因子土曲霉工程菌株的构建

参照专利ZL201510275491.5的实施例中方法制备工程菌株ATCC20542-ΔpyrG的原生质体悬液，向150μl该原生质体悬液中加入10μl的DNA片段Uku80-pyrGAn-PgpdAt-08453-TtrpC-Dku80(约2μg)。再加入50μl冰浴的PSTC，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min。然后与30mL的PDB顶层琼脂混合后倾注于10块PDAS上，在30℃静置培养5-7天。

选取转化子转接于PDA平板上传代纯化两次，选取稳定传代的4个转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于5mL IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA。用引物Uku80-F/Dku80-R进行PCR验证，同时用ATCC20542-ΔpyrG菌株的基因组作为对照。理论上，以ATCC20542-ΔpyrG的基因组DNA为模板，应该能扩增出一条约4.1kb条带，候选转化子的基因组DNA(整合有调控因子表达元件)为模板，应该能扩增出大小约为7.0kb-kb的条带(Uku80-pyrGAn-PgpdAt-调控因子-TtrpC-Dku80)。结果如图3B所示，2、3、4、5泳道是分别整合了调控因子ATEG_08438、ATEG_08442、ATEG_08452、ATEG_08453表达元件的工程菌株，分别将其记为ATCC20542-_OE08438、ATCC20542-_OE08442ATCC20542-_OE08452、ATCC20542-_OE08453。

实施例3、工程菌株发酵产大黄素及大黄素衍生物的分析

将构建的工程菌株ATCC20542-_OE08438、ATCC20542-_OE08442 ATCC20542-_OE08452、ATCC20542-_OE08453和对照菌株ATCC20542-Δku80分别接种于PDA固体平板，30℃培养7天获得孢子。将孢子分别接种于35ml的SMP种子培养基(250mL三角瓶)，28℃、220rpm震荡培养48小时。将3.5mL种子液分别接种于50mL SMP发酵培养基(250mL三角瓶)，28℃，220rpm震荡培养8天，得到各菌株的发酵液。

发酵粗提物的分析比较，发酵结束后，采用200目的尼龙布将菌体和菌液分开，菌体采用二氯甲烷和甲醇(V/V＝1:1)浸泡超声萃取三遍，菌液采用等体积的乙酸乙酯浸泡搅拌萃取三遍，合并有机相减压浓缩获得粗提物，用甲醇溶解配制100mg/ml的溶液，0.22μm滤膜过滤，采用HPLC分析方法进行分析，[分析方法：流动相A(100％H₂O+0.05％FA)流动相B(100％ACN+0.05％FA),梯度洗脱，0-5min 95％-76％A，5-35min 76％-38％A，35-50min38％A,50-55min 38％-0％A,55-60min 0-95％A,60-65min 95％A。分析用色谱柱(AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18 4.6mm×150mm 5μm)，流速1ml/min，检测波长250nm]。HPLC分析结果显示过表达调控因子ATEG_08438、ATEG_08442、ATEG_08452的工程菌株的发酵产物和对照菌株相比较无明显变化，而过表达ATEG_08453则明显多出了一系列新的化合物吸收峰(图4)。对工程菌株ATCC20542-_OE08453发酵液中这些新增化合物结构进行解析，发现化合物8是大黄素，其他化合物为化合物8的衍生物(图5)。这说明过表达ATEG_08453成功激活了大黄素合成途径，而过表达其他几个调控因子无此效果。

工程菌株ATCC20542-_OE08453代谢产物的分离与纯化，菌株发酵结束后有机相萃取浓缩获得粗提物，粗提物与硅胶按质量比1:5-10拌样，然后与正相硅胶(200-300目)按高度比1:3-5装柱，进行减压硅胶柱层析，采用10％乙酸乙酯-石油醚，50％乙酸乙酯-石油醚，60％乙酸乙酯-石油醚，100％乙酸乙酯-石油醚(上述各百分数表示如：10％乙酸乙酯-石油醚，是指乙酸乙酯在其石油醚溶液中的体积分数)的梯度洗脱方式，获得四个组份(Fr.1-Fr.2)；其中Fr.1组份进行反相减压硅胶柱层析，采用30％乙腈-水、40％乙腈-水、70％乙腈-水和100％乙腈(上述各百分数表示如：30％乙腈-水，是指乙腈在其水中的体积分数)的梯度洗脱方式，获得四个组份(Fr.1.1-Fr.1.4)，其中Fr.1.2组份通过半制备液相分离(洗脱方法45％乙腈(0.05％甲酸)-55％水(0.05％甲酸))分别在保留时间4.9min和5.8min获得化合物6和7，Fr.1.3组份采用20％乙酸乙酯-石油醚硅胶柱层析获得化合物8。Fr.2组分采用30％乙腈-水减压反相硅胶柱洗脱后再采用梯度(20％乙酸乙酯-石油醚，40％乙酸乙酯-石油醚和100％乙酸乙酯-石油醚)的正相硅胶柱层析获得三个组分(Fr.2.1-Fr.2.3)，其中Fr.2.2组分通过半制备液相分离(洗脱方法33％乙腈(0.05％甲酸)-67％水(0.05％甲酸))分别在保留时间7.5min和12.4min获得化合物4和5，Fr.2.3组分通过梯度半制备液相分离(梯度方法：0-10min 70％-55％A，10-10.1min 55％-70％A，10.1-12min 70％A。其中A:水(0.05％甲酸)，B:乙腈(0.05％甲酸))在保留时间7.0min获得化合物3。Fr.3组分采用反相减压硅胶柱层析梯度洗脱(40％甲醇-水、60％甲醇-水和100％甲醇)获得三个组分(Fr.3.1-Fr.3.3)，其中Fr.3.1组分进一步采用20％乙腈-水进行反相硅胶柱层析，然后采用半制备液相(25％乙腈(0.05％甲酸)-75％水(0.05％甲酸))分离，在保留时间4.6min获得化合物1，其中Fr.3.2组分进一步采用20％乙腈-水进行反相硅胶柱层析获得化合2。

如图5所示，化合物波谱数据如下：

Hydroxysulochrin(1),HREISMS m/z calculated for C₁₇H₁₅O₈ 347.0772,experimental 347.0775[M-H]^{- 1}H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ3.66(3H,s),3.69(3H,s),4.51(2H,s),6.37(2H,s),6.74(1H,s),7.02(1H,s)；¹³C NMR(acetone-d₆,150MHz)δ51.3,55.6,63.1,100.0,103.2,104.5,107.6,110.4,127.2,128.7,151.8,157.4,158.2,165.8,200.0。

ω-Hydroxyemodin-5-methylether(2),HREISMS m/z calculated forC₁₆H₁₁O₆299.6561,experimental 299.0562[M-H]^-.¹H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ3.99(3H,s),4.78(2H,s),6.95(1H,d,J＝2.4Hz),7.28(1H,d,J＝1.2Hz),7.35(1H,d,J＝2.4Hz),7.69(1H,d,J＝1.2Hz),13.38(1H,s).¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ56.7,62.4,105.4,107.5,112.9,115.5,116.3,121.4,132.5,137.2,151.6,162.1,163.9,165.1,182.8,186.8。

Monomethylosoic acid(3),HREISMS m/z calculated for C₁₆H₁₃O₈ 333.0616,experimental 333.0619[M-H]^{- 1}H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ2.16(3H,s),3.81(3H,s),5.92(1H,s),6.47(1H,s),6.94(1H,s),7.12(1H,s)；¹³C NMR(acetone-d₆,150MHz)δ22.0,56.7,100.8,105.6,106.0,109.6,112.4,125.8,134.9,147.8,154.8,156.9,159.3,163.9,166.4,171.5。

Sulochrin(4),HREISMS m/z calculated for C₁₇H₁₅O₇ 331.0823,experimental331.0829[M-H]^{- 1}H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ2.18(3H,s),3.65(3H,s),3.69(3H,s),6.18(2H,s),6.72(1H,d,J＝1.8Hz),7.01(1H,d,J＝1.8Hz)；¹³C NMR(acetone-d₆,150MHz)δ21.9,52.2,56.4,104.0,108.5,108.7,110.5,128.0,129.6,148.2,158.3,159.0,162.9,166.7,200.7。

Asterric acid(5),HREISMS m/z calculated for C₁₇H₁₅O₈ 347.0772,experimental 347.0771[M-H]^{- 1}H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ2.16(3H,s),3.73(3H,s),3.81(3H,s),5.90(1H,s),6.47(1H,s),6.94(1H,s),7.04(1H,s)；¹³C NMR(acetone-d₆,150MHz)δ22.0,152.7,56.7,100.8,105.6,106.1,109.3,112.5,125.7,134.7,147.6,154.8,156.9,159.5 164.2,165.7,171.7。

Questin(6),HREISMS m/z calculated for C₁₆H₁₁O₅ 283.0612,experimental283.0613[M-H]^{- 1}H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ2.44(3H,s),3.98(3H,s),6.93(1H,d,J＝2.4Hz),7.10(1H,d,J＝1.2Hz),7.35(1H,d,J＝2.4Hz),7.49(1H,d,J＝1.2Hz),13.33(1H,s)；¹³C NMR,(CD₃OD,150MHz)δ21.9,26.9,105.7,108.4,114.6,116.0,120.6,125.4,134.0,138.9,148.3,163.7,165.2,166.3,184.1,188.7。

Ethyl asterrate(7),HREISMS m/z calculated for C₁₉H₁₉O₈ 375.1085,experimental 375.1082[M-H]^{- 1}H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ1.32(3H,t,J＝6.6Hz),2.12(3H,s),3.65(3H,s),3.76(3H,s),4.40(2H,q,J＝6.6Hz),5.86(1H,s),6.37(1H,s),6.83(1H,s),6.90(1H,s)；¹³C NMR,(acetone-d₆,150MHz)δ14.5,21.9,52.3,56.6,61.9,102.3,105.6,106.7,108.7,111.1,127.1,136.0,146.4,154.7,156.0,161.0,163.5,166.2,171.7。

Emodin(8),HREISMS m/z calculated for C₁₅H₉O₅ 269.0455,experimental269.0460[M-H]^{- 1}H NMR(acetone-d₆,600MHz)δ2.45(3H,s),6.66(1H,s),7.11(1H,s),7.24(1H,s),7.53(1H,s),12.06(1H,s),12.16(1H,s)；¹³C NMR,(acetone-d₆,150MHz)δ22.0,108.9,109.9,110.3,114.5,121.5,124.9,134.3,136.6,149.5,163.3,166.3,166.8,182.2,191.7。

实施例4、在土曲霉中通过替换ATEG_08453的启动子激活大黄素生物合成途径

1)构建ATEG_08453的启动子替换DNA元件

设计引物如下：

U08453-F：AGATGCCCGAGCGGGCATTGC

U08453R：GGATCCTCCCAGAGTGGTAAGCCGATTTCCACCATACGTAGAC

D08453-F：ACAACTCATCAATCATCACATGTCTGCAGAAGGACACAAGC

D08453-R：CTATTCTGCTAATTGCAACATC

C08453-F：CTGCGCTACGTTTCGTTGTACAG

C08453-R：GATGGTCCATCACGATCGTTGAG

pyrGAn-F：TAAGGGAGATGGTGATTGAACTAG

PgpdAt-R1：TGTGATGATTGATGAGTTGTTG

以土曲霉菌ATCC20542的基因组DNA为模板，分别用引物对U08453-F/U08453-R、D08453-F/D08453-R进行PCR扩增，获得启动子替换时所需要的上下游同源臂片段U08453和D08453。以上述构建的DNA片段Uku80-pyrGAn-PgpdAt-08453-TtrpC-Dku80作为模板，用引物pyrGAn-F/PgpdAt-R1进行PCR扩增，得到携带有pyrGAn筛选标记和PgpdAt启动子的DNA片段pyrGAn-PgpdAt。用融合PCR方法将U08453、pyrGAn-PgpdAt和D08453进行融合，以融合产物为模板，用引物对C08453-F/C08453-R进行PCR扩增，获得用强启动子PgpdAt替换ATEG_08453原始启动子所需要的基因打靶元件U08453-pyrGAn-PgpdAt-D08453。

参照实施例2描述的方法制备工程菌株ATCC20542-ΔpyrG的原生质体，并加入基因打靶元件U08453-pyrGAn-PgpdAt-D08453完成原生质体转化。选取转化子转接于PDA平板上传代纯化两次，选取稳定传代的4个转化子进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于5mL IPM液体培养基中，30℃、200rpm培养48小时，收集菌丝提取基因组DNA。用引物U08453-F/Dku80-R进行PCR验证，同时用ATCC20542-ΔpyrG菌株的基因组作为对照。理论上，以ATCC20542-ΔpyrG的基因组DNA为模板，应该能扩增出一条约2.5kb条带，启动子替换转化子基因组DNA为模板应该能扩增出大小约为4.4kb的条带。结果如图6B所示，2-3泳道的候选转化子均是用PgpdAt启动子替换了ATEG_08453原始启动子的阳性转化子，将其记为ATCC20542-_PR08453。

参照实施例3对工程菌株ATCC20542-_PR08453进行了发酵分析，发酵产物的HPLC分析结果显示ATCC20542-_PR08453与ATCC20542-_OE08453结果一致，与对照菌株ATCC20542-Δku80相比均出现了大黄素及其衍生物的吸收峰(图7)。这说明通过替换调控因子ATEG_08453启动子驱动其转录表达，也能激活大黄素生物合成途径，使之合成大黄素或其衍生物。

实施例5、积累大黄素工程菌株的构建及发酵分析

在土曲霉的地曲霉素生物合成基因簇中有13个基因，经过生物信息学预测，其中的O-甲基转移酶GedA和GedF可能与大黄素的代谢相关；发明人通过对于上述两个基因的遗传操作或许可以构建能够积累大黄素的土曲霉菌株。

1)土曲霉中的O-甲基转移酶gedA基因和氧化还原酶gedF基因的敲除

1.1)以土曲霉ATCC20542的基因组为模板，以特异引物gedA up F和gedA up R进行PCR扩增获得gedA(ATEG_08449)上游同源臂，以特异引物gedA down F和gedA down R进行PCR扩增获得gedA(ATEG_08449)下游同源臂；以特异引物gedF up F和gedF up R进行PCR扩增获得gedF(ATEG_08455)上游同源臂，以特异引物gedF down F和gedF down R进行PCR扩增获得gedF(ATEG_08455)下游同源臂，利用OMEGA的Cycle Pure Kit试剂盒纯化所有片段(方法参照试剂盒说明书)。所述基因ATEG_08449、ATEG_08455编码的氨基酸序列分别如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示。特异引物核苷酸序列如下：

gedA up F：

TAGGGATAACAGGGTAATTTCCAGTAACGGTCAGCAGCCTAT；

gedA up R：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAACTCTGATCTGTCTGGAGCCTGTTT；

gedA down F：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTCTCCAAATGCGTTGTTGTCCAG；

gedA down R：

ATTACCCTGTTATCCCTAAACTTTGTCATCACCGAGCCTACA；

gedF up F：

TAGGGATAACAGGGTAATCGCTGCGGATCTACTTGAACCAG；

gedF up R：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAAGCCAGGGATATTATCATTGGTCGA；

gedF down F：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATGGTTCCGTTCCAAGTTGTGATTC；

gedF down R：

ATTACCCTGTTATCCCTATGTAGACTGACCACCTCCACTCCC；

PCR反应条件如下：

95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1～2min，反应30个循环；72℃终延伸10min；

PCR反应体系如下：

PCR扩增获得的gedA上游同源臂为基因ORF上游的1.15kb片段，浓度为212ng/μl；gedA下游同源臂为基因ORF下游的1.39kb片段，浓度为202ng/μl。

PCR扩增获得的gedF上游同源臂为基因ORF上游的1.06kb片段，浓度为182ng/μl；gedF下游同源臂为基因ORF下游的1.23kb片段，浓度为168ng/μl。

1.2)参照Invitrogen使用说明书，利用BP colne反应试剂盒(Technology with Clonase^TMII)将步骤1.1制得的上下游同源臂连接到具有ptrA筛选标记的pDONR^TM221载体(Invitrogen)上(图8)，在Km抗性平板上挑取可生长的转化子至液体培养基中培养18h，利用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒(方法参照试剂盒说明书)，经1％琼脂糖凝胶电泳检测质粒滞后情况，挑选滞后的质粒进行PCR验证，可同时扩增出上下游同源臂的质粒即为构建成功的具备ΔgedA∷ptrA(如图9所示)或ΔgedF∷ptrA(如图10所示)敲除盒的质粒；

1.3)以步骤1.2获得的含有ΔgedA∷ptrA敲除盒的质粒为模板，以特异引物A upF和A down R进行PCR扩增，获得gedA敲除片段；以步骤1.2获得的含有ΔgedF∷ptrA敲除盒的质粒为模板，以特异引物F up F和F down R进行PCR扩增，获得gedF敲除片段。利用OMEGA的Cycle Pure Kit对所有PCR扩增获得的敲除片段进行纯化(方法参照试剂盒说明书)。特异性引物核苷酸序列如下：

A up F：TTCCAGTAACGGTCAGCAGCCTAT；

Adown R：AACTTTGTCATCACCGAGCCTACA；

F up F：CGCTGCGGATCTACTTGAACCAG

F down R：TGTAGACTGACCACCTCCACTCCC

PCR反应条件如下：

95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸7～8min，反应30个循环；72℃终延伸10min；

PCR反应体系如下：

PCR扩增获得的ΔgedA∷ptrA敲除盒长度为6.7kb，浓度为150ng/μl；ΔgedF∷ptrA敲除盒长度为6.6kb片段，浓度为120ng/μl。

1.4)以实施例2构建的土曲霉ATCC20542-_OE08453为出发菌株，利用步骤1.3PCR扩增获得ΔgedA∷ptrA敲除盒和ΔgedF∷ptrA敲除盒片段，参照实施例2中所述原生质体转化的方法，分别对gedA和gedF基因进行敲除。挑取在含有0.1mg/ml吡啶硫胺素的PDA再生培养基平板上萌发的菌落利用Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit试剂盒(方法参照试剂盒说明书)进行菌落PCR验证。分别以gedA an upF/pDONR-ptrA F和gedA andownR/pDONR-Km R为引物对gedA敲除转化子进行上下游锚定验证，以gedF an upF/pDONR-ptrA F和gedF an downR/pDONR-Km R为引物对gedF敲除转化子进行上下游锚定验证。特异性引物核苷酸序列如下：

gedA an upF：GTATTCCTGAATGGACGGATCTCA

gedA an downR：TCCGTACTCTTAGCACGTATGTCG

pDONR-ptrA F：AGTAAATGACTCACTACCCGAATG

pDONR-Km R：CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC

gedF an upF：CATCCGTGGACATGGTCTTTGTGA

gedF an downR：CCATCCTCCGTCTGAATGATCTTCT

理论上，以ATCC20542-_OE08453的基因组DNA为模板，应该不能扩增出任何条带，而gedA敲除成功后，上下游锚定应分别可以扩增出大小约为1.5kb和1.4kb的条带。结果如图11所示，挑取的11个转化子中，有10个获得预期锚定条带，这说明gedA基因已被成功敲除，将该工程菌株记为ATCC20542-_OE08453-ΔgedA；若gedF敲除成功，上下游锚定应分别可以扩增出大小约为1.8kb和1.6kb的条带。结果如图12所示，挑取的11个转化子中，有8个获得预期锚定条带，这说明gedF基因已被成功敲除，将该工程菌株记为ATCC20542-_OE08453-ΔgedF。

2)发酵分析工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedA和ATCC20542-_OE08453-ΔgedF合成大黄素的能力

2.1)在土曲霉SMP培养基中分别接种构建的工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedA、ATCC20542-_OE08453-ΔgedF和对照菌株ATCC20542-_OE08453的孢子各10⁷个，30℃，220rpm/min震荡培养8天，得到各菌株的发酵液。取1ml发酵液后利用乙酸乙酯抽提三遍，后用氮气将抽提液吹干，并利用甲醇复溶后，等待进一步分析。

2.2)使用Agilent 1260 HPLC在Agilent Eclipse Plus C18柱(5μm,4.6mm×250mm)上对步骤2.1抽提的化合物进行分析。分析方法如下：流动相A(100％H₂O+0.05％FA)，流动相B(100％ACN+0.05％FA),梯度洗脱(0-5min 95％-76％A，5-35min 76％-38％A，35-50min 38％A,50-55min 38％-0％A,55-60min 0-95％A,60-65min 95％A。)，流速1ml/min，检测波长250nm。结果如图13所示，工程菌株ATCC20542-_OE08453-ΔgedA发酵产物中明显出现了与大黄素标准品保留时间一致的峰。进一步研究发现，如图14所示，该化合物紫外吸收峰与大黄素标准品完全一致。而在ATCC20542-_OE08453-ΔgedF发酵产物中则并未出现该化合物。

2.3)利用阴离子高分辨质谱对ATCC20542-_OE08453-ΔgedA发酵产物中疑似大黄素的化合物进行分析，如图15所示，其m/z为269.0454(([M-H]^-,分子式为[C15H9O5]^-))，与大黄素阴离子质谱一致(269.0449)。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种积累大黄素的基因工程菌株及其构建方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 743

<212> DNA

<213> Aspergillus terreus

<400> 1

ttacactctg ggaggatcca ggtacttcca ttcttactag gaagtatttc ggcctagact 60

aatacaacga aagaaactgt tcgattctac gggaaaagta ctccaattcc attacatcat 120

cgcattctcc ctctcgtaag gtacctacca caaaccccca ctatcgttca tccgtccccg 180

gttacaacgg gaagaaaaag cccggggaga gggggaagaa gaaaatccca agggacggga 240

atagccgtgc ggaagagaag acgattagcc taggtagaag cctcatggcc gaccatttga 300

ttccgaaaag ctggcaaaac attcacgaga tagacacagt gaggacccgg acgatgccct 360

atgcggcgcg ctgattggcc aggccgggca gtgccgaagc agcaaatatc gtgagtctcc 420

tgctttgccc ggtgtatgaa accggaaagg gttgctgggg agctggtcag cggcgcaagc 480

cgggagggcg actgagctct gtagcttttg ccccgtctgt ccgtccggtg tagagtggca 540

gaccaccgcc tgctgcgcct cccattgggt cttccccaac gtgactgggt cgttgcgtca 600

gtccatgtcg ctgccttttt cttcctcccc ctcccccgct gtccttcttc ttcttcttct 660

tctctctttc tcccatcatc ctctcatcct ctgcctttcc catcgaactc acttcttcta 720

ccaacaactc atcaatcatc aca 743

<210> 2

<211> 841

<212> PRT

<213> Aspergillus terreus

<400> 2

Met Ser Val Gln Lys Arg Ala Pro Ala Arg Thr Gln Gly Ser Arg Ile

1 5 10 15

Arg Arg Gln Asn His Ser Cys Asp Gln Cys Arg Arg Ser Lys Arg Ala

20 25 30

Cys Asp Ala Gln Trp Pro Ser Gln Thr Arg Arg Ala Ser Phe Asp Asn

35 40 45

Val Asp Ser Arg Arg Ser Pro Cys Ser Tyr Cys Ala Lys Thr Asn Lys

50 55 60

Arg Cys Thr Met Glu Trp Ala Gln Ser Lys Val Gln Ser Val Leu Asn

65 70 75 80

Ser Leu Ser Gln Gln Pro Asn Ser Glu Cys Leu Ser Gly Glu Pro Leu

85 90 95

Val Pro Pro Phe Glu Ala Asp Glu Ser Tyr Leu Glu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Thr Trp Asp Asp Leu Leu Arg Ser Asn Pro Ala His Glu Met Met Ala

115 120 125

Trp Glu Pro Ala Arg Leu Asp Leu Pro Gly Ser Leu Thr Thr Cys Asp

130 135 140

Arg Val Leu His Asn Pro Met Leu Ser Asp Ser Glu Ala Ala Gln Glu

145 150 155 160

Ala Gln Thr Glu Val Pro Ala Thr Phe Thr Ser Ala His Ser Leu Ser

165 170 175

Asp Phe Leu Pro Ser Glu Leu Ser Asp Ala Ser Asp Ile Ser Thr Gln

180 185 190

Gln Leu Ser Asp Leu Glu Phe Asp Pro Met Cys His Gln Ile Trp Pro

195 200 205

Ala Ser Arg Ala Ser Gln Thr Ser Gln Ala Tyr Ser Asn Leu Gln Ser

210 215 220

Thr Ser Ser Lys Ser Pro Trp Gln Leu Glu Glu Ser Ala Gln Leu Phe

225 230 235 240

Ser Asn Lys Gln Cys Ser Arg Trp Ser Val Thr Gln Tyr Ser Leu Ser

245 250 255

Pro Phe Ser Ile Asp Gln Gln Leu Ile Ser Thr Thr Asn His Gln Leu

260 265 270

Thr Ser Ala Asn Leu Leu Gln Ile Tyr His Asp Val Leu Glu His Asn

275 280 285

Leu Ser Cys Trp Leu Thr Glu Met Thr Cys Pro Tyr Leu Pro Arg Ser

290 295 300

Arg Ser Pro Ala Lys Val Val Pro Glu Trp Gly Ser Ser Trp Ser Asn

305 310 315 320

Arg Ile Tyr Gln Arg Thr Ile Lys Leu Asp Arg Val Ala Gln Ser Cys

325 330 335

Gln Leu Leu Arg Leu Thr Arg Ser Glu Asp Arg Ala Ala Ser Lys Ala

340 345 350

Leu His Leu Ala Ile Met Ala Phe Ala Thr Gln Trp Ala Gln Gly Ser

355 360 365

His Arg Gln Arg Glu Lys Tyr Ser His Arg Ser Leu Asn His Ala Gly

370 375 380

Asp Glu Ile Ala Asp Gly Ile Thr Gly Glu Phe Asp Gln Ile Leu Arg

385 390 395 400

Asn Tyr Phe Trp Asp Gln Ala His His Ala Leu Glu Gln Val Ser Glu

405 410 415

Val Glu Ser Tyr Arg Val Ala Cys Ala Glu Leu Ile Phe Gly Leu Thr

420 425 430

Gln Arg Pro Cys Asn Ala Asp Asn Gln Ser Leu Glu Pro Gln Ile Glu

435 440 445

Ala Arg Tyr Arg Lys Phe Ala Ile Asp Ser Val Met Ser Gln Val Arg

450 455 460

Asp Ile Ile Arg Arg Glu Gly Pro Pro Arg Tyr Met Glu Ser Ala Ala

465 470 475 480

Arg Lys Met His Ala Leu Lys Tyr Arg Cys Asp Ala Tyr Glu Lys Gly

485 490 495

Leu Gly Lys Gln Arg Gly Ser Arg Glu Lys Asp Ala His Gly Ile Ala

500 505 510

Ala Met Ser Ser Glu Asp Arg Ala Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Trp Leu

515 520 525

Ala Ile Met Phe Asp Thr Ile Ser Ser Ser Met Asn Glu Arg Pro Val

530 535 540

Val Val Val Asp Glu Glu Cys Glu His Glu Ala Gln Lys Glu Lys Gln

545 550 555 560

Lys Ile Ala Lys Met Asp Gln Ala Leu Val Arg Gly Arg Trp Asn Leu

565 570 575

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