高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株及构件方法

文档序号：1932521 发布日期：2021-12-07 浏览：15次 >En<

阅读说明：本技术 高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株及构件方法 (Aspergillus versicolor D5 delta stc17 strain of high-yield active Xanthone compound DHST and construction method ) 是由刘京韩小斌马斯琦彭玉龙赵栋霖张成省王小彦芶剑渝温明霞于 2021-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株,由敲除片段敲除杂色曲霉D5菌株中细胞色素P450单加氧酶基因获得,敲除片段以杂色曲霉D5菌株的基因组为模板,利用引物扩增细胞色素P450单加氧酶基因上游序列和下游序列得到0.8kb-1.2kb上游片段和0.8kb-1.2kb下游片段,将上游片段和下游片段与潮霉素抗性基因融合得到；细胞色素P450单加氧酶基因序列为序列表中所示的序列；杂色曲霉D5Δstc17菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.23209,通过对杂色曲霉D5Δstc17菌株代谢产物进行检测发现：其代谢的除草活性Xanthone类化合物DHST的量高出原杂色曲霉D5菌株代谢的除草活性Xanthone类化合物DHST的量三倍；本发明公开了一种高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株的构件方法。(The invention discloses an aspergillus versicolor D5 Δ stc17 strain of a high-yield active Xanthone compound DHST, which is obtained by knocking out cytochrome P450 monooxygenase gene in an aspergillus versicolor D5 strain by a knock-out fragment, wherein the knock-out fragment is obtained by taking the genome of the aspergillus versicolor D5 strain as a template, amplifying the upstream sequence and the downstream sequence of the cytochrome P450 monooxygenase gene by using a primer to obtain a 0.8kb-1.2kb upstream fragment and a 0.8kb-1.2kb downstream fragment, and fusing the upstream fragment and the downstream fragment with hygromycin resistance genes; the cytochrome P450 monooxygenase gene sequence is a sequence shown in a sequence table; the aspergillus versicolor D5 Δ stc17 strain is now preserved in China general microbiological culture Collection center with the preservation number of CGMCC NO.23209, and the detection on the metabolite of the aspergillus versicolor D5 Δ stc17 strain shows that: the amount of the metabolic herbicidal activity Xanthone compound DHST is three times higher than that of the herbicidal activity Xanthone compound DHST metabolized by the original Aspergillus versicolor D5 strain; the invention discloses a building block method of aspergillus versicolor D5 delta stc17 strain for high yield of active Xanthone compounds DHST.)

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株及构件方法。

背景技术

据不完全统计，世界各地共有3万余种杂草，其中有1800余种对庄稼作物的生长造成危害。杂草通过与作物竞争养分和空间使作物减产或品质下降，严重时甚至造成绝收，若不加控制，这些杂草可造成全世界粮食减产10%—15%，严重者甚至会减产超过50%。在过去的几十年，化学除草剂在杂草防除中发挥了主要的作用。目前大多数的除草剂的作用靶标主要有以下几种：光合色素及相关组分的合成和代谢、氨的代谢及氨基酸的生物合成、脂类的生物合成、光合电子传递系统。较少的作用靶标使杂草很容易产生抗药性，有报道显示，目前己有272个抗药性杂草生物型出现。同时，化学除草剂的长期、连续和大面积使用，也造成了诸如农药残留、食品安全和环境污染等一系列问题，因此，研究新型环境友好型生物除草剂迫在眉睫。

天然产物除草剂主要是指以植物、动物、微生物等产生的具有除草活性的次级代谢产物开发的除草剂，具有资源丰富、不破坏生态环境、易生物降解、毒性低、残留少、选择性强、对非靶标生物和哺乳动物安全、环境兼容性好、开发费用少、化学结构新奇、作用方式独特、靶标选择性高等合成除草剂无法比拟的优势。天然产物除草剂按其来源可分为植物源除草剂、动物源除草剂和微生物源除草剂。目前动物源除草剂未见报道，植物源除草剂报道的也很少，主要的研究与应用对象集中在微生物源除草剂。

微生物除草剂由于资源丰富、环境污染小等优点，符合可持续农业的发展要求，近年来引起了人们的广泛关注。微生物除草剂分为活体微生物和微生物次级代谢产物两种类型。与活体微生物和化学除草剂相比，微生物次级代谢产物具有以下优点：首先，化学结构新颖，一般为化学合成难以发现的潜在的新型植物毒性化合物；其次，与活性微生物除草剂相比，更易储存、利于剂型加工、使用方便且受环境干扰较小；第三，一般为多靶标作用位点和方式，不容易引起杂草抗性的产生；第四，易于在环境中降解，大多对哺乳动物低毒，对非靶标生物较安全；最后，开发和登记等费用低。

从海洋来源杂色曲霉（Aspergillus versicolor）D5菌株中分离鉴定到聚酮类化合物dihydrosterigmatocystin（DHST）具有显著的除草活性，对反枝苋的最小抑草浓度达到8.0 µg/mL，即在此浓度下杂草出现病症并停止生长；最小杀草浓度达到31 µg/mL。此化合物的除草活性为阳性药草甘膦的两倍，并且起效时间快，施药两天后杂草发生病症，4天后杂草完全死亡。同时，对该化合物针对苋科杂草进行了抗草谱筛选，发现对包括刺苋、绿苋、马齿苋、空心莲子草在内的苋科杂草具有明显的除草效果。但目前DHST的产量低、提取困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株, 本发明的目的之二是提供一种高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株的构件方法。

本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：

高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株，所述杂色曲霉D5Δstc17菌株由敲除片段敲除杂色曲霉D5菌株中细胞色素P450单加氧酶基因获得，所述敲除片段以杂色曲霉D5菌株的基因组为模板，利用引物扩增细胞色素P450单加氧酶基因上游序列和下游序列得到0.8kb-1.2kb上游片段和0.8kb-1.2kb下游片段，将上游片段和下游片段与潮霉素抗性基因融合得到；细胞色素P450单加氧酶基因序列为序列表中所示的序列；所述杂色曲霉D5Δstc17菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.23209，保藏日期为2021年8月12日起30年。

本发明的目的之二是通过以下技术方案实现的：

高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株的构件方法，包括如下步骤：

（1）以杂色曲霉D5菌株的基因组为模板，利用引物扩增细胞色素P450单加氧酶基因上游序列和下游序列得到0.8kb-1.2kb上游片段和0.8kb-1.2kb下游片段，将上游片段和下游片段与潮霉素抗性基因融合得到敲除片段；细胞色素P450单加氧酶基因序列为序列表中所示的序列；

（2）制备杂色曲霉D5菌株的原生质体；

（3）将敲除片段转化到原生质体获得转化子；

（4）培养转化子，之后通过筛选获得杂色曲霉阳性转化子，最后通过对杂色曲霉阳性转化子进行基因验证获得杂色曲霉D5Δstc17菌株。

进一步，所述步骤（1）中的扩增条件为：94℃变性5min；95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸7min。

进一步，所述步骤（2）中的制备杂色曲霉D5菌株的原生质体具体为：接种杂色曲霉D5菌株于马铃薯固体培养基平板，30℃培养5-7天；挑取大小合适的菌块，打碎后接种于100ml液体马铃薯培养基中，30℃培养24h后过滤收集菌丝体；用0.8M氯化镁清洗菌丝体后，将菌丝体放入1%溶酶菌的酶解液中，30℃、100rpm酶解1-2h；过滤去除菌丝体，3000rpm离心30min后获得杂色曲霉D5菌株的原生质体。

更进一步，所述步骤（3）中的将敲除片段转化到原生质体获得转化子具体为：将杂色曲霉D5菌株的原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗，用适量的山梨醇溶液重悬原生质体，使其浓度达到108个/ml；每150ul原生质体中加入10ul敲除片段、加入50ul 40% PEG4000，轻轻混匀，冰浴30min；加入1ml 40% PEG4000，混匀后室温放置10min，然后与15ml上层琼脂培养基混合后倾注于5个再生潮霉素筛选培养基平板上，30℃暗培养5d获得转化子。

再进一步，所述步骤（4）中的培养转化子，之后通过筛选获得杂色曲霉阳性转化子，最后通过对杂色曲霉阳性转化子进行基因验证获得杂色曲霉D5Δstc17菌株具体为：将步骤（3）获得的转化子转接到筛选平板上，在30℃传代纯化5天，重复两次，之后随机挑选3株培养后的转化子收集菌丝提取基因组DNA, 进行基因组PCR验证，获得杂色曲霉阳性转化子，最后将杂色曲霉阳性转化子进行单孢分离纯化，从中选3个单菌落再次进行基因组PCR验证；最终获得杂色曲霉D5Δstc17菌株。

本发明的有益效果是：

本发明的高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株具有如下有益效果：

（1）通过对杂色曲霉D5Δstc17菌株代谢产物进行检测发现：其代谢的除草活性Xanthone类化合物DHST的量高出原杂色曲霉D5菌株代谢的除草活性Xanthone类化合物DHST的量三倍；

（2）杂色曲霉D5Δstc17菌株生长速度明显高于杂色曲霉D5菌株；

（3）D5Δstc17菌株的代谢产物丰富度显著提高。

本发明的一种高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株的构件方法，步骤简单，实现容易。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为杂色曲霉D5Δstc17菌株代谢产物与原杂色曲霉D5菌株代谢产物的液相色谱对比图；

图2为接种相同质量的杂色曲霉D5Δstc17菌株菌丝体和杂色曲霉D5菌株菌丝体获得不同菌体量的杂色曲霉D5Δstc17菌株与杂色曲霉D5菌株的对比图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

一种高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株，由敲除片段敲除杂色曲霉D5菌株中细胞色素P450单加氧酶基因获得，所述敲除片段以杂色曲霉D5菌株的基因组为模板，利用引物扩增细胞色素P450单加氧酶基因上游序列和下游序列得到0.8kb-1.2kb上游片段和0.8kb-1.2kb下游片段，将上游片段和下游片段与潮霉素抗性基因融合得到；细胞色素P450单加氧酶基因序列为序列表中所示的序列；所述杂色曲霉D5Δstc17菌株菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.23209。

一种高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株的构件方法，包括如下步骤：

（1）以杂色曲霉D5菌株的基因组为模板，利用引物stc17-uF(AGTTCGTCAATGTGGCAGGG)和stc17-u（hpn）R（ctttacgcttgcgatcccgaaCCGCCCATCATGGTGTAGAAAA）扩增细胞色素P450单加氧酶基因上游序列，利用引物（hpn）stc17d-F （cctgggttcgcaaagataattgGGGCGCAGGCTATACGACGAAG）和stc17d-R（CCCCCGATATCTCAGGCCTG）扩增P450单加氧酶基因下游序列，细胞色素P450单加氧酶基因序列为序列表中所示的序列，扩增条件为：94℃变性5min；95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸7min，得到1kb上游片段和1kb下游片段，将上游片段和下游片段与潮霉素抗性基因融合得到敲除片段，其中上下游片段分别位于潮霉素抗性基因的两侧；

（2）接种杂色曲霉D5菌株于马铃薯固体培养基平板，30℃培养6天；挑取大小合适的菌块，打碎后接种于100ml液体马铃薯培养基中，30℃培养24h后过滤收集菌丝体；用0.8M氯化镁清洗菌丝体后，将菌丝体放入1%溶酶菌的酶解液中，30℃、100rpm酶解1.5h；过滤去除菌丝体，3000rpm离心30min后获得杂色曲霉D5菌株的原生质体。

（3）将杂色曲霉D5菌株的原生质体用1.2M山梨醇溶液清洗，用适量的山梨醇溶液重悬原生质体，使其浓度达到108个/ml；每150ul原生质体中加入10ul敲除片段、加入50ul40% PEG4000，轻轻混匀，冰浴30min；加入1ml 40% PEG4000，混匀后室温放置10min，然后与15ml上层琼脂培养基混合后倾注于5个再生潮霉素筛选培养基平板上，30℃暗培养5d获得转化子。

（4）将步骤（3）获得的转化子转接到筛选平板上，在30℃传代纯化5天，重复两次，之后随机挑选3株培养后的转化子收集菌丝提取基因组DNA, 进行基因组PCR验证，获得杂色曲霉阳性转化子，最后将杂色曲霉阳性转化子进行单孢分离纯化，从中选3个单菌落再次进行基因组PCR验证；最终获得杂色曲霉D5Δstc17菌株。

为了验证杂色曲霉D5Δstc17菌株代谢产物变化，建立试验组和对比组；

试验组

发酵杂色曲霉D5Δstc17菌株，利用LC-MS检测突变菌株代谢产物变化，具体如下：

a杂色曲霉D5Δstc17菌株的发酵培养：采用马铃薯葡萄糖液体培养基，1000 mL锥形瓶中加入马铃薯浸出粉5.5g/L、葡萄糖18g/L、粗海盐28 g/L，水380mL，接种杂色曲霉D5Δstc17菌株后，28℃发酵培养35天。

b将步骤a所得的发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩；发酵菌体用甲醇：二氯甲烷为1:1的溶液浸泡，减压浓缩，将剩余水相用乙酸乙酯萃取，萃取物减压浓缩与发酵液提取物合并，干燥，得到提取物。

c将步骤b所得的提取物采用正相硅胶柱初步处理，分别使用10%乙酸乙酯-石油醚，10%甲醇-乙酸乙酯进行洗脱，10%甲醇-乙酸乙酯洗脱部分浓缩至干后，用甲醇溶解配制成10.0 mg/mL。运用Agilent 1290 system进行HPLC分析，系统配备DAD检测器，检测波长范围为210–700 nm；分析柱采用Waters SunFire C18（5 μm，4.6 × 250 mm），洗脱溶剂为A泵，甲醇，B泵，水（添加0.1%三氟乙酸）；流速1.0 mL/min，根据样品的极性选择流动相的组成和比例。质谱检测装置为赛默飞LTQ Orbitrap XL，喷雾电压4.0 kv，管电压16 v，镜电压35 v，毛细管温度300°C，鞘层气体流速40 L/min，辅助气体流速10 L/min，质谱的外部校准产生的质量精度优于3 ppm；质谱数据分别在正、负电离模式下获得，分辨率为30000，质量范围为100–1500 Da，然后在CID模式下进行数据相关扫描；使用赛默飞XCalibur 4.1版软件进行数据采集和分析。

对比组

对比组与试验组的区别仅仅在于对比组的菌株为杂色曲霉D5菌株。

试验组与对比组的液相色谱图如图1所，由图1可知，除草活性Xanthone类化合物DHST（Dihydrosterigmatocystin）的产量大幅度提高，即杂色曲霉D5Δstc17菌株对应的DHST峰面积是11841613 mv·s，杂色曲霉D5菌株对应的DHST峰面积是4200800 mv·s，杂色曲霉D5Δstc17菌株DHST的产量高出了3倍，同时杂色曲霉D5Δstc17菌株的代谢产物丰富度也显著提高；

另杂色曲霉D5Δstc17菌株的生长速度提高：即接种相同质量的菌丝体，发酵14d时拍照观察菌体量，如图2所示，杂色曲霉D5Δstc17菌株生长速度明显高于杂色曲霉D5菌株。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州省烟草公司遵义市公司

中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）

<120> 高产活性Xanthone类化合物DHST的杂色曲霉D5Δstc17菌株及构件方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1774

<212> DNA

<213> 杂色曲霉（Aspergillus versicolor）D5菌株

<400> 1

atgatgagga ctcttcctgg ggatgcgcga tacactcgct tcacgcacgg gtataacatt 60

tgattccggt tattcacaat acatactgac ttgattagca aagaactgtc caaggctggg 120

caggccatgt ctggcgacga gccctatctg ttgcgaaaca aatcgaagcg cgacctcgtc 180

ctccatactc cagcgcagat gagagacttt tttaagggag atggaaaacg tgagtttttt 240

tttttttttt ttttttttgt tttttgtttt tttttttttt ttaatcattt caaacacaag 300

agaagtaagc tgacctgtac agtccacacc aagcagcagg atgcaagcat gggcgcgtac 360

ttccttcgca gtctgggcca gtgtgtagga gcccagaatg gaccacgctg gcaccaaacc 420

cgctaccact tggaacagtt cttctctgct attgaagcgg cgtcgatgat tacggatttc 480

cagcgggtgt tgaataactg ggcgcaaaca ctgccggaca atgcagcatc gcagcagatt 540

ggcgacagga agttcctgac cgacagcgtt gagatttgtc gacagcttcc ttttcgtatg 600

attgcgatgt gtctttacgg gaatatgcta accagcgagg tgagtctttt gttcttttat 660

atttccgggt gttaatgatt cagcgattcg acatgctgtg gcgcctcaac aggatccacg 720

agaaggtgac gcagtatacg ttctttggca cctgggagaa tatgccctat tatcatctgc 780

ttcccactgc agcaaacaga gtcctggccg agtatgagca tggatggaag gaattcaacc 840

tggagatcat caacgcagcg cgaaaggtac ttcctattga tcacattcga gtatcttcta 900

accaggatta gagcaacact tcctgtcgag cagcacgcat gttccaagtt gttgaatcgg 960

gcgacatgac aatggacatg gtatggccct caatgctgtt ttaaggcagg atgctgatct 1020

tcaaagtacc ttcaatctct agatgaaatc ctgttcacca acatcgatgt cacgtccgcc 1080

cagtttgcct acggattgat caatatgggc aagtctccag cagctgggcg caggctatac 1140

gacgaagtca gcaccgttgc tgtcgaggaa gacgagatcg acttttacgc ccgaaaggac 1200

gatacattcc tgcacaagat gtatctggag attctacgaa gcaatccgcc catttgtttg 1260

tgcccattct ttgactacta aaggttctct ctgacgttca atctttctag ggtttacctt 1320

ccccgaaacc accgcggtcg agaaacgaat cgacggattc ctcatcccag ccggcaccaa 1380

cgtggtcatt gacacactgc gactgaataa atcgtctccg atatggggaa acactggcca 1440

cgagttccac cctgaacgat gggatcatat caccactggg caggcgcggt atagctggct 1500

tggatacggc atgggcccga ggaagtgtct gggaaagaac tttgccaata tcatcctgaa 1560

gctgttcctg atctcggtca gtcggcactt caccctggat gcaggagagg gtgccgttca 1620

gatcaagagg gatcggttta cgtgtgtgcc ggagcagctg gtcgtgtttg agcagcggta 1680

gtttaagtct gagagtatta tatactggat aattatgaat tatgttttct cactctataa 1740

tcccattatt ctatagaata ctcttctgaa ctaa 1774

<210> 2

<211> 336

<212> PRT

<213> 杂色曲霉（Aspergillus versicolor）D5菌株

<400> 2

Met Met Arg Thr Leu Pro Gly Asp Ala Arg Tyr Thr Arg Phe Thr His

1 5 10 15

Gly Lys Glu Leu Ser Lys Ala Gly Gln Ala Met Ser Gly Asp Glu Pro

20 25 30

Tyr Leu Leu Arg Asn Lys Ser Lys Arg Asp Leu Val Leu His Thr Pro

35 40 45

Ala Gln Met Arg Asp Phe Phe Lys Gly Asp Gly Lys Leu His Thr Lys

50 55 60

Gln Gln Asp Ala Ser Met Gly Ala Tyr Phe Leu Arg Ser Leu Gly Gln

65 70 75 80

Cys Val Gly Ala Gln Asn Gly Pro Arg Trp His Gln Thr Arg Tyr His

85 90 95

Leu Glu Gln Phe Phe Ser Ala Ile Glu Ala Ala Ser Met Ile Thr Asp

100 105 110

Phe Gln Arg Val Leu Asn Asn Trp Ala Gln Thr Leu Pro Asp Asn Ala

115 120 125

Ala Ser Gln Gln Ile Gly Asp Arg Lys Phe Leu Thr Asp Ser Val Glu

130 135 140

Ile Cys Arg Gln Leu Pro Phe Arg Met Ile Ala Met Cys Leu Tyr Gly

145 150 155 160

Asn Met Leu Thr Ser Glu Tyr Leu Gln Ser Leu Asp Glu Ile Leu Phe

165 170 175

Thr Asn Ile Asp Val Thr Ser Ala Gln Phe Ala Tyr Gly Leu Ile Asn

180 185 190

Met Gly Lys Ser Pro Ala Ala Gly Arg Arg Leu Tyr Asp Glu Val Ser

195 200 205

Thr Val Ala Val Glu Glu Asp Glu Ile Asp Phe Tyr Ala Arg Lys Asp

210 215 220

Asp Thr Phe Leu His Lys Met Tyr Leu Glu Ile Leu Arg Ser Asn Pro

225 230 235 240

Pro Ile Trp Phe Thr Phe Pro Glu Thr Thr Ala Val Glu Lys Arg Ile

245 250 255

Asp Gly Phe Leu Ile Pro Ala Gly Thr Asn Val Val Ile Asp Thr Leu

260 265 270

Arg Leu Asn Lys Ser Ser Pro Ile Trp Gly Asn Thr Gly His Glu Phe

275 280 285

His Pro Glu Arg Trp Asp His Ile Thr Thr Gly Gln Ala Arg Tyr Ser

290 295 300

Trp Leu Gly Tyr Gly Met Gly Pro Arg Lys Cys Leu Gly Lys Asn Phe

305 310 315 320

Ala Asn Ile Ile Leu Lys Leu Phe Leu Ile Ser Asn Thr Leu Leu Asn

325 330 335

序列表