阅读说明：本技术 一种基于双重信号放大的啶虫脒传感器及其检测方法 (A kind of Acetamiprid sensor and its detection method based on dual signal amplification ) 是由 郭业民 史孝杰 黄靖程 王豹 赵庆雪 孙霞 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：一种基于双重信号放大的啶虫脒传感器及其检测方法,包括适配体修饰层、纳米粒子双重信号放大层和电极基体,其中所述的纳米粒子双重信号放大层为还原性氧化石墨烯纳米银粒子材料和电沉积普鲁士蓝-纳米金复合材料,其一方面能够增强传感器的导电性来加强信号输出,同时还增强传感器的氧化还原反应从而提高信号输出；所述的导电聚合物为复合材料；所述的电极基体为玻碳材质的电极基体；所述的适配体修饰层为啶虫脒适配体和牛血清白蛋白。本发明制备所得的传感器对现有机磷农药的检测线性范围为1pM–1μM,传感器对啶虫脒的检测限为0.136pM。(A kind of Acetamiprid sensor and its detection method based on dual signal amplification, including aptamers decorative layer, nanoparticle dual signal amplification layer and electrode matrix, wherein the nanoparticle dual signal amplification layer be reproducibility stannic oxide/graphene nano silver particles material and electro-deposition it is Prussian blue-nanogold composite material, its one side can enhance the electric conductivity of sensor to reinforce signal output, while enhance the redox reaction of sensor also to improve signal output；The conducting polymer is composite material；The electrode matrix is the electrode matrix of glass carbon materials matter；The aptamers decorative layer is Acetamiprid aptamers and bovine serum albumin(BSA).It is 1pM -1 μM to the detection range of linearity of existing machine phosphorus insecticide that the present invention, which prepares resulting sensor, and sensor is limited to 0.136pM to the detection of Acetamiprid.)

一种基于双重信号放大的啶虫脒传感器及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于双重信号放大的啶虫脒传感器及其检测方法，属于电化学生物传感器领域。

背景技术

目前农药残留问题引起了人们的广泛关注，因其已危及了人类健康和导致环境污染。啶虫脒作为一种新烟碱类杀虫剂已成为有机磷农药或其他常见农药的替代品，然而其广泛使用仍然成为人类健康的潜在危害物质之一。目前检测啶虫脒的方法有：气相色谱法、液相色谱法、酶联免疫法等。然而，每种方法都会存在如下的一种或多种缺点：设备昂贵、方法复杂、稳定性差、耗时、灵敏度不高、选择性一般等。因此，寻求一种方便、简便、快速、超灵敏以及高特异性的啶虫脒。

核酸适配体（Apt）以其目标物的多样性、易于操控及储存、便于修饰及信号放大、稳定性好等特性成为系统、简易、灵敏检测农药分子的有力武器，可以针对几乎任一种农药分子进行特异性检测。可以利用核酸适配体构建一种构建简便、快速、超灵敏、高特异性和环境友好电化学传感器。

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种制备检测信号大、稳定性高、选择性好的适配体传感器，并用于啶虫脒的检测。

本发明的技术方案为：通过在玻碳电极固定还原性氧化石墨烯纳米银粒子材料和电沉积普鲁士蓝-纳米金复合材料，再滴加啶虫脒适配体，实现传感器的构建，然后用于有机磷农药的检测；包括如下步骤：（1）玻碳电极的预处理；（2）还原性氧化石墨烯-纳米银复合材料（rGO-AgNPs）的制备；（3）普鲁士蓝-纳米金（PB-AuNPs）复合薄膜沉积液和稳定液的制备；（4）适配体传感器的组装；（5）啶虫脒农药的测定。

优选地，（1）中所述电极为玻碳电极，其需要在氧化铝泥浆里研磨5min，用去离子水反复冲洗上述磨过的电极，超声清洗 1-3 次，每次 2-3 min，然后再分别用 1:1乙醇、1:1 硝酸以及蒸馏水超声 5 min，然后放入由5 mmol/L of [Fe(CN)6]3−/4−和 0.1 mol/Lof KCl组成的测试底液中，运用循环伏安法（CV）对其扫描（扫描电压为-0.6-+0.2 V，扫描速度为 0.05 V/s），所测得的两峰值电位差小于120 mV，得到性能稳定电极。

优选地，所述（2）rGO-AgNPs的制备过程：25mg氧化石墨烯溶于50ml去离子水，在40KHz、150W的条件下超声90分钟，使其完全溶解；将得到的氧化石墨烯分散液加入三口瓶（250ml）中，常温时加入20mg的AgNO3和0.275g的柠檬酸钠反应30分钟，升温至98摄氏度后加入350μl氨水（35%）和28mg水合肼（80%），搅拌反应4小时，趁热3000rpm/min离心15min，收集沉淀物；用去乙醇和去离子水多次清洗直至pH呈中性。

优选地，所述（3）中沉积液的制备过程：将 0.05 g 壳聚糖溶于 100 mL 1.0% 的醋酸溶液中，室温下搅拌3 h，配成 0.05% 壳聚糖溶液，使壳聚糖完全溶解；称取 0.0625 gFeCl3，0.0822 g K3[Fe(CN)6]，0.7455 g KCl以及 1 mL 浓盐酸加入 100 mL 上述得到的壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分散液；再将制备好的 1 mL 的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散 0.5 h 至完全溶解，备用。

优选地，纳米金胶制备方法：在经过硅化处理的玻璃瓶中加入200mL超纯水和2mL氯金酸溶液（1%m/v），轻轻摇匀，然后将瓶口盖住，注意不要拧紧；将玻璃瓶置于微波炉中，用高火档加热至沸腾（约4 min）；取出玻璃瓶，注意不要落入灰尘及杂物，同时摇晃玻璃瓶，并快速加入4.8 mL %1（m/v）的柠檬酸三钠溶液，注意摇晃玻璃瓶时不要让溶液溅出，加入柠檬酸三钠后继续摇晃混匀；再将玻璃盖好盖子（注意不要拧紧），置于微波炉，中高火4min继续加热；取出玻璃瓶，此时产物为酒红色纳米金溶液，冷却到室温并用超纯水定容到200ml。

优选地，所述（4）中的适配体传感器的组装步骤：首先，在玻碳电极表面滴加6μL（1）中制备的的rGO-AgNPs滴加到电极表面并在常温下晾干得到rGo-AgNPS/GCE；将玻碳电极浸在新配制的电沉积底液（除氧），运用循环伏安法（CV）对其扫描（扫描电压为-0.6-+0.2V，扫描速度为 0.05 V/s），沉积圈数为 12。之后，电极在稳定液中在-0.6 V ~+0.2 V之间扫描循环伏安图直至图像稳定得到PB-AuNPs /rGo-AgNPS/GCE。接下来，0.5%牛血清蛋白溶液（BSA）滴涂在制备好的电极表面，孵育30分钟以封闭非特异性结合位点，用超纯水轻轻冲洗除去多余的BSA。最后，将制备的BSA/Apt/rGO-CuNPs/SPCE生物传感器存储在4℃温度冰箱，以备下面的实验使用。

优选地，所述（5）中核酸适配体的碱基序列为5'-SH-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCAT ATTATGAAGA-3'。

优选地，所述非特异性结合位点封闭条件为：在电极表面滴6μLBSA，室温下孵育30min，轻轻冲洗电极表面，氮气吹干，至此适配体传感器制备完成。

优选地，（5）中啶虫脒农药的测定过程为：电化学测试条件均为在pH 7.4的铁***溶液中采用循环伏安法进行扫描，记录上述制备好的适配体传感器被目标物溶液孵育前后的电流变化，根据所得电流差值的大小反映农药浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种基于双重信号放大的啶虫脒传感器及其检测方法；利用还原性氧化石墨烯纳米银粒子/普鲁士蓝-纳米金复合材料的协同作用；一方面还原性氧化石墨烯纳米银粒子提高整个电极的导电性进而提高输出电流信号；另一方面利用普鲁士蓝-纳米金增强整个反应体系的氧化还原反应来提高其输出信号。该传感器可用于实际样品中啶虫脒农药的检测，为监管部门的现场快速监测提供新方法。

附图说明

图1为配体传感器的制备过程。

图2为适配体传感器的CV表征。

图3为传感器电沉积时间优化结果。

图4为传感器pH优化结果。

图5为传感器适配体浓度优化结果。

图6为传感器孵育时间优化结果。

图7为传感器特异性检测结果。

图8为传感器实际样品检测结果。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定：

实施例1：一步电沉积法制备适配体传感器

（1）还原性氧化石墨烯-纳米银复合材料（rGO-AgNPs）的制备

25mg氧化石墨烯溶于50ml去离子水，在40KHz、150W的条件下超声90分钟，使其完全溶解；将得到的氧化石墨烯分散液加入三口瓶（250ml）中，常温时加入20mg的AgNO3和0.275g的柠檬酸钠反应30分钟，升温至98摄氏度后加入350μl氨水（35%）和28mg水合肼（80%），搅拌反应4小时，趁热3000rpm/min离心15min，收集沉淀物；用去乙醇和去离子水多次清洗直至pH呈中性。

（2）普鲁士蓝-纳米金（PB-AuNPs）电沉积液和温定液的配制

将 0.05 g 壳聚糖溶于 100 mL 1.0% 的醋酸溶液中，室温下搅拌3 h，配成 0.05% 壳聚糖溶液，使壳聚糖完全溶解；称取 0.0625 g FeCl3，0.0822 g K3[Fe(CN)6]，0.7455 gKCl以及 1 mL 浓盐酸加入 100 mL 上述得到的壳聚糖溶液中，在室温下超声分散，直至得到稳定的暗绿色分散液；再将制备好的 1 mL 的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中，再在室温下超声分散 0.5 h 至完全溶解，备用;温定液为0.1 mol/L KCl 0.01 mol/L HCl溶液。

纳米金胶制备方法：在经过硅化处理的玻璃瓶中加入200mL超纯水和2mL氯金酸溶液（1%m/v），轻轻摇匀，然后将瓶口盖住，注意不要拧紧；将玻璃瓶置于微波炉中，用高火档加热至沸腾（约4 min）；取出玻璃瓶，注意不要落入灰尘及杂物，同时摇晃玻璃瓶，并快速加入4.8 mL %1（m/v）的柠檬酸三钠溶液，注意摇晃玻璃瓶时不要让溶液溅出，加入柠檬酸三钠后继续摇晃混匀；再将玻璃盖好盖子（注意不要拧紧），置于微波炉，中高火4min继续加热；取出玻璃瓶，此时产物为酒红色纳米金溶液，冷却到室温并用超纯水定容到200ml。

（3）玻碳电极电极的预处理

将玻碳电极（GCE）在氧化铝泥浆里研磨5min，用去离子水反复冲洗上述磨过的电极，超声清洗 1-3 次，每次 2-3 min，然后再分别用 1:1乙醇、1:1 硝酸以及蒸馏水超声 5 min，然后放入测试底液中，运用循环伏安法（CV）对其扫描（扫描电压为-0.6-+0.2 V，扫描速度为 0.05 V/s），所测得的两峰值电位差小于120 mV，得到性能稳定电极。

（4）适配体传感器的制备

首先，在玻碳电极表面滴加6μL（1）中制备的的rGO-AgNPs滴加到电极表面并在常温下晾干得到rGo-AgNPS/GCE；将玻碳电极浸在新配制的电沉积底液（除氧），运用循环伏安法（CV）对其扫描（扫描电压为-0.6-+0.2 V，扫描速度为 0.05 V/s），沉积圈数为 12。之后，电极在稳定液中在-0.6 V ~+0.2 V之间扫描循环伏安图直至图像稳定得到PB-AuNPs /rGo-AgNPS/GCE。接下来，0.5%牛血清蛋白溶液（BSA）滴涂在制备好的电极表面，孵育30分钟以封闭非特异性结合位点，用超纯水轻轻冲洗除去多余的BSA。最后，将制备的BSA/Apt/rGO-CuNPs/SPCE生物传感器存储在4℃温度冰箱，以备下面的实验使用。图1显示了电沉积过程和适配体传感器组装工艺。

（5）电沉积材料CV表征

电沉积在电极上的不同复合材料通过CV技术进行电化学表征（图2）。相对于裸GCE（图2中f曲线），rGo-AgNPS固定在（图2中e曲线）表现出较高峰值电流。当PB-AuNPs /rGo-AgNPS全部固定在电极上（图2中a曲线），得到的PB-AuNPs /rGo-AgNPS/GCE可以产生更大电流，这表明具有导电性的CuNPs被成功修饰在rGO表面。当电沉积溶液中进一步添加适配体后（图2中b曲线），由于带负电荷的适配体增加了电子转移阻力，氧化还原峰值明显下降。加入牛血清蛋白，尤其导电性差，故电流进一步降低（图2中c曲线）。上述材料形态表征结果表明一步电沉积法制备适配体传感器是可行的。除此之外，我们还对单独在固定PB-AuNPs进行了测量，发现比两种复合材料效果差很多。综述所述，我们构建的传感器较大的电流信号输入，相比于只采用单重信号放大策略。

（6）适配体传感器条件优化

电沉积时间是影响该传感器PB-AuNPs材料性能的重要因素。我们通过改变循环伏安的循环次数，优化了电沉积时间。图3结果表明最佳电化学沉积时间是12个CV循环。

由于农药与适配体的结合亲和力在偏低或偏高的酸碱度下会降低，因此适配体传感器所处酸碱度环境是影响其检测性能至关重要的因素。在这部分的优化中，研究了采用不同pH 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）配置的铁***溶液对农药检测结果的影响；如图4所示PH优化结果发现，当pH 值为 7.5 时， CV 峰值电流差值最小，表明形成结构稳定的适配体-农药复合物最多。

图5描绘了适配体浓度对传感器的影响。结果表明，当电沉积溶液中含有4 μM的适配体时，CV电流差值达到最大，但随着适配体含量的增加，电流差值急剧下降。因为，过量的适配体可能导致它们分子间的杂交，造成适配体在电极上的固定量减少。因此，在该适配体传感器的制备中适配体浓度设为4μM。

目标物与适配体特异性结合的孵育时间是影响适配体传感器性能的另一重要因素，我们对其进行研究发现，结果如图6所示。40 min后电流差值基本不变。是最佳的孵育时间。

实施例2：一种基于双重信号放大的啶虫脒传感器及其检测方法用于有机磷农药检测

（1）标准曲线的建立

为监测适配体传感器上发生的电化学信号变化，CV检测技术在5.0 Mm [Fe(CN)6]3−/4−溶液（pH 7.5，包含0.1 M KCl）中进行，电位范围为-0.5～+0.1V（扫描速度为50mv/s）。所有的适配体传感器均在最佳实验条件下制备，测量其初始CV响应（记为I）。然后，将6 μL不同浓度的有机磷农药滴加在适配体传感器上，室温下孵育40 min，冲洗吹干后再次检测其电化学响应（记录为I0）。计算ΔI值(ΔI=I−I0)，分析研究其与农药浓度的关系。我们得到了ΔI与啶虫脒浓度对数值之间的线性关系。其相关系数为0.991，检测限为0.136pM，线性方程为y=19.85+4.3LogC（nM）。

（2）蔬菜样品中有机磷农药残留的检测

从当地超市购买的生菜和油菜样品用于实际样品实验中，它们用液相色谱技术检测后发现没有任何农药残留。采用标准加入法在样品中加入不同浓度（10 nM、100 nM）的啶虫脒标准溶液。24 h后取10 g样品加入榨汁机中匀浆，8000 rpm离心15 min后上清液通过0.22毫米滤膜过滤，得到的提取液用本发明制备的适配体传感器检测。实验结果如图8所示，回收率在89.84%-111.30%之间，表明该方法制备的适配体传感器可用于实际样品的检测分析。

实施例3：一步电沉积法制备的适配体传感器性能测试

（1）选择性分析

图7中abcd分别代表西维因、克百威、对硫磷、丙溴磷，e是啶虫脒，f是上述农药混合物。从图中可以看出，没有特异性目标物存在时，CV峰值电流差很小，表明适配体不能与这些干扰性农药分子结合。柱状图e与f均有很大的电流差值，且结果相近，表明该适配体传感器有很好的选择性和抗干扰能力。

（2）稳定性、再生性研究

制备的适配体传感器在4℃环境下保存7天后，其电化学信号是初始信号的96%，相对标准偏差仅为2.36%，表明该传感器具有良好的稳定性。再生性是评价适配体传感器性能的另一关键因素。在这部分实验中，5个已经检测甲拌磷农药后的传感器浸入甘氨酸-盐酸缓冲液(0.05 mol/L，pH 2.8)中5分钟，以破坏目标物-适配体的连接。冲洗吹干后将其再次用于检测甲拌磷。结果表明，电流值保持在97.5%左右，相对标准偏差为3.25%。