基于WO3/BiOI与酶催化沉淀相结合的光电传感器的构建
阅读说明：本技术 基于WO3/BiOI与酶催化沉淀相结合的光电传感器的构建 (Based on WO3The building of the photoelectric sensor of/BiOI in conjunction with enzymatic precipitated phase ) 是由 颜梅 苗培 张晶 李增军 赵悦英 于京华 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于WO3/BiOI与酶催化沉淀相结合的光电传感器的构建方法,首先合成了具有良好电化学信号的花状WO3结构,该结构有大的比表面积,能够在负载更多的检测物；又在花状WO3上负载了BiOI,进一步增加电化学信号；另外在二抗上面修饰了HRP,它可以催化4-CN与H2O2迅速反应生成沉淀物附着在电极表面,极大的阻碍了电极表面的电荷传输,导致光电信号的减小；同时,Ab2-HRP生物偶联物通过特异性结合在抗原上,增大了传感器的空间位阻,进一步的引起光电信号的减小；这样通过层层修饰构建成了检测前列腺抗原的电化学传感器。(The invention discloses a kind of construction method of photoelectric sensor based on WO3/BiOI in conjunction with enzymatic precipitated phase, the flower-shaped WO3 structure with good electrochemical signals has been synthesized first, which has big specific surface area, can load more detectable substances；BiOI has been loaded on flower-shaped WO3 again, has further increased electrochemical signals；In addition HRP has been modified on secondary antibody, it can be catalyzed 4-CN with H2O2 rapidly react generate sediment be attached to electrode surface, greatly hinder electrode surface charge transmission, lead to the reduction of photosignal；Meanwhile Ab2-HRP bioconjugate increases the steric hindrance of sensor, further causes the reduction of photosignal by specifically binding on antigen；The electrochemical sensor of detection prostate antigen has been built by modification layer by layer in this way.)
技术领域
本发明涉及***特异性抗原的定量检测领域，更具体的说是基于WO3/BiOI与酶催化沉淀相结合的光电传感器的构建的方法。
背景技术
肿瘤标志物是肿瘤细胞通过基因表达而合成、分泌，或是机体因对肿瘤产生反应而异常产生的一类物质，在肿瘤早期诊断中有重要作用。癌症的早期发现需求对其肿瘤标示物高选择性、高灵敏、快速分析检测的方法。因此,建立简单快速灵敏和选择性好的恶性肿瘤生物标示物检测新方法,对恶性肿瘤的早期发现和和治疗效果评价具有十分重要的意义。
光电化学传感免疫传感器其工作原理主要利用抗原-抗体的特异性识别功能，所产生的感应信号通过信号转换器转换成可输出的电化学信号，该信号与目标分析物的浓度呈现一定的比例关系，从而可以实现对目标物质的定量分析。近年来，光电化学免疫传感器受到许多研究者的关注，因为其免疫反应的高特异性、简单的操作、高灵敏度、高选择性以及分析速度快等优点，在临床医学、环境污染物检测、食品分析、生物技术等领域得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于构建一种用于***特异性抗原检测的光电化学生物传感器。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种基于WO3/BiOI与酶催化沉淀相结合的光电传感器的构建，其特征包括以下步骤：
（1）将1.0 g的WCl6溶于50 mL的无水乙醇中，在160 ºC的水浴锅中加热4 h；将得到的产品自然冷却至室温后，分别用无水乙醇和超纯水洗涤三次，在60 ºC下干燥12 h；
（2）将步骤（1）合成的0.3 g WO3溶于60 mL超纯水中，在搅拌的同时加入1.0 mmol的KI；继续搅拌40 min后，将1.0 mmol Bi(NO3)3·5H2O加入上述混合溶液中，然后对反应混合物进行超声处理15 min，接着在室温下搅拌3 h，最后在8000 rmp转速下离心处理2 min，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次，在60 ºC下烘干；
（3）导电玻璃为铟锡氧化物玻璃（ITO），将导电玻璃切割为4.0×0.5 cm条状，依次用丙酮溶液、二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗5 min，然后在氮气下干燥备用；将ITO玻璃放在步骤（2）合成的浓度为2.0 mg/mL的WO3/BiOI混合溶液里超声处理20 min，接着在200 ºC下煅烧2 h后，得到ITO/WO3/BiOI电极；
（4）将50 µL浓度为20 µg mL−1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与50 µL浓度为10 mg mL−1的N-羟基丁二酰亚胺溶液加入800 mL的浓度为50 mg/mL Ab2溶液中，然后将200 mL的浓度为1.0 mg/mL的HRP与上述溶液混合，在30 ºC下振荡温育3 h，紧接着在4ºC下孵育12 h；最后，在6000 rpm离心转速下离心处理15 min获得Ab2-HRP复合物，并使用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释至800 mL；
（5）用超纯水冲洗ITO/WO3/BiOI电极，随后把6 μL浓度为10 μg mL−1的一抗即Ab1在4ºC下孵育16 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液彻底冲洗3次；继续滴涂20 µL 3%的牛血清白蛋白封堵非特异性结合位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液彻底冲洗3次，将20 μL不同浓度***抗原滴加至电极表面，室温下孵育30 min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤3次；继续滴加20 μL步骤（4）合成的Ab2-HRP；随后将上述电极放置于浓度为1.0 mg mL-1的4-CN和浓度为1.5 mg mL-1 的H2O2的混合溶液中10 min，最后使用超纯水冲洗电极3次；
（6）将步骤（5）处理好的修饰电极作为工作电极，对电极是铂丝电极，参比电极是Ag/AgCl电极，偏压数值为0 V，氙灯作为光源刺激，电解池为pH 7.4的磷酸盐缓冲液体系，测定电流I-T曲线来进行光电性能的检测。
本发明的有益效果：
（1）本发明成本低廉、实验操作简单，反应条件容易控制。
（2）Ab2标记物HRP可以催化4-CN与H2O2迅速反应生成沉淀物附着在电极表面，极大的阻碍了电极表面的电荷传输，导致光电信号的减小。
（3）Ab2-HRP生物偶联物通过特异性结合在抗原上，增大了传感器的空间位阻，进一步的引起光电信号的减小。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，按照本发明技术方案结合实施例进行实施，给出具体的实施方式：
（1）将1.0 g的WCl6溶于50 mL的无水乙醇中，在160 ºC的水浴锅中加热4 h；将得到的产品自然冷却至室温后，分别用无水乙醇和超纯水洗涤三次，在60 ºC下干燥12 h；
（2）将步骤（1）合成的0.3 g WO3溶于60 mL超纯水中，在搅拌的同时加入1.0 mmol的KI；继续搅拌40 min后，将1.0 mmol Bi(NO3)3·5H2O加入上述混合溶液中，然后对反应混合物进行超声处理15 min，接着在室温下搅拌3 h，最后在8000 rmp转速下离心处理2 min，用超纯水和无水乙醇分别洗涤3次，在60 ºC下烘干；
（3）导电玻璃为铟锡氧化物玻璃（ITO），将导电玻璃切割为4.0×0.5 cm条状，依次用丙酮溶液、二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗5 min，然后在氮气下干燥备用；将ITO玻璃放在步骤（2）合成的浓度为2.0 mg/mL的WO3/BiOI混合溶液里超声处理20 min，接着在200 ºC下煅烧2 h后，得到ITO/WO3/BiOI电极；
（4）将50 µL浓度为20 µg mL−1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与50 µL浓度为10 mg mL−1的N-羟基丁二酰亚胺溶液加入800 mL的浓度为50 mg/mL Ab2溶液中，然后将200 mL的浓度为1.0 mg/mL的HRP与上述溶液混合，在30 ºC下振荡温育3 h，紧接着在4ºC下孵育12 h；最后，在6000 rpm离心转速下离心处理15 min获得Ab2-HRP复合物，并使用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释至800 mL；
（5）用超纯水冲洗ITO/WO3/BiOI电极，随后把6 μL浓度为10 μg mL−1的一抗即Ab1在4ºC下孵育16 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液彻底冲洗3次；继续滴涂20 µL 3%的牛血清白蛋白封堵非特异性结合位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液彻底冲洗3次，将20 μL不同浓度***抗原滴加至电极表面，室温下孵育30 min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤3次；继续滴加20 μL步骤（4）合成的Ab2-HRP；随后将上述电极放置于浓度为1.0 mg mL-1的4-CN和浓度为1.5 mg mL-1 的H2O2的混合溶液中10 min，最后使用超纯水冲洗电极3次；
（6）将步骤（5）处理好的修饰电极作为工作电极，对电极是铂丝电极，参比电极是Ag/AgCl电极，偏压数值为0 V，氙灯作为光源刺激，电解池为pH为7.4的磷酸盐冲溶液，改变***特异性抗原的浓度，在1.0 pg mL−1至10 ng mL−1范围内，光电流响应的变化值与浓度的对数值呈现良好的线性关系，且线性方程为：I =−161.25−12.53logc，相关系数为0.997，检出限为0.2 pg/mL，因此，这项工作实现了高灵敏度、高稳定性地检测***特异性抗原。