阅读说明：本技术 一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法 (Test tube micro-cuttage aseptic propagation method for eggplant rootstocks ) 是由 于文进 张映卿 钟川 阳燕娟 于 2019-09-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法,所述方法包括：无菌苗获得、芽诱导培养、继代增殖培养、生根培养、炼苗移栽。芽诱导的培养基为MS+KT0.4～0.6mg/L+IBA0.05～0.15mg/L,继代增殖培养基为MS+IBA0.35～0.45mg/L,生根培养基为1/2MS+IBA0.15～0.25mg/L。本发明以茎段为外植体,所用外植体简单易取；植物生长调节剂配比简单,所用试剂价格低廉,成本低；芽诱导率达90％,15d能长出1cm左右的侧芽；继代增殖30d,增殖系数达5～6倍,生根效果明显,移栽成活高。本发明建立了水茄整个组培快繁技术体系,整个生产过程周期短,操作简便,增殖倍数高,完全能满足大规模化种苗繁育的需求,具有良好的应用前景。(The invention discloses a test tube micro-cuttage aseptic propagation method for eggplant stocks, which comprises the following steps: obtaining aseptic seedlings, bud induction culture, subculture proliferation culture, rooting culture and hardening seedling transplantation. The bud induction culture medium is MS + KT 0.4-0.6 mg/L + IBA 0.05-0.15 mg/L, the subculture multiplication culture medium is MS + IBA 0.35-0.45 mg/L, and the rooting culture medium is 1/2MS + IBA 0.15-0.25 mg/L. The stem section is used as the explant, and the used explant is simple and easy to take; the plant growth regulator has simple proportioning, low price of the used reagent and low cost; the bud inductivity reaches 90 percent, and lateral buds about 1cm can grow after 15 days; subculture multiplication is carried out for 30 days, the multiplication coefficient reaches 5-6 times, the rooting effect is obvious, and the survival rate of transplanting is high. The invention establishes the whole tissue culture and rapid propagation technical system of the solanum torvum, has short period of the whole production process, simple and convenient operation and high multiplication factor, can completely meet the requirement of large-scale seedling propagation and has good application prospect.)

一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养快速繁殖技术领域，尤其涉及一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法。

背景技术

水茄(Solanum torvum)又称为“托鲁巴姆"，是栽培种茄子(Solanum melogena)的近缘野生种，原产于美洲。该植物高抗青枯病、黄萎病、枯萎病、根结线虫等主要土传病虫害，是茄子和番茄生产上普遍使用的嫁接砧木。

虽然植株生长势极强，但水茄种子粒极小且内源激素含量少，因此种子成熟后具有极强的休眠性，正常播种的水茄种子出芽约为一个月的时间。出芽破土后，幼苗初期生长非常缓慢，尤其在低温条件下生长速度近乎停滞。

由于水茄苗龄长，发芽率、发芽势和发芽指数低，幼苗生长速度慢等问题限制了其在工厂化育苗上的规模应用，因此迫切需要开发其他方法提高水茄的育苗效率，降低育苗成本。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法，该方法操作简单，生产成本低，外植体容易获得，增殖系数高，生长周期短，是短时间内获得大量水茄的有效途径。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法，包括以下步骤：

(1)无菌苗获得：将水茄的种子经过预处理后，播种到MS培养基表面上，种子萌发生长到3～4片真叶时，获得初代无菌苗；

(2)侧芽诱导：以步骤(1)所获得的无菌苗茎段为外植体，在超净工作台中用灭菌刀片将无菌苗侧芽茎段切成0.5cm，采用微扦插的方式接种到芽诱导诱导培养基中，培养至侧芽长出5～6片真叶；

(3)继代增殖培养：将步骤(2)中长出新芽的茎段微扦插到继代增殖培养基中，在该培养基中会不断增殖出新芽，每25～30天进行一次继代培养，重复此步骤实现大量增殖；

(4)生根培养：将步骤(3)中继代增殖的芽长至1～2cm长时扦***生根培养基进行生根培养，经过25～30d的生根过程得到可用于炼苗移栽的组培苗；

(5)炼苗移栽：将步骤(4)得到的组培苗由培养转移至自然光下炼苗3天，后打开瓶盖继续炼苗3天，取出植株将根部培养基用清水冲洗干净，在基质中打孔植入组培苗，覆上基质后微压实，使植株直立，保持基质湿润。

较佳地，在步骤(1)，所述预处理为：将水茄的种子用1g/L的赤霉素浸种3h，在超净工作台上用无菌水冲洗3遍后用70％乙醇浸15s，0.1％HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗5～6遍。

较佳地，在步骤(2)，所述芽诱导培养基为MS培养基中加入KT0.4～0.6mg/L、IBA0.05～0.15mg/L、蔗糖25～32g/L、琼脂4.5～5.0g/L，pH5.8～6.0。

较佳地，在步骤(3)，所述继代增殖培养基为MS培养基中加入IBA0.35～0.45mg/L、蔗糖25～32g/L、琼脂4.5～5.0g/L，pH5.8～6.0。

较佳地，在步骤(4)，所述生根培养基为1/2MS培养基中加入IBA0.15～0.25mg/L、蔗糖25～32g/L、琼脂4.5～5.0g/L，pH5.8～6.0。

较佳地，在步骤(5)，所述基质为泥炭：椰糠：珍珠岩＝3：2：1。

较佳地，培养过程中，培养室条件设置为温度25±2℃，相对湿度50～60％，光照时长16h/d，光照强度2000～3000lx。

所述的培养基的pH值均用1mol/L HCl或NaOH调节。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

(1)本发明以茎段为外植体，所用外植体简单易取；植物生长调节剂配比简单，所用试剂价格低廉，成本低；芽诱导率达90％以上，15d能长出1cm左右的侧芽；继代增殖30d，增殖系数达5～6倍，生根效果明显，移栽成活高。

(2)本发明建立了水茄整个组培快繁技术体系，整个生产过程周期短，操作简便，增殖倍数高，完全能满足大规模化种苗繁育的需求，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为水茄芽诱导示意图；

图2为水茄继代增殖示意图；

图3为水茄继代增殖另一示意图；

图4为水茄生根效果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

实施例1

一种茄子砧木试管微扦插无菌繁殖的方法，包括以下步骤：

步骤一：培养基配制，芽分化培养基以MS培养基附加KT0.5mg/L、IBA0.10 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.8g/L；继代增殖培养基以MS培养基附加IBA0.40mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5～5.0g/L；生根培养基为1/2MS培养基中附加IBA0.20 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5～5.0g/L。上述培养基皆将pH调节至5.8，每瓶50mL分装入组培瓶中，密封后放入高压灭菌锅121℃灭菌20min；

步骤二：无菌苗获得，将水茄种子用1g/L赤霉素浸泡3h，使种子吸胀完全后转入超净工作台进行消毒，先用70％乙醇冲洗15s，用灭菌水冲洗3遍后用0.1％HgCl₂消毒10min，灭菌水冲洗5遍后用灭菌后的滤纸吸干表面水分，用灭菌后的镊子小心将种子点播到MS基本培养基的表面，种子萌发生长到3-4片真叶时，获得初代无菌苗；

步骤三：侧芽诱导，在超净工作台内小心取出无菌苗，将无菌苗含生长点的茎段切成0.5cm左右，同时切除叶片，将茎段用0.05％的升汞消毒10min后用灭菌镊子夹住茎段上端，直接***芽诱导培养基中，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株，盖上盖子后放入培养室中进行培养，培养至新芽长出5～6片真叶时进行继代增殖；

步骤四：继代增殖培养，取出步骤三中的新芽用灭菌镊子夹住微扦插到继代增殖培养基中，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株，盖上盖子后放入培养室中进行培养，培养过程中植株会不断长出新芽，继代培养过程为30d，增殖系数能达到6.11，每30d重复此步骤实现增殖；

步骤五：生根培养，步骤四中继代增殖的芽长至1～2cm长时扦***生根培养基进行生根培养，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株；盖上盖子后放入培养室中进行培养，一周后开始发根，生根率100％，经过30d的生根过程后一级根数达4.000，根长145.09mm，根粗0.71mm且须根浓密；

步骤六：炼苗移栽，将步骤五得到的组培苗由培养转移至自然光下炼苗3天，使植株适应外界光照条件，后打开瓶盖继续炼苗3天，取出植株将根部培养基用清水冲洗干净，在基质中打孔***组培苗，覆上基质后微压实，使植株直立；基质配比为泥炭：椰糠：珍珠岩＝3：2：1，前三天用塑料薄膜盖住放置在25℃的培养室中保持基质湿润，相对湿度55％，光照时长16h/d，光照强度2500lx，植株抗逆性加强后再转入温室中。

本实施例的水茄快速繁殖体系的建立方法，包括水茄外无菌苗获得、芽诱导、继代增殖、生根培养和炼苗移栽的过程。其中芽诱导培养基为MS+KT0.5mg/L+IBA0.10 mg/L，平均诱导率达到92.5％，继代增殖培养基为MS+IBA0.40mg/L，增殖系数达6.11倍，生根培养为1/2MS+IBA0.20mg/L，生根率为100％。本实施例的培养基可以提高增殖系数，生根效果显著，极大缩短了常规育种的时间，操作简单，成本低，可以满足规模化生产的需求，为水茄组培苗的工厂化生产提供依据。

如图1所示为本实施例中的水茄芽诱导示意图，由图1可看出水茄芽诱导效果好；图2为水茄继代增殖示意图，图3水茄继代增殖另一示意图，由图2及图3可知，水茄继代增殖系数高；图4为水茄生根效果示意图，由图4可知，水茄根系茂盛，生根效果显著。

实施例2

步骤一：培养基配制，芽诱导培养基以MS培养基附加KT0.4mg/L、IBA0.05 mg/L、蔗糖25g/L、琼脂4.5g/L；继代增殖培养基以MS培养基附加IBA0.15mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L；生根培养基为1/2MS培养基中附加IBA0.15 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂4.8g/L。上述培养基皆将pH调节至5.8，每瓶50mL分装入组培瓶中，密封后放入高压灭菌锅121℃灭菌20min；

步骤二：无菌苗获得，将水茄种子用1g/L赤霉素浸泡3h，使种子吸胀完全后转入超净工作台进行消毒，先用70％乙醇冲洗15s，用灭菌水冲洗3遍后用0.1％HgCl₂消毒10min，灭菌水冲洗5遍后用灭菌后的滤纸吸干表面水分，用灭菌后的镊子小心将种子点播到MS基本培养基的表面，种子萌发生长到3-4片真叶时，获得初代无菌苗；

步骤三：侧芽诱导，在超净工作台内小心取出无菌苗，将无菌苗含生长点的茎段切成0.5cm左右，同时切除叶片，将茎段用0.05％的升汞消毒10min后用灭菌镊子夹住茎段上端，直接***芽诱导培养基中，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株，盖上盖子后放入培养室中进行培养，培养至新芽长出5～6片真叶时进行继代增殖；

步骤四：继代增殖培养，取出步骤三中的新芽用灭菌镊子夹住微扦插到继代增殖培养基中，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株，盖上盖子后放入培养室中进行培养，培养过程中植株会不断长出新芽，继代培养过程为30d，增殖系数能达到6.11，每30d重复此步骤实现增殖；

步骤五：生根培养，步骤四中继代增殖的芽长至1～2cm长时扦***生根培养基进行生根培养，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株；盖上盖子后放入培养室中进行培养，一周后开始发根，生根率100％，经过30d的生根过程后一级根数达5.00，根长119.68mm，根粗0.43mm且须根浓密；

步骤六：炼苗移栽，将步骤五得到的组培苗由培养转移至自然光下炼苗3天，使植株适应外界光照条件，后打开瓶盖继续炼苗3天，取出植株将根部培养基用清水冲洗干净，在基质中打孔***组培苗，覆上基质后微压实，使植株直立；基质配比为泥炭：椰糠：珍珠岩＝3：2：1，前三天用塑料薄膜盖住放置在25℃的培养室中保持基质湿润，相对湿度55％，光照时长16h/d，光照强度2500lx，植株抗逆性加强后再转入温室中。

本实施例的水茄快速繁殖体系的建立方法，包括水茄外无菌苗获得、芽分化诱导、继代增殖、生根培养和炼苗移栽的过程。其中芽诱导培养基为MS+KT0.4mg/L+IBA0.05mg/L，平均诱导率达到91.2％，继代增殖培养基为MS+IBA0.15mg/L，增殖系数达6.03倍，生根培养为1/2MS+IBA0.15mg/L，生根率为100％。本实施例的培养基可以提高增殖系数，生根效果显著，极大缩短了常规育种的时间，操作简单，成本低，可以满足规模化生产的需求，为水茄组培苗的工厂化生产提供依据。

实施例3

步骤一：培养基配制，芽诱导培养基以MS培养基附加KT0.45mg/L、IBA0.15 mg/L、蔗糖32g/L、琼脂5.0g/L；继代增殖培养基以MS培养基附加IBA0.25mg/L、蔗糖32g/L、琼脂5.0g/L；生根培养基为1/2MS培养基中附加IBA0.25 mg/L、蔗糖32g/L、琼脂5.0g/L。上述培养基皆将pH调节至6.0，每瓶50mL分装入组培瓶中，密封后放入高压灭菌锅121℃灭菌20min；

步骤二：无菌苗获得，将水茄种子用1g/L赤霉素浸泡3h，使种子吸胀完全后转入超净工作台进行消毒，先用70％乙醇冲洗15s，用灭菌水冲洗3遍后用0.1％HgCl₂消毒10min，灭菌水冲洗5遍后用灭菌后的滤纸吸干表面水分，用灭菌后的镊子小心将种子点播到MS基本培养基的表面，种子萌发生长到3-4片真叶时，获得初代无菌苗；

步骤三：侧芽诱导，在超净工作台内小心取出无菌苗，将无菌苗含生长点的茎段切成0.5cm左右，同时切除叶片，将茎段用0.05％的升汞消毒10min后用灭菌镊子夹住茎段上端，直接***芽诱导培养基中，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株，盖上盖子后放入培养室中进行培养，培养至新芽长出5～6片真叶时进行继代增殖；

步骤四：继代增殖培养，取出步骤三中的新芽用灭菌镊子夹住微扦插到继代增殖培养基中，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株，盖上盖子后放入培养室中进行培养，培养过程中植株会不断长出新芽，继代培养过程为30d，增殖系数能达到6.11，每30d重复此步骤实现增殖；

步骤五：生根培养，步骤四中继代增殖的芽长至1～2cm长时扦***生根培养基进行生根培养，***约0.3cm的深度，每个瓶子扦插5株；盖上盖子后放入培养室中进行培养，一周后开始发根，生根率100％，经过30d的生根过程后一级根数达4.67，根长112.64mm，根粗0.36mm且须根浓密；

步骤六：炼苗移栽，将步骤五得到的组培苗由培养转移至自然光下炼苗3天，使植株适应外界光照条件，后打开瓶盖继续炼苗3天，取出植株将根部培养基用清水冲洗干净，在基质中打孔***组培苗，覆上基质后微压实，使植株直立；基质配比为泥炭：椰糠：珍珠岩＝3：2：1，前三天用塑料薄膜盖住放置在25℃的培养室中保持基质湿润，相对湿度55％，光照时长16h/d，光照强度2500lx，植株抗逆性加强后再转入温室中。

本实施例的水茄快速繁殖体系的建立方法，包括水茄外无菌苗获得、芽诱导、继代增殖、生根培养和炼苗移栽的过程。其中芽诱导培养基为MS+KT0.45mg/L+IBA0.15mg/L，平均诱导率达到90.4％，继代增殖培养基为MS+IBA0.25mg/L，增殖系数达5.23倍，生根培养为1/2MS+IBA0.25mg/L，生根率为100％。本实施例的培养基可以提高增殖系数，生根效果显著，极大缩短了常规育种的时间，操作简单，成本低，可以满足规模化生产的需求，为水茄组培苗的工厂化生产提供依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。