具有广泛基因组对称的mva相关的新型痘苗病毒载体

文档序号：1785726 发布日期：2019-12-06 浏览：23次 >En<

阅读说明：本技术 具有广泛基因组对称的mva相关的新型痘苗病毒载体 (MVA-related novel vaccinia virus vectors with broad genome symmetry ) 是由英戈·乔丹福尔克·桑迪希于 2017-02-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及新型改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒。本发明还涉及用于培养所述MVA相关病毒的方法以及用于生产所述MVA相关病毒的方法。此外,本发明涉及药物组合物,所述药物组合物包含所述MVA相关病毒以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。此外,本发明涉及包含所述MVA相关病毒的疫苗。另外,本发明涉及用于医学用途的所述MVA相关病毒。(The present invention relates to novel improved vaccinia Ankara (MVA) -related viruses. The invention also relates to methods for culturing said MVA-related virus and to methods for producing said MVA-related virus. Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising said MVA-related virus together with one or more pharmaceutically acceptable excipients, diluents and/or carriers. Furthermore, the present invention relates to a vaccine comprising said MVA-related virus. In addition, the present invention relates to said MVA-related virus for medical use.)

具有广泛基因组对称的MVA相关的新型痘苗病毒载体

技术领域

本发明涉及新型改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒。本发明还涉及用于培养所述MVA相关病毒的方法以及用于生产所述MVA相关病毒的方法。此外，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含所述MVA相关病毒以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。此外，本发明涉及包含所述MVA相关病毒的疫苗。另外，本发明涉及用于医学用途的所述MVA相关病毒。

背景技术

痘苗病毒(VACV)属于痘病毒科(Poxviridae)的正痘病毒属(Orthopoxvirus)，已在成功根除天花中被用作活疫苗。然而，痘苗病毒可有效地感染人，其在实验室中作为表达载体的使用已受到安全顾虑和法规的影响。通过由高度减毒病毒株(其特征在于体外复制能力受限以及体内毒力缺失)开发痘苗载体，已解决了VACV标准株的安全性顾虑。

改良安卡拉痘苗(MVA)病毒是通过VACV株对原代鸡胚成纤维细胞培养中的复制的适应而获得的痘苗病毒株(Mayr和Munz，1964)。其属于高度减毒痘病毒，可用作用于大转基因的安全和反应原性表达以引发稳健的T细胞介导的免疫应答的疫苗载体(Drillien等，2004；Liu等，2008；Sutter和Moss，1992；Sutter等，1994)。其不受先前存在的免疫力的抑制，也被研究用于免疫受损的人患者的保护性和治疗性治疗(Cebere等，2006；McShane等，2002；Milligan等，2016；Webster等，2005)。

MVA的生产性复制限于禽类细胞和极少数哺乳动物细胞，如衍生自埃及果蝠的细胞系和BHK(Carroll和Moss，1997；Drexler等，1998；Jordan等，2009a)。与亲本病毒相比，MVA的窄宿主范围的分子基础似乎是由于六个缺失(缺失位点I至VI，数字随着缺失的大小而非基因组中的位置而增加)和数个可能由对禽类细胞的适应引起的更受限制的突变(Blanchard等，1998；Meisinger-Henschel等，2007；Meyer等，1991)。

提供足够的MVA病毒供应是具有挑战性的。由于MVA不复制从而不在接受者中扩增，其必须以10⁸个感染单位的高剂量来给予(Wyatt等，2004)。然而，目前可用的MVA病毒生产系统是耗时并且昂贵的，并且不能满足制药工业的需要。

此处，本发明人首次分离并表征了新型MVA相关病毒。本发明人发现该新型MVA相关病毒在基因组结构方面与(野生型)MVA病毒有根本不同。结构差异导致病毒具有优于(野生型)MVA病毒的有利特性。特别地，与用(野生型)MVA病毒感染的培养物相比，该新型MVA相关病毒将更多数量的感染单位释放至经感染的培养物的上清液中。此外，与(野生型)MVA病毒相比，该新型MVA相关病毒复制至非常高的滴度。此外，该新型MVA相关病毒在贴壁培养中诱导较少的合胞体。

以上描述的新型MVA相关病毒的有益特性改善了其工业生产。特别是其允许以高产率生产新型MVA相关病毒，并且从而也允许其中可包含的异源性蛋白质(例如抗原)的生产。另外，可直接从无细胞上清液中分离该新型MVA相关病毒，从而促进纯化并由此促进生产该MVA相关病毒的生物反应器的操作和安排。这反过来降低了其生产成本。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒，所述改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒包含以下特征中的一个或多个：

(i)对应于包含右反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域的核酸序列，而非(代替)包含左反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的核酸序列；

(ii)两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列；

(iii)没有包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列；

(iv)没有缺失位点I；

(v)两个缺失位点IV；

(vi)没有选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；

(vii)选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的两个开放阅读框；和/或

(viii)编码L3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

在第二方面，本发明涉及根据第一方面的MVA相关病毒的基因组。

在第三方面，本发明涉及包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组的细胞。

在第四方面，本发明涉及用于培养根据第一方面的MVA相关病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据第三方面的细胞；

(b)培养所述细胞；以及

(c)分离所述MVA相关病毒。

在第五方面，本发明涉及用于生产根据第一方面的MVA相关病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用MVA病毒感染细胞；

(b)培养所述细胞；

(c)分离所述MVA病毒；以及

(d)用步骤(c)中分离的所述MVA病毒重复步骤(a)至步骤(c)，直至检测到包含以下特征中的一个或多个的MVA相关病毒：

(ii)两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列；

(iii)没有包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列；

(iv)没有缺失位点I；

(v)两个缺失位点IV；

(vi)没有选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；

(viii)编码L3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

在第六方面，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。

在第七方面，本发明涉及一种疫苗，所述疫苗包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组。

在第八方面，本发明涉及用于医学用途的根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组。

本发明的此概述并未描述本发明的所有特征。

具体实施方式

在下面详细描述本发明之前，应理解的是，本发明并不限于本文所描述的特定的方法学、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅为所附权利要求书所限。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

优选地，本文使用的术语的定义如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和H.著(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland中所述。

本说明书全文引用了若干文件。不论在上文或下文中，本文引用的各文件(包括全部专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、使用说明、GenBank提交序列登录号等)均通过引用的方式整体并入本文。在此不应解释为承认本发明无权借助在先发明而使本发明早于这些公开。

下文中将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方式一起列出，然而应理解，可将它们以任何方式和任何数量进行组合，以创造另外的实施方式。不应将多方面描述的实例和优选的实施方式解释为将本发明仅限于明确描述的实施方式。应将该描述理解为支持和涵盖将明确描述的实施方式与任何数量的公开的和/或优选的要素进行组合的实施方式。此外，除非上下文另有指定，应认为本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都被本申请的描述所公开。

除非上下文另有要求，在整个本说明书和所附权利要求书中，词语“包含”以及如“含有”和“包括”的变体将被理解为暗示包含所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，而不是排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另有明确规定，单数形式“一”、“一个”和“该/所述”包括复数指示物。

本文所使用的术语“减毒病毒”是指在预定接受者(例如人或动物接受者)中具有削弱的毒力的病毒。此类性质可通过病毒对窄温度范围或窄宿主范围以及对其它人工复制环境(包括限定化学成分培养基)的适应来实现。在衍生自预定接受者(例如人或动物接受者)的细胞或者在从组织环境取出的细胞中，此类病毒的复制受到限制。该病毒可在预定接受者外(例如在容许细胞(permissive cell)培养物或实验室动物中)复制至高滴度。减毒病毒株的实例是用于针对严重的麻疹疾病提供保护的Ender’s减毒麻疹病毒Edmonston株，或世界卫生组织(WHO)在20世纪70年代开展的痘病根除运动中使用的痘苗病毒株。

本文所使用的术语“高度减毒病毒”是指在预定接受者(例如人或动物接受者)中具有被阻断的毒力的病毒。此类性质可通过病毒对窄温度范围或窄宿主范围以及对其它人工复制环境(包括限定化学成分培养基)的适应来实现。在衍生自预定接受者(例如人或动物接受者)的细胞或者在从组织环境取出的细胞中，此类病毒的复制被阻断。该病毒可在预定接受者外(例如在容许细胞/细胞培养物或实验室动物中)复制至高滴度。本发明的MVA病毒为高度减毒病毒。所述MVA病毒不在人或非人灵长类动物细胞中复制。

本文所使用的术语“宿主限制性病毒”是指(仅或主要)在特定宿主有机体中(例如在细胞(如禽类细胞)中或在动物(如实验室动物)中)复制的病毒。所述病毒在其它有机体中(例如在除禽类细胞外的其它细胞中)不复制或仅以非常低的水平复制。可通过病毒在宿主有机体中(例如在禽类细胞中)的(连续)病毒传代来实现宿主限制性病毒。本发明的MVA相关病毒限制于禽类细胞。所述MVA相关病毒不在人细胞中复制。

本文所使用的术语“病毒传代”是指涉及用病毒对一系列宿主有机体(例如细胞或动物(如实验室动物))进行感染的过程。每次给病毒一些时间进行孵育，然后用孵育的病毒对下一宿主有机体进行感染。也可将该过程称为“连续病毒传代”。例如，连续病毒传代允许(高度)减毒病毒和/或宿主限制性病毒的产生。本发明的MVA相关病毒为高度减毒病毒。所述MVA相关病毒限制于禽类细胞。所述MVA相关病毒不在人或非人灵长类动物细胞中复制。

当以术语“容许(permissive)”限定宿主有机体(例如细胞(如禽类细胞)或动物(如实验室动物))时，是指病毒能够回避所述有机体的防御以及能够入侵细胞、在所述细胞中复制和从所述细胞逃逸的事实。通常，当病毒已调控一种或几种所述有机体的细胞固有防御和/或所述有机体的免疫系统时发生此情况。

本文所使用的术语“接受者”是指可接受病毒(例如可用病毒进行疫苗接种(vaccinated))的受试者。所述受试者可为人或动物。所述动物可为哺乳动物物种的成员，如犬、猫、狼、鼬、啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)、马、牛、绵羊、山羊、猪、蝙蝠(例如巨型蝙蝠(megabat)或微型蝙蝠(microbat))或非人灵长类动物(例如猴，如类人猿)。特别地，本发明的MVA相关病毒不在人或非人灵长类动物接受者中复制。

本文所使用的术语“宿主有机体”是指可用于病毒生产和/或适应的有机体。所述宿主有机体可为细胞或动物(如实验室动物)。所述细胞可为禽类细胞(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭细胞(如鸭视网膜(CR)细胞))。所述动物(特别是实验室动物)可为鸟(例如鸡、鹌鹑、鹅或鸭)、犬、鼬、啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)、绵羊、山羊、猪、蝙蝠(例如巨型蝙蝠或微型蝙蝠)或非人灵长类动物(例如猴，如类人猿)。特别地，本发明的MVA相关病毒在禽类细胞中(例如在鸡细胞、鹌鹑细胞、鹅细胞或鸭细胞中)或在鸟类中(例如在鸡、鹌鹑、鹅或鸭中)复制。

本文所使用的术语“感染”是指病毒在细胞内复制以及产生病毒颗粒的能力。可通过检测病毒载量或通过观测人或动物中的疾病进展来对感染性进行评价。

本文所使用的术语“疫苗”是指能够用于在接受者(例如人或动物接受者)中引发保护性免疫力的试剂。就有效性而言，疫苗能够在部分被免疫群体中引发免疫力，而一些个体可能无法产生稳健或保护性的免疫应答，或者在一些情况下，无法产生任何免疫应答。这种无法产生可能源于接受者的遗传背景或者由于免疫缺陷状态(获得性或先天性免疫缺陷)或免疫阻遏(例如由于化疗处理或使用免疫阻遏药物)。可在动物模型中确定疫苗效力。本发明的疫苗包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组。在此方面，应注意所述MVA相关病毒本身可为疫苗。它赋予针对痘病(pox)的保护。然而，所述病毒可进一步包含异源性核酸序列，例如编码抗原(特别是抗原表位)的序列(可引发接受者中针对所述异源性核酸序列的额外的保护性免疫力)。也可将包含异源性核酸序列的MVA相关病毒称为重组MVA相关病毒。

本文所使用的术语“疫苗接种(vaccination)”是指用感染性病毒(例如以所述感染性病毒的减毒或灭活形式)对接受者(例如人或动物接受者)进行激发(challenged)以诱导特异性免疫力。在本发明中，用根据第一方面的MVA相关病毒或用根据第二方面的基因组对所述接受者进行激发以诱导针对痘病的免疫力。然而，在本发明的上下文中，术语“疫苗接种”还覆盖用进一步包含异源性核酸序列的MVA相关病毒对接受者进行的激发。所述异源性序列为应当针对其引发额外的保护性免疫力的序列。所述异源性序列可编码抗原，特别是抗原表位。也可将包含异源性核酸序列的MVA相关病毒称为重组MVA相关病毒。与所述病毒异源的此类表位的实例覆盖例如来自其它病毒(如流感病毒、肝炎病毒(如丙型肝炎病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或丝状病毒)的蛋白质的表位或衍生自与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白质的表位。在将疫苗给予至接受者体内后，表位表达并被呈递给免疫系统，可诱导针对这些表位的特异性免疫应答。所述接受者由此针对含有所述表位的蛋白质进行了免疫。

本文所使用的术语“异源性核酸序列”是指在正常情况下在自然界中未发现其与病毒(特别是与根据本发明的MVA相关病毒)密切相关的核酸序列。也可将包含异源性核酸序列的MVA相关病毒称为重组MVA相关病毒。所述异源性核酸序列优选选自编码(i)抗原(特别是抗原表位)；(ii)诊断化合物；和(iii)治疗化合物的序列。

本文所使用的术语“表位”(也称为抗原决定簇)是指免疫系统(特别是抗体、B细胞或T细胞)所识别的抗原的部分。

本文所使用的术语“保护”是指在适当时对接受者(例如人)中的疾病(例如痘病)的发展或持续进行预防或治疗(或两者)。

本文所使用的术语“保护性免疫力”包括体液(抗体)免疫力或细胞免疫力或两者，其对例如在经免疫的(经疫苗接种的)受试者中消除或减少感染细胞或病原体(例如病毒，如痘病毒)载量或者产生任何其它可测量的感染减轻有效。

本文所使用的术语“赋形剂”旨在表示药物组合物中不是活性成分的所有物质，如粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。

本文所使用的术语“稀释剂(diluent)”涉及稀释剂(diluting agent)和/或降粘剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括溶液、悬浮液(例如液体悬浮液或固体悬浮液)和/或介质。

本文所使用的术语“载体”涉及适于给予(例如向人给予)的一种或多种相容的固体填充剂或液体填充剂。术语“载体”涉及与活性组分组合以促进活性组分的应用的天然或合成的有机或无机组分。优选地，载体组分为无菌液体，如水或油(包括衍生自矿物油、动物或植物的油，如花生油、大豆油、芝麻油、向日葵油等)。也可使用盐溶液和水性葡萄糖以及甘油溶液作为水性载体化合物。

用于治疗用途的药学上可接受的载体或稀释剂在制药领域中是公知的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中有所描述。合适的载体的实例包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。

可根据预期的给药途径和标准药学实践选择药物载体、稀释剂和/或赋形剂。本发明的药物组合物可包含作为载体、赋形剂或稀释剂(或者在载体、赋形剂或稀释剂的基础之上包含)的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂和/或增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖)、无水乳糖、自由流动的乳糖(free-flow lactose)、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶(如***树胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂。防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸的酯、苯甲酸钠和山梨酸。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。

本文所使用的术语“原代细胞”或“原代细胞培养物”是指在遭受衰老、培养停止或细胞死亡前通常不能传代超过50次群体倍增的细胞或培养物。本文所使用的术语“次生细胞”或“次生细胞培养物”指直接衍生自原代细胞或原代细胞培养物的细胞或培养物。群体倍增限制仍然适用。本文所使用的术语“永生化细胞”或“永生化细胞培养物”指不受潜在细胞倍增数的限制的细胞或培养物及其后代。细胞培养物可由原代细胞、次生细胞或永生化细胞(即细胞系的细胞)组成。在本发明的优选实施方式中，所述细胞来自CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系衍生自设计用于疫苗生产的永生化番鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27,748-756)。CR.pIX细胞系进一步将编码腺病毒pIX蛋白的基因稳定地整合至其基因组中并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞。所述细胞为原代细胞。

本文所使用的术语“分离的细胞”是指从其天然环境或培养环境中取出的细胞。因此，分离的细胞可不含部分或全部天然组分或培养组分(即其中天然存在所述细胞的有机体的组分(例如器官，特别是组织)或其中培养所述细胞的组分(例如培养基或培养相关的杂质，如培养残留物))。所述细胞可用根据第一方面的MVA相关病毒感染或用根据第二方面的基因组转染。如何感染或转染细胞的技术是本领域技术人员已知的。

术语“非贴壁细胞”和“悬浮细胞”在本文中可互换使用。在本发明的上下文中，术语“非贴壁细胞”和“悬浮细胞”是指能在悬浮培养中存活而不附着于表面(例如组织培养塑料载体或微载体)的细胞。所述细胞可为能够天然存在于悬浮液中而不附着于表面的细胞。所述细胞还可为已进行改造或适应以使其能够在悬浮培养中存活而不附着于表面(例如组织培养塑料载体或微载体)的细胞。多数细胞为处于其原始的未改造或未适应形式的贴壁细胞。非贴壁细胞通常可生长至比贴壁条件所允许的密度更高的密度。因此，非贴壁细胞更适于工业水平中的培养(例如在生物反应器设置中或在搅拌培养中)。细胞通常必须适应于非贴壁细胞培养。由于原始细胞在无血清条件和/或在缺少合适表面时将发生细胞凋亡，这一适应是需要以逐渐减少的血清量(例如从10％到0％的胎牛血清(FCS)的稀释行(rows))进行传代的较长过程，由此选出被不可逆改造的细胞群。适应的非贴壁细胞是本领域已知的。本领域技术人员知晓用于将细胞从贴壁状态转移至非贴壁状态的方案(例如参见ApplMicrobiol Biotechnol.2008Mar；78(3):391-9.Epub 2008Jan 9)。

与此相反，本文所使用的术语“贴壁细胞”是指需要表面(如组织培养塑料载体或微载体)的细胞。所述表面可包被有细胞外基质组分，以增加贴壁性质，并提供生长和分化所需的其它信号。所述细胞需要定期传代，但允许容易地在倒置显微镜下可视检查。所述细胞需要酶解分离(例如用胰蛋白酶)。此外，贴壁细胞的生长受到表面积的限制，这会限制产量。

本文所使用的术语“无血清条件”指其中细胞在全无动物血清的培养基中生长的条件。相反，细胞在全无任何动物来源成分的培养基中生长，并且优选在无生物成分的任何复杂混合物的培养基(所谓“限定化学成分培养基”)中生长。

本文所使用的术语“细胞增殖培养基”指支持进行至少10次细胞倍增的细胞***的培养基，使得例如通过在该培养基中传代，可将8×10⁵个细胞的种子增至约4×10⁸个细胞，例如足以用于200升生物反应器。本文所使用的术语“增殖细胞”指***细胞，即能够以在48小时或更短时间内至少一次的倍增速率进行另外至少10次细胞倍增的细胞。

本文所使用的术语“病毒生产培养基”指增强了病毒在增殖细胞培养中的生产的培养基。通过添加病毒生产培养基，诱导细胞聚集体并且培养中的细胞增殖降低至少2倍或完全停止。病毒生产培养基优选含有CaCl₂、MgSO₄和/或NaCl。CaCl₂含量优选为在150mg/l至250mg/l之间的范围内，更优选为在180mg/l至250mg/l之间的范围内，最优选为在200mg/l至220mg/l之间的范围内，例如为150mg/l、155mg/l、160mg/l、165mg/l、170mg/l、175mg/l、180mg/l、185mg/l、190mg/l、195mg/l、200mg/l、205mg/l、210mg/l、215mg/l、220mg/l、225mg/l、230mg/l、235mg/l、240mg/l、245mg/l或250mg/l；MgSO₄含量优选为在50mg/l至150mg/l之间的范围内，更优选为在70mg/l至150mg/l之间的范围内，最优选为在90mg/l至120mg/l之间的范围内，例如为50mg/l、55mg/l、60mg/l、65mg/l、70mg/l、75mg/l、80mg/l、85mg/l、90mg/l、95mg/l、100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l或150mg/l；和/或NaCl含量优选为在5000mg/l至7500mg/l之间的范围内，更优选为在6000mg/l至7000mg/l之间的范围内，最优选为在6500mg/l至6800mg/l之间的范围内，例如为5000mg/l、5500mg/l、6000mg/l、6500mg/l、7000mg/l或7500mg/l。例如，所述病毒生产培养基可包含205mg/l CaCl₂、100mg/l MgSO₄和/或6500mg/l NaCl的盐含量。

本文所使用的术语“生产性复制”意为相比添加来感染培养物的病毒，可从经感染的培养物中回收至少一次更多的病毒。所述病毒可引起细胞病变效应，并复制至最终导致经感染的培养物中大量细胞死亡的水平。与生产性复制相反，生殖性复制能够以非常低的水平发生而不伴随细胞病变效应，并且可最终导致存活培养物中病毒的丧失。

本文所使用的术语“改良安卡拉痘苗(MVA)病毒”是指衍生自安卡拉株并且经开发用作疫苗和疫苗佐剂的高度减毒痘苗病毒株。原始MVA病毒是通过经由鸡胚细胞进行连续传代而从野生型安卡拉株中分离的。经过如此处理，所述MVA病毒丧失了大约15％的野生型痘苗病毒基因组，包括其在灵长类动物(包括人)细胞中有效复制的能力。

MVA病毒含有单拷贝的双链DNA基因组，长度约178kb。病毒基因组DNA包含以病毒端粒为侧翼的核心区。特别地，所述病毒端粒位于病毒基因组DNA的左位点和右位点。所述端粒进一步包含反向末端重复(ITR)。通常被认可为MVA病毒的病毒包含6个特征性缺失位点，称为缺失位点I、II、III、IV、V和VI。数字随缺失的大小而非在基因组中的位置而增加。缺失位点I位于左病毒端粒中，缺失位点II、III、V和VI位于核心区中。缺失位点IV位于右端粒中。认为仅有包含所有六个缺失位点的病毒才是真正的MVA。通常被认可为MVA病毒的病毒进一步包含选自于由C11R、C10L、D7L、A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的(功能性)基因产物的(一个)开放阅读框。描述这种真实/真正的MVA的方法已由Kremer等人出版(Kremer等，2012)。所述MVA病毒可具有根据登录号U94848(版本U94848.1以及GI:2772662)的序列。

本文所使用的术语“改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒”是指结构上不同于(上述或野生型)MVA病毒的病毒。因此可认为其不再构成典型的MVA病毒。不如说其为MVA相关病毒。所述MVA相关病毒可例如不再包含特定缺失位点(例如缺失位点I)和/或包含二重的特定缺失位点(例如缺失位点IV)。替代地或另外地，所述MVA相关病毒可例如不再包含特定基因产物(例如基因产物C11)的开放阅读框和/或包含二重的特定基因产物(例如基因产物B1)的开放阅读框。在第一方面中具体描述了本发明的MVA相关病毒。所述MVA相关病毒可具有/包含根据SEQ ID NO:37或Genbank登录号KY633487(MVA-CR19.GFP)的序列。

本文所使用的术语“分离的MVA相关病毒”是指从其天然环境或培养环境中取出的病毒。因此，分离的MVA相关病毒可不含部分或全部细胞组分，即其中天然存在所述病毒的细胞的组分或其中培养所述病毒的细胞的组分(例如细胞质组分或膜组分)。其也可不含部分或全部培养组分(例如培养基或培养相关杂质，如培养残留物)。

本文所使用的术语“纯化的MVA相关病毒”是指已在减少或消除不相关物质(即污染物，包括从中获得病毒的天然物质，例如细胞碎片、细胞残留物、细胞蛋白质、细胞DNA分子和/或细胞RNA分子)的存在的条件下分离的病毒。纯化的MVA相关病毒优选实质上不含细胞和/或培养组分。本文所使用的术语“实质上不含”在操作上用于物质的分析测试的上下文中。实质上不含污染物的纯化的MVA相关病毒优选为至少50％纯、更优选为至少90％纯、并且甚至更优选为至少99％纯或为100％纯。可通过色谱分析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定和本领域已知的其它方法对纯度进行评估。

本文所使用的术语“病毒端粒”是指病毒基因组DNA(例如MVA病毒或MVA相关病毒的基因组DNA)的左位点和右位点的序列。病毒基因组DNA左位点处的序列称为左病毒端粒，病毒基因组DNA右位点处的序列称为右病毒端粒。病毒端粒含有反向末端重复(ITR)，ITR包含基因组DNA左侧和右侧之间的互补区域，或由该互补区域组成。病毒端粒还包含功能性基因和破坏的(非功能性)基因，其在基因组DNA的两端可为重复的，或对于基因组DNA的左侧或右侧可为独特的。因此，病毒端粒延伸超出ITR区域本身，并且可包含30000bp(30kbp)或更多。

本文所使用的术语“反向末端重复(ITR)”是指包含病毒基因组DNA(例如MVA病毒或MVA相关病毒的基因组DNA)的左侧和右侧之间的互补区域或由该互补区域组成的序列。基因组DNA左侧的ITR称为“左ITR”，基因组DNA右侧的ITR称为“右ITR”。ITR为病毒端粒的一部分，特别是左ITR包含在左病毒端粒中，右ITR包含在右病毒端粒中。ITR可形成发夹结构，并且似乎提供病毒基因组DNA复制(其可能通过滞后链中的冈崎片段和前导链的链置换而发生)的起点。

本文所使用的术语“末端”是指病毒基因组DNA(例如MVA病毒或MVA相关病毒的基因组DNA)的左端和右端。

本文所使用的术语“核心区”是指包含缺失位点V和III的病毒基因组DNA(例如MVA病毒或MVA相关病毒的基因组DNA)的区域。特别地，本文所使用的术语“核心区”指从缺失位点V延伸至缺失位点III的区域，其中包含缺失位点V和III。

“氨基酸替换”在本文中也可称为“氨基酸置换”。本文所使用的术语“氨基酸***”是指在L3L、A3L、A34R和/或A9L基因产物的氨基酸序列内发生的氨基酸修饰，而本文所使用的术语“氨基酸添加”是指在L3L、A3L、A34R和/或A9L基因产物的N末端或C末端发生的氨基酸修饰。

在本发明的上下文中，如果两种或更多种基因产物中的氨基酸残基占据基因产物结构中的类似位置，则称所述氨基酸残基彼此“对应”。如本领域中公知的，可通过基于氨基酸序列或结构相似性将基因产物序列进行比对，来确定两种或更多种基因产物中的类似位置。此类比对工具对本领域技术人员来说是公知的，并且可例如在万维网(例如使用标准设置的ClustalW(www.ebi.ac.uk/clustalw)或Align(http://www.ebi.ac.u k/emboss/align/index.html)，优选Align EMBOSS::needle，Matrix：Blos um62，Gap Open 10.0，GapExtend 0.5)上获得。本领域技术人员理解，可能需要在任一序列中引入空位以产生令人满意的比对。如果两种或更多种基因产物中的氨基酸残基以最佳序列比对进行比对，则称所述氨基酸残基“对应”。将两种基因产物之间的“最佳序列比对”定义为产生最大数量的比对的相同残基的比对。如果两个比对序列之间的序列相似性(优选同一性)在10个、20个或30个氨基酸的长度上下降至小于30％、优选小于20％、更优选小于10％，则“最佳序列比对区域”结束，并由此确定比较序列的长度的测量和界限，用于确定相似性评分的目的。该方法也适用于核酸序列。这意味着在本发明的上下文中，如果残基占据核酸结构中的类似位置，则称核酸序列彼此“对应”。

此处，本发明人首次分离并表征了新型MVA相关病毒。本发明人发现该新型MVA相关病毒在结构方面与(野生型)MVA病毒不同。其具有迄今未描述的基因型。结构差异导致病毒具有优于(野生型)MVA病毒的有利特性。特别地，与用(野生型)MVA病毒感染的培养物相比，该新型MVA相关病毒将更多数量的感染单位释放至经感染的培养物的上清液中。此外，与(野生型)MVA病毒相比，该新型MVA相关病毒复制至非常高的滴度。此外，该新型MVA相关病毒在贴壁培养中诱导较少的合胞体。

因此，本发明的第一方面涉及一种改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒，所述改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒包含(不同于(野生型)MVA的)以下特征中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个)：

(ii)两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列；

(iii)没有包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列；

(iv)没有缺失位点I；

(v)两个缺失位点IV；

(vi)没有选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；

(viii)编码L3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

本领域技术人员将理解，以上描述的核酸序列为所述MVA相关病毒的病毒基因组DNA的一部分/包含在所述MVA相关病毒的病毒基因组DNA中，或为所述MVA相关病毒的基因组的一部分/包含在所述MVA相关病毒的基因组中。

所述MVA相关病毒可包含根据(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)或(viii)的特征。所述MVA相关病毒还可包含根据以下的特征：(ii)和(iii)；(ii)、(iii)和(viii)；(ii)和(iv)；(ii)、(iv)和(vi)；(ii)、(iv)和(viii)；(ii)、(iv)、(vi)和(viii)；(iii)和(v)；(iii)、(v)和(vii)；(iii)、(v)和(viii)；(iii)、(v)、(vii)和(viii)；(iv)和(v)；(iv)、(v)和(viii)；(vi)和(vii)；或(vi)、(vii)和(viii)。

在一个实施方式中，所述MVA相关病毒包含对应于包含右反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域的核酸序列，而非(代替)包含左反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的核酸序列(特征(i))。

特别地，包含右ITR并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域包含缺失位点IV和/或选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框。

特别地，包含左ITR并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的区域包含缺失位点I和/或选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的至少一个开放阅读框。

更具体地，包含右ITR并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域包含缺失位点IV和/或选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；并且，包含左ITR并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的区域包含缺失位点I和/或选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的至少一个开放阅读框。

因此，在一个优选的实施方式中，所述MVA相关病毒不包含缺失位点I；包含两个缺失位点IV；不包含选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；和/或包含选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的两个开放阅读框。

优选地，所述MVA相关病毒包含如下核酸序列：所述核酸序列对应于包含右反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的MVA区域，而非(代替)包含左反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的MVA的核酸序列。

所述MVA相关病毒还可包含如下核酸序列：所述核酸序列包含右反向末端重复(ITR)并且延伸至右ITR旁的独特(unique)序列但不包含缺失位点III，而非(代替)包含左反向末端重复(ITR)并且延伸至左ITR旁的独特序列但不包含缺失位点V的核酸序列。在此方面，所述独特序列为不包含互补区域的序列。它可为未转录的和未翻译的，可含有假基因(已失去其功能的先前的编码区)或可包含正被表达的基因。

替代地，所述MVA相关病毒可包含以右反向末端重复(ITR)开始并且包含右ITR、并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的核酸序列，而非(代替)以左反向末端重复(iii)开始并且包含左iii、并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的核酸序列。

在一个实施方式中，所述MVA相关病毒包含两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列(特征(ii))。

特别地，包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列进一步包含选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框。

因此，在一个优选的实施方式中，所述MVA相关病毒包含两个缺失位点IV；两个右ITR；以及选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的两个开放阅读框。

在一个实施方式中，所述MVA相关病毒不包含如下核酸序列：所述核酸序列包含缺失位点I和所述左ITR(特征(iii))。

特别地，包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列进一步包含选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框。

因此，在一个优选的实施方式中，所述MVA相关病毒不包含缺失位点I；不包含左ITR；并且不包含选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框。

优选地：

(i)所述包含右ITR并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域具有根据SEQ ID NO:37或Genbank登录号KY633487(优选从核苷酸位置162221至190549的范围或与其对应的核苷酸位置)的核酸序列，或为与所述核酸序列至少85％、至少90％、至少95％或100％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的变体；

(ii)所述包含左ITR并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的区域具有根据SEQ ID NO:37或Genbank登录号KY633487(优选从核苷酸位置1至31261的范围或与其对应的核苷酸位置)的核酸序列，或为与所述核酸序列至少85％、至少90％、至少95％或100％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的变体；和/或

(iii)所述包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列具有根据SEQ ID NO:37或Genbank登录号KY633487(优选从核苷酸位置179272至190549的范围或与其对应的核苷酸位置)的核酸序列，或为与所述核酸序列至少85％、至少90％、至少95％或100％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的变体。

上述变体优选为功能活性变体。这意味着与(野生型)MVA病毒相比，所述变体对根据本发明的MVA相关病毒的有益特性(如培养期间细胞外空间中更多数量的感染单位和/或增加的感染活性)不产生负面影响。所述有益特性允许例如以高产率生产根据本发明的MVA相关病毒。在实验部分中描述了测试所述有益特性是否仍然存在于以上变体中的实验。

所述变体还可包含由于与上述核酸序列编码相同或功能等同的氨基酸的遗传密码的简并性而导致的核酸变化。

在一个实施方式中，所述MVA相关病毒包含编码L3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变(特征(viii))。在一个替代实施方式中，所述MVA相关病毒包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

应当注意，编码上述基因产物的核酸序列包含导致所述基因产物的至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个或3个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。所述氨基酸序列修饰可为氨基酸缺失(例如1个、2个或3个氨基酸缺失)、氨基酸***(例如1个、2个或3个氨基酸***)、氨基酸添加(例如1个、2个或3个氨基酸添加)和/或氨基酸替换(例如1个、2个或3个氨基酸替换)。

优选地，所述核酸序列进一步编码A9L基因产物，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)。所述氨基酸序列修饰可为氨基酸缺失(例如1个、2个或3个氨基酸缺失)、氨基酸***(例如1个、2个或3个氨基酸***)、氨基酸添加(例如1个、2个或3个氨基酸添加)和/或氨基酸替换(例如1个、2个或3个氨基酸替换)。本发明人惊奇地发现上述突变进一步积极地影响了病毒产量。

更优选地，

(i)所述MVA相关病毒包含编码A3L基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A3L基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(ii)所述MVA相关病毒包含编码A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(iii)所述MVA相关病毒包含编码A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A3L基因产物、所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(iv)所述MVA相关病毒包含编码L3L基因产物和A3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述L3L基因产物和所述A3L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(v)所述MVA相关病毒包含编码L3L基因产物和A34R基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述3L3基因产物和所述A34R基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；或

(vi)所述MVA相关病毒包含编码L3L基因产物、A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述L3L基因产物、所述A3L基因产物、所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个或4个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个或4个突变)。

优选为：

(i)所述氨基酸序列修饰位于跨越根据SEQ ID NO:1的A3L基因产物的氨基酸位置634至644或与其对应的氨基酸位置的区域中；

(ii)所述氨基酸序列修饰位于跨越根据SEQ ID NO:2的A34R基因产物的氨基酸位置81至91或与其对应的氨基酸位置的区域中；

(iii)所述氨基酸序列修饰位于跨越根据SEQ ID NO:3的A9L基因产物的氨基酸位置70至80或与其对应的氨基酸位置的区域中；和/或

(iv)所述氨基酸序列修饰位于跨越根据SEQ ID NO:13的L3L基因产物的氨基酸位置105至115或与其对应的氨基酸位置的区域中。

从而，所述氨基酸序列修饰(例如氨基酸缺失或氨基酸替换)可位于(i)根据SEQID NO:1的A3L基因产物的氨基酸位置634、635、636、637、638、639、640、641、642、643或644处，或与其对应的氨基酸位置处；(ii)根据SEQ ID NO:2的A34R基因产物的氨基酸位置81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或91处，或与其对应的氨基酸位置处；(iii)根据SEQ ID NO:3的A9L基因产物的氨基酸位置70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80处，或与其对应的氨基酸位置处；和/或(iv)根据SEQ ID NO:13的L3L基因产物的氨基酸位置105、106、107、108、109、110、111、112、113或115处，或与其对应的氨基酸位置处。

进一步优选为：

(i)所述氨基酸序列修饰位于A3L基因产物的氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处；

(ii)所述氨基酸序列修饰位于A3L基因产物的氨基酸位置638处或与其对应的氨基酸位置处；

(iii)所述氨基酸序列修饰位于A34R基因产物的氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处；

(iv)所述氨基酸序列修饰位于A9L基因产物的氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处；

(v)所述氨基酸序列修饰位于A9L基因产物的氨基酸位置74处或与其对应的氨基酸位置处；和/或

(vi)所述氨基酸序列修饰位于L3L基因产物的氨基酸位置110处或与其对应的氨基酸位置处。

所述氨基酸序列修饰更优选为氨基酸缺失或氨基酸替换，其中：

(i)位于A3L基因产物的氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处的H缺失或者被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电荷的氨基酸(优选D或E)或极性不带电荷氨基酸(优选S、T、N或Q)替换；

(ii)位于A3L基因产物的氨基酸位置638处或与其对应的氨基酸位置处的R缺失或者被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电荷的氨基酸(优选D或E)或极性不带电荷氨基酸(优选S、T、N或Q)替换；

(iii)位于A34R基因产物的氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处的D缺失或者被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带正电荷的氨基酸(优选R、H或K)或极性不带电荷氨基酸(优选S、T、N或Q)替换；

(iv)位于A9L基因产物的氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处的K缺失或者被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电荷的氨基酸(优选D或E)或极性不带电荷氨基酸(优选S、T、N或Q)替换；

(v)位于A9L基因产物的氨基酸位置74处或与其对应的氨基酸位置处的K缺失或者被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电荷的氨基酸(优选D或E)或极性不带电荷氨基酸(优选S、T、N或Q)替换；和/或

(vi)位于L3L基因产物的氨基酸位置110处或与其对应的氨基酸位置处的V缺失或者被疏水性氨基酸(优选A、V、I、L、M、F、Y或W)、带负电荷的氨基酸(优选D或E)或极性不带电荷氨基酸(优选S、T、N或Q)替换。

所述氨基酸替换甚至更优选为以下氨基酸替换：

(i)用Y替换位于A3L基因产物的氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处的H(H639Y A3L基因产物突变体)；

(ii)用Y替换位于A3L基因产物的氨基酸位置638处或与其对应的氨基酸位置处的R(R638Y A3L基因产物突变体)；

(iii)用Y替换位于A34R基因产物的氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处的D(D86Y A34R基因产物突变体)；

(iv)用E替换位于A9L基因产物的氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处的K(K75E A9L基因产物突变体)；

(v)用E替换位于A9L基因产物的氨基酸位置74处或与其对应的氨基酸位置处的K(K74E A9L基因产物突变体)；和/或

(vi)用A替换位于L3L基因产物的氨基酸位置110处或与其对应的氨基酸位置处的V(V110A L3L基因产物突变体)。

所述氨基酸替换进一步甚至更优选为以下氨基酸替换：

(i)用Y替换位于A3L基因产物的氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处的H，以及用Y替换位于A34R基因产物的氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处的D(H639Y A3L/D86Y A34R基因产物突变体)；

(ii)用Y替换位于A3L基因产物的氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处的H，以及用E替换位于A9L基因产物的氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处的K(H639YA3L/K75E A9L基因产物突变体)；

(iii)用Y替换位于A34R基因产物的氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处的D，以及用E替换位于A9L基因产物的氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处的K(D86Y A34R/K75E A9L基因产物突变体)；

(iv)用Y替换位于A3L基因产物的氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处的H，用Y替换位于A34R基因产物的氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处的D，以及用E替换位于A9L基因产物的氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处的K(H639Y A3L/D86YA34R/K75E A9L基因产物突变体)；和/或

(v)用Y替换位于A3L基因产物的氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处的H，用Y替换位于A34R基因产物的氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处的D，用E替换位于A9L基因产物的氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处的K，以及用A替换位于L3L基因产物的氨基酸位置110处或与其对应的氨基酸位置处的V(H639Y A3L/D86Y A34R/K75EA9L/V110A L3L基因产物突变体)。

最优选为：

(i)具有H639Y突变的A3L基因产物具有根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列或为与所述氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％或100％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的变体，其中，所述变体(仍)包含位于氨基酸位置639处或与其对应的氨基酸位置处的氨基酸Y；

(ii)具有D86Y突变的A34R基因产物具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列或为与所述氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％或100％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的变体，其中，所述变体(仍)包含位于氨基酸位置86处或与其对应的氨基酸位置处的氨基酸Y；

(iii)具有K75E突变的A9L基因产物具有根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列或为与所述氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的变体，其中，所述变体(仍)包含位于氨基酸位置75处或与其对应的氨基酸位置处的氨基酸E；和/或

(iv)具有V110A突变的L3L基因产物具有根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列或为与所述氨基酸序列至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％或100％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的变体，其中，所述变体包含位于氨基酸位置110处或与其对应的氨基酸位置处的氨基酸A。

序列同一性特别优选为：(i)相比根据SEQ ID NO:4的相应参比氨基酸序列的至少50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、300、400、500、600个或更多个氨基酸的连续序列段(continuous stretch)为至少85％、90％、95％或99％；(ii)相比根据SEQ ID NO:5的相应参比氨基酸序列的至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160个或更多个氨基酸的连续序列段为至少85％、90％、95％或99％；(iii)相比根据SEQ ID NO:6的相应参比氨基酸序列的至少20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的连续序列段为至少85％、90％、95％或99％；或者(iv)相比根据SEQ ID NO:14的相应参比氨基酸序列的至少20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的连续序列段为至少85％、90％、95％或99％。所述序列同一性进一步特别优选为相比根据SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14的相应参比氨基酸序列为全长的至少85％、全长的至少90％、全长的至少95％或全长的至少99％。

上述变体优选为功能活性变体。这意味着与已知的(野生型)MVA病毒相比，氨基酸序列中的(另外的)变化对根据本发明的MVA相关病毒的有益特性(如培养期间细胞外空间中更多数量的感染单位和/或增加的感染活性)不产生负面影响。所述有益特性允许例如以高产率生产根据本发明的MVA相关病毒。在实验部分中描述了测试所述有益特性是否仍然存在于以上变体中的实验。

以上描述的MVA的A3L基因产物(也称为P4b蛋白)为三种主要核心蛋白之一，并且在球形的非感染性未成熟病毒粒子(IV)的成熟期间由I7L编码的病毒蛋白酶加工至细胞内成熟病毒粒子(IMV)。MVA的A3L基因产物在非常早的步骤中促进病毒粒子形态发生，以允许在向感染性IMV的转变中的正确凝聚和膜重排。此外，以上描述的MVA的A34R基因产物使细胞外包膜病毒(EEV)的外膜不稳定，从而对病毒传播和细胞外空间的感染活性极为重要。EEV已进化为允许病毒传播至远处位点的媒介物。EEV的另外的膜无法介导与靶细胞融合，并且必须被破坏以释放实际的病毒感染单位IMV。另外，MVA的A34R基因产物调控细胞相关包膜病毒(CEV)与生产细胞分离的速率。此外，与A3L基因产物一样，MVA的A9L基因产物参与MVA成熟的早期步骤。它是IMV核心正确凝聚的重要因素。另外，MVA的L3L基因产物对于紧接着病毒进入宿主细胞后的非常早期的步骤是必需的。L3L是病毒颗粒的松散包装组分，并且似乎是允许新生mRNA离开病毒核心并出现在新感染的宿主细胞的细胞质中的事件的原因。

所述MVA相关病毒优选为分离的MVA相关病毒。可进一步对分离的MVA病毒进行纯化。从而，所述MVA相关病毒更优选为纯化的MVA相关病毒。

所述MVA相关病毒优选进一步包含异源性核酸序列。所述异源性核酸序列的表达可处于MVA病毒启动子的转录控制下。将所述异源性核酸序列***所述MVA相关病毒的核酸序列中。在本发明的优选实施方式中，所述异源性核酸序列被***所述MVA相关病毒核酸序列/基因组的非必需区域中。在本发明更优选的实施方式中，将所述异源性核酸序列***所述病毒基因组DNA/基因组的天然存在的缺失位点(例如缺失位点III)。如何将异源性核酸序列***所述MVA相关病毒基因组中的方法是本领域技术人员已知的。

所述异源性核酸序列更优选选自编码以下的序列：

(i)抗原(特别是抗原表位)；

(ii)诊断化合物；以及

(iii)治疗化合物。

抗原或表位可用作疫苗，以诱导针对所述抗原或表位的免疫应答。与所述病毒异源的此类抗原的实例覆盖例如其它病毒(例如流感病毒、肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或丝状病毒)的蛋白质或与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白质(如Her2/neu或MUC-1)。与所述病毒异源的此类表位的实例覆盖例如来自衍生自其它病毒(例如流感病毒、肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或丝状病毒)的蛋白质的表位或衍生自与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白质的表位(如MUC-1或Her2/neu的细胞外肽)。

所述抗原也可为疫苗抗原，例如衍生自病毒、真菌、真核病原体或细菌病原体或者衍生自肿瘤的疫苗抗原。

所述治疗化合物可为具有治疗效果的任何化合物。例如，所述治疗化合物可为影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的化合物；能够引发生物作用(如免疫应答)的化合物；或可在一个或多个生物过程中起任何其它作用的化合物。特别地，所述化合物可为抗微生物化合物、抗病毒化合物、抗真菌化合物、免疫阻遏化合物、生长因子、酶、抗炎化合物或抗过敏化合物。所述治疗化合物也可为反义核酸。

所述诊断化合物可为具有诊断效果的任何化合物。例如，所述诊断化合物可为标记/报告蛋白(如抗体、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、萤光素酶)或赋予抗生素抗性的蛋白质(如针对氨苄青霉素的bla(β-内酰胺酶)或针对新霉素或G418的npt(新霉素磷酸转移酶))。所述标记/报告蛋白可用于鉴定或分离病毒，例如通过使用杂交技术、荧光显微术或ELISA测定。另外，包含在病毒中的赋予抗生素抗性的蛋白质向被感染细胞赋予了针对抗生素选择的抗性。

如上所述，所述MVA相关病毒为高度减毒病毒。

在本发明的一个实施方式中，所述MVA相关病毒能够在禽类细胞中进行生产性复制。所述禽类细胞优选为鸡细胞、鹌鹑细胞、鹅细胞或鸭细胞(例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡细胞、鹌鹑细胞、鹅细胞或鸭细胞(如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞))可为原代细胞(或来自原代细胞培养的细胞)、次生细胞(或来自次生细胞培养的细胞)或永生化细胞(或来自细胞系的细胞)。

在本发明的另一实施方式中，所述MVA相关病毒不能在哺乳动物细胞中进行生产性复制，其中，所述哺乳动物细胞不是幼仓鼠肾(BHK)细胞、果蝠R05T细胞、果蝠R05R细胞或果蝠R06E细胞。R05T、R05R和R06E细胞为通过来自埃及果蝠(Egyptian rousette)的原代细胞的永生化获得的细胞。这些是容许MVA的极少数哺乳动物细胞系之一(Jordan等，2009，Virus Res 145，54-62)。在本发明的优选实施方式中，所述MVA病毒不能在灵长类动物细胞(更优选人细胞)中进行生产性复制。

根据本发明的MVA病毒可包含编码具有根据SEQ ID NO:13的氨基酸修饰前的氨基酸序列的L3L基因产物、具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸修饰前的氨基酸序列的A3L基因产物和/或具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸修饰前的氨基酸序列的A34R基因产物的核酸序列。所述核酸序列可进一步编码具有根据SEQ ID NO:3的氨基酸修饰前的氨基酸序列的A9L基因产物。

V110A L3L基因产物突变体具有根据SEQ ID NO:14的序列，H639Y A3L基因产物突变体具有根据SEQ ID NO:4的序列，D86Y A34R基因产物突变体具有根据SEQ ID NO:5的序列和/或K75E A9L基因产物突变体具有根据SEQ ID NO:6的序列。

此外，相应的L3L基因可具有根据SEQ ID NO:15的突变前的核酸序列，A3L基因可具有根据SEQ ID NO:7的突变前的核酸序列，相应的A34R基因可具有根据SEQ ID NO:8的突变前的核酸序列和/或相应的A9L基因可具有根据SEQ ID NO:9的突变前的核酸序列。

此外，突变的L3L基因可具有根据SEQ ID NO:16的核酸序列，突变的A3L基因可具有根据SEQ ID NO:10的核酸序列，突变的A34R基因可具有根据SEQ ID NO:11的核酸序列和/或突变的A9L基因可具有根据SEQ ID NO:12的核酸序列。

另外，(结构上)不同于所述MVA相关病毒的MVA病毒可包含根据登录号AY603355(版本AY603355.1和GI：47088326)的(突变/重排前的)核酸序列。

在第二方面，本发明涉及根据第一方面的MVA相关病毒的基因组。

在第三方面，本发明涉及包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组的细胞。也可将包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组的细胞称为宿主细胞。

所述细胞可为用于培养根据第一方面的MVA相关病毒。所述细胞可为根据第一方面的MVA相关病毒能够在其中复制的任何细胞。所述细胞优选不是灵长类动物细胞(特别是人细胞)。所述细胞进一步优选为禽类细胞。所述禽类细胞优选为鸡细胞、鹌鹑细胞、鹅细胞或鸭细胞(例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡细胞、鹌鹑细胞、鹅细胞或鸭细胞(如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞))可为原代细胞(或来自原代细胞培养的细胞)、次生细胞(或来自次生细胞培养的细胞)或永生化细胞(或来自细胞系的细胞)。在本发明的优选实施方式中，所述细胞来自CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系衍生自设计用于疫苗生产的永生化番鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27,748-756)。CR.pIX细胞系进一步将编码腺病毒pIX蛋白的基因稳定地整合至其基因组中并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维细胞(CEF)。所述细胞为原代细胞。所述细胞优选为分离的细胞。

所述细胞可用根据第一方面的MVA相关病毒感染或用根据第二方面的基因组转染。如何感染或转染细胞的技术是本领域技术人员已知的。

细胞进一步优选为非贴壁/悬浮细胞。通常，细胞可在悬浮或贴壁培养中生长。一些细胞天然生活于悬浮液中而不附着至表面，如存在于血流中的细胞(例如造血细胞)。贴壁细胞(例如原代细胞)需要表面(如组织培养塑料载体或微载体)，所述表面可包被有细胞外基质组分，以增加贴壁性质，并提供生长和分化所需的其它信号。

在本发明的优选实施方式中，非贴壁/悬浮细胞在无血清条件下生长。

在第四方面，本发明涉及用于培养根据第一方面的MVA相关病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供根据第三方面的细胞；

(ii)培养所述细胞；以及

(iii)分离所述MVA相关病毒。

根据第三方面的细胞包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组。

所述细胞可在步骤(ii)中在细胞增殖培养基中并随后在病毒生产培养基中培养，或所述细胞可在步骤(ii)中(仅)在细胞增殖培养基中培养。所述细胞优选在步骤(ii)中(仅)在细胞增殖培养基中培养。单一培养基的使用具有促进病毒培养工艺(特别是工业病毒培养工艺)的优点。例如，它促进了生产所述MVA相关病毒的生物反应器的操作和安排。所述细胞增殖培养基优选是无血清的。无血清培养基特别是全无动物血清。相反，细胞在全无任何动物来源成分的培养基中生长，并且优选在无生物成分的任何复杂混合物的培养基(所谓限定化学成分培养基)中生长。所述细胞增殖培养基进一步优选具有低蛋白质含量和/或低盐含量。

所述细胞优选在步骤(ii)中在搅拌培养或生物反应器中培养。

在步骤(iii)中，优选从无细胞上清液和/或细胞裂解物中分离所述MVA相关病毒。可根据本领域技术人员容易获得的标准程序进行步骤(iii)中所述MVA相关病毒的分离。优选从无细胞上清液中分离所述MVA相关病毒。这有利于病毒分离工艺，特别是工业病毒分离工艺。这反过来降低了病毒生产的成本。例如，不再需要用于病毒分离的细胞裂解。以此方式可减少细胞物质(特别是细胞DNA)对病毒分离物的污染。因此可更容易地获得世界卫生组织对病毒制剂的DNA限制值。

各种病毒分离程序是本领域已知的。根据本发明有用的分离程序不干扰待分离的病毒。例如，应避免长时间暴露于叶轮剪切力和分离期间发生的其它因素。优选通过经由离心、沉降(sedimentation)和/或过滤将病毒从细胞中分离来实现步骤(iii)中的分离。本领域技术人员能够容易地适应/调整适当的分离参数(例如使用离心分离时的加速力/G力和/或时间，使用过滤分离时的过滤器尺寸和/或使用沉降分离时的沉降时间)，以分离在所述细胞中培养的病毒。

在第五方面，本发明涉及用于生产根据第一方面的MVA相关病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用MVA病毒感染细胞；

(b)培养所述细胞；

(c)分离所述MVA病毒；以及

(d)用步骤(c)中分离的所述MVA病毒重复步骤(a)至步骤(c)，直至检测到包含以下特征中的一个或多个的MVA相关病毒：

(ii)两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列；

(iii)没有包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列；

(iv)没有缺失位点I；

(v)两个缺失位点IV；

(vi)没有选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；

(viii)编码L3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

可重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含根据(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)或(viii)的特征的MVA相关病毒。也可重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含根据以下的特征的MVA相关病毒：(ii)和(iii)；(ii)、(iii)和(viii)；(ii)和(iv)；(ii)、(iv)和(vi)；(ii)、(iv)和(viii)；(ii)、(iv)、(vi)和(viii)；(iii)和(v)；(iii)、(v)和(vii)；(iii)、(v)和(viii)；(iii)、(v)、(vii)和(viii)；(iv)和(v)；(iv)、(v)和(viii)；(vi)和(vii)；或(vi)、(vii)和(viii)。

在一个实施方式中，重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到如下MVA相关病毒：所述MVA相关病毒包含对应于包含右反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域的核酸序列，而非(代替)包含左反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的核酸序列(特征(i))。

优选重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到如下MVA相关病毒：所述MVA相关病毒包含对应于包含右反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的MVA区域的核酸序列，而非(代替)包含左反向末端重复(ITR)并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的MVA的核酸序列。

也可重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含如下核酸序列的MVA相关病毒：所述核酸序列包含右反向末端重复(ITR)并且延伸至所述右ITR旁的独特序列但不包含缺失位点III，而非(代替)包含左反向末端重复(ITR)并且延伸至所述左ITR旁的独特序列但不包含缺失位点V的核酸序列。在此方面，所述独特序列为不包含互补区域的序列。所述独特序列可为未转录的和未翻译的，可含有假基因(已失去其功能的先前的编码区域)或可包含正在表达的基因。

替代地，可重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到如下MVA相关病毒：所述MVA相关病毒包含以右反向末端重复(ITR)开始并且包含右ITR、并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的核酸序列，而非(代替)以左反向末端重复(iii)开始并且包含左iii、并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的核酸序列。

在一个实施方式中，重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到如下MVA相关病毒：所述MVA相关病毒包含两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列(特征(ii))。

在一个实施方式中，重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到不包含如下核酸序列的MVA相关病毒：所述核酸序列包含缺失位点I和所述左ITR(特征(iii))。

在一个实施方式中，重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含编码L3L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。在一个替代实施方式中，重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

优选重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含进一步编码A9L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

应当注意，编码上述基因产物的核酸序列包含导致每种所述基因产物的至少一个氨基酸修饰(例如1个、2个、3个或4个氨基酸序列修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个或4个突变)。所述氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个或4个氨基酸修饰)可为氨基酸缺失(例如1个、2个、3个或4个氨基酸缺失)、氨基酸***(例如1个、2个、3个或4个氨基酸***)、氨基酸添加(例如1个、2个、3个或4个氨基酸添加)和/或氨基酸替换(例如1个、2个、3个或4个氨基酸替换)。

在本发明的第一方面的背景下描述了进一步优选的实施方式。

更优选地，

(i)检测到包含编码A3L基因产物和A9L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A3L基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(ii)检测到包含编码A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(iii)检测到包含编码A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述A3L基因产物、所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(iv)检测到包含编码L3L基因产物和A3L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述L3L基因产物和所述A3L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；

(v)检测到包含编码L3L基因产物和A34R基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述L3L基因产物和所述A34R基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个或3个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个或3个突变)；或

(vi)检测到包含编码L3L基因产物、A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物(即所述3L3基因产物、所述A3L基因产物、所述A34R基因产物和所述A9L基因产物)的至少一个氨基酸序列修饰(例如1个、2个、3个或4个氨基酸修饰)的至少一个突变(例如1个、2个、3个或4个突变)。

关于氨基酸修饰的优选实施方式，参考本发明的第一方面。

步骤(a)中的MVA病毒可包含根据登录号U94848(版本U94848.1以及GI:2772662)的核酸序列。

优选地，步骤(a)至步骤(c)重复至少2次、优选至少7次、更优选至少14次、最优选至少20次，例如至少2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次。

进一步优选将所述细胞在病毒生产培养基中进行培养。所述病毒可在步骤(b)中在病毒生产培养基中培养1至10天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。

步骤(a)中的细胞可为MVA病毒能够在其中复制的任何细胞。所述细胞优选不是灵长类动物细胞(特别是人细胞)。所述细胞进一步优选为禽类细胞。所述禽类细胞优选为鸡细胞、鹌鹑细胞、鹅细胞或鸭细胞(例如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞)。所述禽类细胞(例如鸡细胞、鹌鹑细胞、鹅细胞或鸭细胞(如鸭体节细胞或鸭视网膜细胞))可为原代细胞(或来自原代细胞培养的细胞)、次生细胞(或来自次生细胞培养的细胞)或永生化细胞(或来自细胞系的细胞)。在本发明的优选实施方式中，所述细胞来自CR或CR.pIX细胞系。CR和CR.pIX细胞系衍生自永生化番鸭视网膜细胞(Jordan等，2009，Vaccine 27,748-756)。CR.pIX细胞系进一步将编码腺病毒pIX蛋白的基因稳定地整合到其基因组中并表达所述基因。在本发明的其它优选实施方式中，所述细胞为鸡胚成纤维细胞(CEF)。所述细胞为原代细胞。

如上所述，根据第一方面的MVA相关病毒为高度宿主限制性的，从而为高度减毒的。因此，它对于宽范围的接受者的治疗是理想的。所述接受者优选为灵长类动物，更优选为人。

可以通过本领域技术人员公知的各种方式配制和/或给予本发明所考虑的药物组合物。本发明的药物组合物优选处于液体形式，例如处于溶液(如注射溶液)形式。可将所述溶液进行注射，例如肌肉内注射或肠胃外注射。本领域技术人员能够通过已知方式对所述药物组合物的给药模式、剂量和给药次数进行优化。

在第七方面，本发明涉及一种疫苗，所述疫苗包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组。

如上所述，根据第一方面的MVA相关病毒为高度宿主限制性的，从而为高度减毒的。因此，它为对宽范围的接受者进行治疗的理想疫苗。

所述接受者优选为灵长类动物，更优选为人。在此方面，应注意所述MVA相关病毒本身可为疫苗。它赋予针对痘病的保护。然而，所述病毒或所述基因组可进一步包含异源性核酸序列，例如编码抗原(特别是抗原表位)的序列(可引发接受者中针对所述异源性核酸序列的保护性免疫力(特别是额外的保护性免疫力))。此类抗原的实例覆盖例如其它病毒(如流感病毒、肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或丝状病毒)的蛋白质或与肿瘤和癌症的发展相关的蛋白质(如Her2/neu或MUC-1)。此类表位的实例覆盖例如来自衍生自其它病毒(例如流感病毒、肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒或丝状病毒)的蛋白质的表位或衍生自与肿瘤和癌症发展相关的蛋白质的表位(如MUC-1或Her2/neu的细胞外肽)。也可将包含异源性核酸序列的MVA相关病毒称为重组MVA相关病毒。在将疫苗给予至接受者体内后，抗原(特别是表位)表达并被呈递给免疫系统，可诱导针对所述抗原(特别是表位)的特异性免疫应答。所述接受者由此针对所述抗原(特别是表位)进行了免疫。

包含根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组的疫苗优选为痘病毒疫苗、流感病毒疫苗、肝炎病毒(如丙型肝炎病毒)疫苗、人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗、黄病毒疫苗、副粘病毒疫苗、汉坦病毒疫苗和/或丝状病毒疫苗。它还可用于针对乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌或***癌的疫苗接种。

可以通过本领域技术人员公知的各种方式配制和给予本发明所考虑的疫苗。本发明的疫苗优选处于液体形式，例如处于溶液(如注射溶液)形式。可将所述溶液进行注射，例如肌肉内注射或肠胃外注射。本领域技术人员能够通过已知方式对所述疫苗的给药模式、剂量和给药次数进行优化。为配制或制备疫苗，将根据第一方面的MVA病毒(特别是重组MVA病毒)转化为生理学上可接受的形式。这可基于在用于针对痘病的疫苗接种的痘病毒疫苗的制备中的经验来完成(如Stickl等，1974，Dtsch Med Wochenschr 99,2386-2392所述)。所述疫苗对于在免疫受损的接受者(如包括人在内的灵长类动物)中诱导免疫应答是特别有用的。“免疫受损的”描述了接受者的免疫系统的状态，其仅显示不完全的免疫应答或在针对感染因子的防御方面具有降低的效率。

在第八方面，本发明涉及用于医学用途的根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组。根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组优选用于疫苗接种和/或治疗中的用途。特别地，用根据第一方面的MVA相关病毒或用根据第二方面的基因组对接受者进行激发以诱导特异性免疫力。接受者优选为灵长类动物，更优选为人。所述灵长类动物(如人)可为免疫受损的。在此方面，应注意所述MVA相关病毒本身可为疫苗。它赋予针对痘病的保护。然而，所述病毒或所述基因组可进一步包含异源性核酸序列，例如编码抗原(特别是抗原表位)的序列(可引发接受者中针对所述异源性核酸序列的保护性免疫力(特别是额外的保护性免疫力))。本发明的第一方面和第七方面中描述了优选的抗原(特别是表位)。所述MVA相关病毒或基因组优选用于针对痘病毒、流感病毒、肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、人免疫缺陷病毒(HIV)、黄病毒、副粘病毒、汉坦病毒、丝状病毒、肿瘤和/或癌症(如乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌或***癌)的疫苗接种。

替代地或另外地，用根据第一方面的MVA相关病毒或用根据第二方面的基因组对所述接受者进行激发以引发治疗效果。如上所述，包含在所述病毒或基因组中的异源性序列可编码治疗化合物。例如，所述治疗化合物可为影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的化合物；能够引发生物作用(如免疫应答)的化合物；或可在一个或多个生物过程中起任何其它作用的化合物。特别地，所述化合物可为抗微生物化合物、抗病毒化合物、抗真菌化合物、免疫阻遏化合物、生长因子、酶、抗炎化合物或抗过敏化合物。所述治疗化合物也可为反义核酸。

本领域技术人员能够通过已知方式对疫苗接种模式、疫苗接种剂量和疫苗接种次数进行优化。可以通过本领域技术人员公知的各种方式配制和给予所述疫苗。所述疫苗优选以液体形式给予。优选注射(例如肌肉内注射或肠胃外注射)所述疫苗。优选将根据第一方面的MVA相关病毒或根据第二方面的基因组以药学上有效的量给予所述接受者。当MVA相关病毒或基因组的量在所述接受者中引发免疫应答时，其在特定的给药途径中是有效的。

将本发明总结如下：

1.一种改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒，所述改良安卡拉痘苗(MVA)相关病毒包含以下特征中的一个或多个：

(ii)两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列；

(iii)没有包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列；

(iv)没有缺失位点I；

(v)两个缺失位点IV；

(vi)没有选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；

(viii)编码L3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

2.如项1所述的MVA相关病毒，其中，所述包含右ITR并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域包含缺失位点IV。

3.如项1或2所述的MVA相关病毒，其中，所述包含右ITR并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域包含选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框。

4.如项1至3中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述包含左ITR并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的区域包含缺失位点I。

5.如项1至4中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述包含左ITR并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的区域包含选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的至少一个开放阅读框。

6.如项1至5中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列进一步包含选自于由A57R、B1R、B2R、B3R、B4R、B5R、B6R、B7R、B8R、B9R、B10R、B11R、B12R、B15R、B16R、B17L、B18R、B19R和B22R所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框。

7.如项1至6中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列进一步包含选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框。

8.如项1至7中任一项所述的MVA相关病毒，其中，

(i)所述包含右ITR并且延伸至缺失位点III但不包含缺失位点III的区域具有根据SEQ ID NO:37或Genbank登录号KY633487(优选从核苷酸位置162221至190549的范围或与其对应的核苷酸位置)的核酸序列，或为与所述核酸序列至少95％相同的变体；

(ii)所述包含左ITR并且延伸至缺失位点V但不包含缺失位点V的区域具有根据SEQ ID NO:37或Genbank登录号KY633487(优选从核苷酸位置1至31261的范围或与其对应的核苷酸位置)的核酸序列，或为与所述核酸序列至少95％相同的变体；和/或

(iii)所述包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列具有根据SEQ ID NO:37或Genbank登录号KY633487(优选从核苷酸位置179272至190549的范围或与其对应的核苷酸位置)的核酸序列，或为与所述核酸序列至少95％相同的变体。

9.如项1至8中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述病毒包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

10.如项9所述的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列进一步编码A9L基因产物，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

11.如项10所述的MVA相关病毒，其中，

(i)所述病毒包含编码A3L基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变；或

(ii)所述病毒包含编码A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

12.如项10所述的MVA相关病毒，其中，所述病毒包含编码A3L基因产物、A34R基因产物和A9L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

13.如项1至12中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述病毒进一步包含异源性核酸序列。

14.如项13所述的MVA相关病毒，其中，所述异源性核酸序列选自编码以下的序列：

(i)抗原(特别是抗原表位)；

(i)诊断化合物；以及

(iii)治疗化合物。

15.如项1至14中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述病毒能够在禽类细胞中进行生产性复制。

16.如项1至15中任一项所述的MVA相关病毒，其中，所述病毒不能在灵长类动物细胞(更优选人细胞)中进行生产性复制。

17.根据项1至16中任一项所述的MVA相关病毒的基因组。

18.一种细胞，所述细胞包含根据项1至16中任一项所述的MVA相关病毒或根据项17所述的基因组。

19.如项18所述的细胞，其中，所述细胞为非贴壁/悬浮细胞。

20.如项18或19所述的细胞，其中，所述细胞为禽类细胞。

21.用于培养根据项1至16中任一项所述的MVA相关病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供根据项18至20中任一项所述的细胞；

(b)培养所述细胞；以及

(c)分离所述MVA相关病毒。

22.如项21所述的方法，其中，所述细胞在细胞增殖培养基中并随后在病毒生产培养基中培养，或所述细胞仅在细胞增殖培养基中培养。

23.如项21或22所述的方法，其中，从无细胞上清液和/或细胞裂解物中分离所述MVA相关病毒。

24.用于生产根据项1至16中任一项所述的MVA相关病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用MVA病毒感染细胞；

(b)培养所述细胞；

(c)分离所述MVA病毒；以及

(d)用步骤(c)中分离的所述MVA病毒重复步骤(a)至步骤(c)，直至检测到包含以下特征中的一个或多个的MVA相关病毒：

(ii)两个拷贝的包含缺失位点IV和所述右ITR的核酸序列；

(iii)没有包含缺失位点I和所述左ITR的核酸序列；

(iv)没有缺失位点I；

(v)两个缺失位点IV；

(vi)没有选自于由C11R、C10L和D7L所组成的组中的至少一种基因产物的开放阅读框；

(viii)编码L3L基因产物的核酸序列，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

25.如项24所述的方法，其中，重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含编码A3L基因产物和/或A34R基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

26.如项25所述的方法，其中，重复步骤(a)至步骤(c)直至检测到包含进一步编码A9L基因产物的核酸序列的MVA相关病毒，其中，所述核酸序列包含导致所述基因产物的氨基酸序列修饰的至少一个突变。

27.如项24至26中任一项所述的方法，其中，在病毒生产培养基中培养所述细胞。

28.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据项1至16中任一项所述的MVA相关病毒或根据项17所述的基因组，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。

29.一种疫苗，所述疫苗包含根据项1至16中任一项所述的MVA相关病毒或根据项17所述的基因组。

30.用于医学用途的根据项1至16中任一项所述的MVA相关病毒或根据项17所述的基因组。

31.用于疫苗接种用途的根据项30所述的MVA相关病毒或基因组。

在不脱离本发明范围的情况下，本发明的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方式描述了本发明，应理解的是，要求保护的本发明不应不适当地限于此类具体实施方式。实际上，本发明旨在覆盖在相关领域中对本领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改。

以下附图和实施例对本发明而言仅为说明性的，并且不应解释为以任何方式限制通过所附权利要求所指出的本发明的范围。

附图说明

图1：将CR相关突变单独地或以各种组合与GFP一起***野生型病毒的骨架中，以允许噬斑(plaques)的可视化而无需固定和免疫染色。以0.01的MOI进行所有感染，并在48hPI显示噬斑表型。WT.GFP为表达GFP的野生型MVA，WT.A34CR、WT.L3CR以及WT.A3A9A34CR表示在基因A3L、A9L和A34R中含有各自的CR相关突变H639Y、K75E和D86Y的WT.GFP病毒，CR19.GFP为表达GFP的MVA-CR19。

图2：缺失位点I在MVA-CR19中丢失，但在野生型MVA(CR细胞中的第5代，MVA-CR5)或通过埃及果蝠的贴壁细胞的连续传代获得的MVA(MVA-R18(Jordan等，2013a))中未丢失。

图3：MVA-CR19的预计的(proposed)重组。(a)具有反向末端重复(ITR)的野生型基因组以及跨越6个缺失位点(罗马数字)的预期扩增产物的示意图。以“C-”开头的条表示先前(Jordan等，2013a)序列分析中获得的重叠群(contigs)。通过粗体线示出了除ITR外的重组区域。更详细的左ITR(b)和右ITR(c)。空心箭头表示开放阅读框。(d)重组后预计的MVA-CR19的左ITR。(e)重组位点的序列色谱图，参考GenBank U94848编号。(a-d)深灰色：来源于基因组右侧的序列；浅灰色：来源于基因组左侧的序列。尖角矩形表示ITR，通过粗体线示出了除ITR外的重组区域。深灰色和黑色的相反的实心箭头表示链方向，并标记了重组位点。

图4：对如上图所示的ITR重排的确认。(a)来源于GenBank序列U94848和MVA-CR19的左ITR的PCR扩增产物的预计的结构。示出了基因(空心箭头)、缺失位点I和IV(实心方框)、ITR(灰色和深灰色尖角矩形)、重组位点(深灰色和黑色粗箭头)以及用于确认左ITR的预计的结构的限制酶的靶位点。(b)(a)中示出的长PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。对于野生型，用BclI切割的预期大小为3007bp、2518bp、1992bp、1172bp和671bp，用NruI切割的预期大小为7998bp和1362bp，用ApaLI切割的预期大小为8464bp和896bp；对于MVA-CR19，用BclI切割的预期大小为13634bp、1890bp、1498bp、1269bp、984bp、886bp、671bp和480bp，用NruI切割的预期大小为11257bp、8693bp和1362bp，用ApaLI切割的预期大小为9572bp、5646bp、4706bp、896bp和492bp。

图5：CR.pIX培养物中MVA基因型的稳定性。(a)将经噬斑纯化的在缺失位点III中含有GFP表达盒的重组野生型以及CR19分离株在CR.pIX悬浮培养物中进行20次传代。注意GFP盒引起的缺失位点III扩增产物的预期大小移位以及CR19衍生物中缺失位点I信号的缺乏。(b)在传代区间中，在(a)中纯化的病毒DNA在两种分离株的A34R基因中也显示出限制性片段长度多态性(RFLP)的稳定模式。(c)在CR19的传代中发现代替CR19衍生物中的缺失位点I的RS469扩增产物的存在，但在野生型的传代中未发现。以与(b)中相同的顺序施加样品。(d)在野生型骨架中携带CR基因型的点突变或在CR19衍生物中携带GFP和mCherry(RED)双重表达盒的重组病毒中的RFLP以及缺失位点的稳定模式。(e)通过用针对痘苗病毒蛋白的免疫染色对PFU进行的测定或经由对绿色荧光信号或红色荧光信号的测定，对在指定传代水平下用MVA-CR19.GFP.RED双表达载体获得的感染滴度进行测定。图中示出了感染单位的比例。FFU相对于PFU的减少将表明表达盒的丧失。因为mCherry的一些激发也在GFP荧光条件下发生，在双表达构建体中，基于GFP的滴定倾向于高于基于mCherry的滴定。所有比例的平均值为1.00±0.09，在99％置信水平下，GFP-FFU:PFU和mCherry-FFU:PFU的比例的平均值之间无显著差异(配对t检验)。

图6：L3突变的研究。(a)MVA-CR19中由L3L中的突变引起的限制性片段长度多态性。预期717-bp扩增子对于MVA-CR19产生649bp和68bp的HphI片段，对于野生型产生380bp、269bp和68bp的HphI片段。(b-d)将两种独立的MVA-WT.L3LCR.GFP制剂用于这些实验。(b)指定的重组病毒在单细胞悬浮培养中的复制动力学。虚线示出了在常规方法中(其诱导了聚集体)指定病毒的复制。(c、d)用表达GFP的rMVA感染贴壁CR.pIX细胞。描述了MVA-WT.GFP和MVA-CR19.GFP的三个平行试验(triplicates)的平均值和标准偏差以及MVA-WT.L3CR.GFP的六个值(两次三个平行试验)的平均值和标准偏差。该实验中用于感染的MVA制剂的log₁₀FFU/mL为8.5(MVA-WT.GFP)、8.3和8.8(MVA-WT.L3CR.GFP)以及9.8(MVA-CR19.GFP)。(**)表示在双尾独立t检验中CR19和野生型重组病毒的相应40h时间点之间的显著差异；在L3L突变体和野生型之间的比较中差异不显著。

实施例

1.材料和方法

1.1细胞和病毒

先前已描述了来自番鸭的CR.pIX细胞(Jordan等，2009b)和MVA-CR19(Jordan等，2013a)。将CR.pIX细胞以贴壁形式保持在补充有5％牛血清的DMEM:F12培养基(γ-照射，Gibco 26140-079)中，或以悬浮培养保持在补充有10ng/mL LONG-R3IGF(Sigma，USA)的CD-U4培养基(GE Healthcare#G3321或Biochrom#F9185)中。两种培养基还补充有2mMGlutaMAX I(Life Technology，USA)。如先前所描述的，MVA的感染和繁殖在CD-U4和CD-VP4(Merck-Millipore#F9127)的1:1混合物中进行(通常以2×10⁶个细胞/mL、0.01至0.1的MOI)，并在感染后48h或72h收获(Jordan等，2011)。将悬浮培养物以5cm的振幅和180min-1的旋转速度保持在旋转平台上的振动培养箱(HT Multitron Cell，Infors AG，Switzerland)中。将CO2气氛设定为8％，将温度设定为37℃。所有培养容器、摇管(Tubespin50，TPP Techno Plastic Products AG，Switzerland)或带挡板的摇瓶(Corning，USA)均配备有0.2μm过滤盖以允许气体交换。悬浮培养体积保持在容器体积的20％-40％。

如先前描述地(Jordan等，2013a)在Vero细胞上以PFU/mL(噬斑形成单位)或FFU/mL(荧光形成单位)测定MVA的感染滴度。通过免疫染色或在适用的情况下借助于缺失位点III中的荧光报告分子在非容许指示细胞(non-permissive indicator cells)中将病毒可视化。

1.2重组MVA的生成

通过改进公开的方法(Kremer等，2012)，在贴壁CR.pIX细胞中通过同源重组生成重组MVA。简而言之，在6孔板的每孔中接种1×10⁶个CR.pIX细胞。第二天，以0.01的MOI用接收MVA(receiving MVA)感染培养单层，并用2.0μg穿梭质粒进行转染以***至缺失位点III中。

利用合成片段(其还包含限制酶的沉默诊断位点(silent diagnostic sites)以确认成功的***和维持)通过同源重组来引入点突变(表1)。通过在每侧由600bp至1000bp的侧翼框住(framing)感兴趣的区域来促进重组事件。接收病毒通常在缺失位点III内表达报告基因。用第二穿梭质粒进行同时(concurrent)重组，该第二穿梭质粒设计用于将该预先存在的报告基因更换为不同的报告基因(例如蓝色荧光相对于绿色或红色)以进一步促进重组病毒的回收。与主穿梭质粒相比，以较低的摩尔比转染该标记质粒(1.8μg具有点突变的穿梭质粒和0.2μg报告穿梭质粒)。

在感染后90min，根据制造商的说明用effectene(Qiagen，Germany)进行转染，并在转染后24小时替换培养基。在48h至72h后收获经感染/转染的培养物，超声处理，并用于以PBS中1000至10000倍的稀释度感染6孔板中的细胞单层。在4h至16h后，将该下一代感染的培养基更换为含有1％甲基纤维素的培养基。通常在另外24h至48h后挑选适当荧光表型的噬斑，并使用QuickExtract DNA Extraction Solution 1.0(Epicentre，USA)从各个噬斑的等分试样中将总DNA分离。用通过PCR分析的候选重组病毒制剂开始另一轮噬斑纯化。使用允许对闭合样品盖进行操作以避免交叉污染的Vial Tweeter(Hielscher，Germany)(设定为20s、100％循环和90％振幅)通过对细胞收获物进行超声处理来获得感染材料。在3至8轮噬斑纯化内具有亲本基因型或不完全重组的病毒是检测不到的。

用CD-U4和CD-VP4的1:1混合物在5mL体积的CR.pIX悬浮培养物中进行病毒传代以测定基因组稳定性。细胞密度为2×10⁶个细胞/mL以及MOI为0.01(在盲传代中，在前一次传代中假定滴度为10⁸PFU/mL)。感染后48h或72h，对经感染的培养物进行超声处理以收获病毒。

1.3rMVA的PCR分析

将80μL完全细胞裂解物与20μL QuickExtract DNA Extraction Solution1.0(Epicentre，USA)混合，加热至65℃10分钟并加热至98℃5分钟。用0.15μL Taq聚合酶(Qiagen，Germany)、200nM每种引物以及125μM每种核苷酸以25μL的终体积对4μL该制剂进行PCR。从文献(Kremer等，2012)获得跨越病毒基因组的缺失位点I至VI的引物对的序列。野生型病毒缺失位点I至VI的扩增产物的预期大小为291bp、354bp、447bp、502bp、603bp和702bp(Kremer等，2012)，MVA-CR19.GFP的缺失位点III的扩增产物的预期大小为1285bp。以94℃80s来开始热循环；然后进行以下的35个循环：94℃20s，55℃20s和72℃90s；并在72℃下终止5分钟。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增子进行分离。

1.4穿梭质粒的克隆

通过将左侧翼和右侧翼***pEGFP-N1(Clontech，USA)逐步对用于缺失位点III的穿梭质粒进行克隆。分别用引物“LeftF”AGG ACA TGT-TTG GTG GTC GCC ATG GAT GGT(SEQID NO:17)和“LeftR”TAC CGC TAG C-T ACC AGC CAC CGA AAG AG(SEQ ID NO:18)；以及用引物“RightF”TGG GCG GCC GC-TTT GGA AAG TTT TAT AGG(SEQ ID NO:19)和“RightR”TGGCAC GTA GTG-CCG GAG TCT CGT CTG TTG(SEQ ID NO:20)从野生型MVA的基因组DNA扩增侧翼。用NheI(本研究中使用的所有限制酶来自New England Biolabs或Roche)和PciI切割左侧翼，用DraIII和NotI切割右侧翼，以相继***至pEGFP-N1的相同位点，同时维持EGFP开放阅读框。人工EL启动子(Chakrabarti等，1997)是通过使在编码链上具有序列“PromEL”ATCTGC TAG CAC GTG GAC TAG TAA AAA TTG AAA TTT TAT TTT TTT TTT TTG GAA TAT AAATAA GAT CTT ACC(SEQ ID NO:21)的两个互补的72bp寡核苷酸(TIP MolBiol，Germany)退火而生成的。在95℃下变性2分钟，然后以每秒-0.1℃的速率坡度下降至56℃，进行退火。用BglII和NheI切割该片段，用两倍体积乙醇中的300mM乙酸钠沉淀，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，并***已含有缺失位点III侧翼的pEGFP-N1质粒的相同位点。测序证实了穿梭质粒的完整性，但揭示了EL启动子中从ttG aaa ttt至ttA aaa ttt的转换(因在rMVA中GFP表达强，其未被校正并得以维持)。在右侧翼中包含病毒转录终止子信号(T5NT(Yuen和Moss，1987))。DsRed1衍生物mCherry以针对鸭进行的密码子优化来合成(Eurofins Genomic，Germany)，相对GFP以反义方向***，并处于晚期P11启动子的控制下(Bertholet等，1985)。所得的双表达盒从EL启动子至P11启动子跨越1615bp，缺失位点III引物的扩增产物长度为2087bp。

仅利用从MVA-CR19基因组DNA扩增出的片段对用于将A34R中的点突变D86Y和L3L中的点突变V110A导入野生型MVA的穿梭质粒进行克隆。这些突变包含偶然的诊断限制酶位点(fortuitous diagnostic restriction enzyme sites)以确认成功的重组(表1)。通过用引物“A34F”AAT GCT AGC-GCG GAA TCA TCA ACA CTA CCC(SEQ ID NO:22)和“A34R”GCTCTA G-ATT GTT CCC GCA ACT ACG GTC(SEQ ID NO:23)进行1393bp的扩增来克隆A34R穿梭质粒。引物在5'末端分别含有NheI和XbaI的额外限制性位点，用于使用这些位点***pEGFP-N1(在dam(-)细菌外)。如Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen，USA)中所述，用引物“L3F”CTC TAC GGG CTA TTG TCT C(SEQ ID NO:24)和“L3R”TGA ATA CCC GTACCG ATG(SEQ ID NO:25)克隆L3L穿梭质粒，将717-bp片段克隆至pCR-Blunt II-Topo(“pTopo”)中。

通过***含有期望的点突变和沉默诊断突变(使用http://resitefinder.appspot.com/设计)的合成DNA(Eurofins Genomic)来克隆用于其它点突变(A3L中的H639Y和A9L中的K75E)的穿梭质粒。

对于用于A3L的穿梭质粒的生成，用引物“A3F”GCA GAA GAA CAC CGC TTA GG(SEQID NO:26)和“A3R”ATG GAA GCC GTG GTC AAT AG(SEQ ID NO:27)对A3L的2008bp片段进行扩增，并将其***pTopo中。用含有H639Y和沉默NcoI位点的合成DNA替换其中的从SacI至SwaI的274-bp片段。由于第一重组尝试并未包含期望的H639Y位点，必须延长该穿梭质粒的一个侧翼：使用SwaI(在MVA中)和SpeI(在pTopo中)将含有新(但沉默)的AvaI位点的479bp的额外的合成DNA附加至NcoI远端侧(NcoI-distal side)。

也含有接近期望的K75E突变的沉默诊断突变的415bp合成DNA的重组同样仅转移了诊断突变(由对噬斑纯化的病毒的测序揭示)。因此延长了侧翼并***了额外的诊断突变，从而K75E被标记框住(framed)：用引物“A9F”TTG AAA TAG CGC CAG TCC TCC(SEQ IDNO:28)和“A10R”ACT ACG GCG GCA TTA TGT TCTC(SEQ ID NO:29)从野生型MVA基因组DNA中扩增出含有A9L和邻近基因A10L的2905bp片段。将该2905bp片段克隆至pTopo中以产生pTA10L。使用pTA10L的PmeI(在载体中)至NsiI(在MVA***物中)作为新载体骨架、使用合成DNA中的SpeI至NsiI以***沉默StyI诊断标记以及使用pTA10L的NsiI至PmeI以恢复初始扩增产物，经由三片段连接将在A10L中含有诊断位点的合成DNA***。用于获得pTA10L-StyI的三片段连接对于规避载体骨架中额外的SpeI位点是必要的。使用含有K75E突变(其两侧被诊断沉默突变EcoRI和BseRI框住)的合成DNA片段将A9L侧翼***。使用合成DNA载体的A9L中的Tth111I至多克隆位点中的EcoRV、使用pTA10L中的Tth111I至PmeI以及使用pTA10L中的Tth111I至PmeI以修复载体，经由三片段连接将该片段***，以规避载体中的Tth111I位点。所得的穿梭质粒含有3620bp的MVA衍生片段。

1.5测序和RACE

如先前描述的(Jordan等，2013a)，通过聚乙二醇沉淀从100mL经感染的CR.pIX细胞(2×10⁶个细胞/mL)中分离出噬斑纯化的MVA-CR19.GFP的基因组DNA。由GATC BiotechAG(Germany)用PacBio RSII技术获得序列，并使用非强制(无引导序列)算法将其组装。

由于序列组装后保留了基因组左侧的大空位并且由于针对缺失位点的PCR表明位点I(位于MVA的左末端附近)的丧失，进行了5'-端RACE。使用Clone Manager Professional套装版本9(Sci-Ed Software，USA)设计了针对仍被基因组序列组装覆盖的5'末端区域的引物D2RII(GGC GGC ATG TGG AGT GTC TTT ATC)(SEQ ID NO:30)。该引物在100μL 1×PCR缓冲液、1×Q溶液、5U Taq和0.2U ProofStart Taq聚合酶(均为Qiagen，Germany)、0.4μM引物D2RII和0.05mM每种dNTP中在500ng病毒基因组DNA上延伸。将热循环仪的程序设为94℃10s、57℃60s和68℃3min的35个循环(开始时95℃2min并且程序结束时72℃10min)。用QIAquick PCR纯化试剂盒对该PCR反应物进行纯化，将25μL纯化产物与末端转移酶(TdT，New England Biolabs#M0315S)在终体积为50μL的1×加尾缓冲液、0.25mM CoCl2和0.1mMdCTP中孵育。在加尾反应前，在94℃下变性3分钟，然后加入0.5μL TdT并在37℃下孵育30分钟，并在70℃下终止10分钟。

接下来，如上文针对D2RII引物延伸所描述的，使用引物D2(GGT GTA TAG AGT TCACAG TAG)(SEQ ID NO:31)和通用锚定引物AAP(GCC ACG CGT CGA CTA GTA CGG Gnn GGGnnG GGn nG，其中n代表I＝肌苷，GCC ACG CGT CGA CTA GTA CGG GII GGG IIG GGI IG，I为肌苷)(SEQ ID NO:32)在100μL的终体积中进行巢式PCR，以回收5'延伸和dC加尾产物，但以59℃(而非57℃)的延伸温度延伸60秒。

将该第一巢式PCR稀释1:50，并在无Q溶液、引物GSPD2-R(GGA GGT GGC TCT CGATGA AC)(SEQ ID NO:33)和AAP的50μL的终体积中以与第一巢式PCR相同的热循环程序对其进行第二巢式PCR。用Qiagen凝胶提取试剂盒通过琼脂糖凝胶电泳对约700bp的片段进行分离和纯化，并用引物AAP和GSPD2-R对其进行测序。

在此序列上设计引物“RS469F”ACG GTC CTG TAG TAT CTG(SEQ ID NO:34)和“RS469R”CGG CAT GTG GAG TGT CTT TAT C(SEQ ID NO:35)作为用于扩增跨越新发现的重组位点(RS469)的469bp的诊断对。

用引物D2RII和“ITR-M”(CTT GCA CAT GTC TCC GAT ACG)(SEQ ID NO:36)进行用于扩增假定的MVA-CR19的左ITR的长PCR，以在MVA-CR19上获得21312bp并在野生型MVA上获得9360bp(Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.)。在GenBank序列AY603355中，ITR-M引物以正向方向结合535至553并以反向方向结合165956至165976；而引物D2RII仅以反向方向结合一次(9869至9892)。因此，以野生型MVA作为模板时可能的扩增子为9360bp和165444bp(ITR-M单引物扩增)而非21312bp。根据手册，用200ng病毒基因组DNA在50μL终体积中进行LongRange PCR(Qiagen)。热循环仪程序以93℃下3min开始；然后进行以下的10个循环：93℃10s、57℃30s和68℃15min；然后进行以下的25个循环：93℃15s、57℃30s和68℃21min，每个循环延伸20秒。根据制造商说明，用20μL终体积中的3μL PCR产物和0.5μL酶进行BclI、NruI或ApaLI的限制酶分析。

2.结果

2.1融合表型

先前观察到在悬浮培养中重复传代后，具有野生型病毒和携带MVA-CR突变的病毒的混合物的群体中向新型病毒株的显著转变(Jordan等，2013a)。如果病毒基因型复制得更快、与更高的特异性感染性相关或(如假定的)降低了其子代病毒对宿主细胞的亲和力，则可能引起此转变。MVA保持与宿主细胞相关的特性得到了很好表征(Blasco和Moss，1991；Blasco等，1993；Husain等，2007；Meiser等，2003)，一个后果是如果病毒融合装置在与相邻细胞接触的细胞的表面上的颗粒中被活化，可形成合胞体(Ward，2005)。仅在用野生型MVA感染而非用MVA-CR病毒感染的CR.pIX细胞的培养物中观察到通过融合装置的诱导而出现显著的合胞体形成(数据未显示，以及Jordan等，2013b)。

在下一步中，将MVA-CR的点突变(表1)引入野生型MVA中，以研究突变对MVA-CR表型的贡献。通过合成基因区段的同源重组，将点突变***野生型骨架中。这些区段被设计为还包含用于诊断限制酶多态性的沉默突变，以确认噬斑纯化的重组病毒为预期基因型并且未污染有亲代病毒。将GFP报告基因***缺失位点III(在合成启动子控制下)，以促进无免疫染色的活噬斑研究。用重组病毒将CR.pIX细胞系的贴壁单层感染至0.01的MOI，并在不同时间点(Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.中示出了48小时PI)拍摄荧光图像。来自含有A34RCR突变的重组病毒的GFP信号分散在大面积上，并且噬斑仅表现出可忽略的自发合胞体形成。由具有A3LCR、A9LCR和L3LCR突变的重组病毒形成的噬斑类似于由野生型病毒形成的噬斑。

从这些实验已得出如下结论：具有CR基因型的病毒具有降低的形成自发合胞体或pH诱导的合胞体的倾向。

2.2丢失缺失位点I.

可通过一组PCR来对重组MVA进行表征，所述PCR被设计为扩增6个缺失位点中的每一个(Kremer等，2012)。已用这些PCR反应来确认GFP表达盒***了通常使用的缺失位点III。作为推荐的常规的一部分，还对其它扩增片段进行了测试。令人惊讶的是，缺失位点I的预期信号在MVA-CR19衍生物中丢失，但在容许的果蝠细胞系的更早期传代或经传代18次的分离体(MVA-R18(Jordan等，2013b)；Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefundenwerden.)中未丢失。在所有测试的病毒中，所有其它缺失位点给出了适当大小的信号。

缺失位点I扩增子位于左反向末端重复的边界处，并与基因组DNA的核心区部分重叠。先前报道的MVA-CR11(MVA-CR19的祖先)的基因组DNA序列已覆盖了135kb的基因组DNA，其在缺失位点I的下游延伸至缺失位点III之外(Fehler！Verweisquelle konnte nichtgefunden werden.A，重叠群C-2412、C-131534和C-1549)(Jordan等，2013a)。基因组右端的部分ITR(包含缺失位点IV)和核心的序列不是先前报道的一部分。决定仅包含通过非引导序列组装所获得的序列。覆盖基因组DNA右端的额外的21kb序列通过以GenBank条目U94848作为引导序列进行的序列组装获得，并且延伸超出缺失位点IV而进入ITR的一部分中，而无任何与野生型的偏差。

先前报道已将缺失位点I的缺乏与祖先(未缺失)绒毛膜尿囊安卡拉痘苗(CVA)病毒序列的存在相联系(Suter等，2009)。然而，使用我们准备工作中的这些引物，如该出版物中所描述的用于检测CVA基因座的PCR未给出信号(数据未显示)。因此，怀疑已发生缺失位点I的丧失，并且此观察结果应该与病毒DNA左端的基因组变化相关。为阐明这些改变的潜在机制，接下来使用已知的C-2412序列作为起始点进行引物延伸和TdT加尾。从MVA-CR19的基因组DNA获得的PCR片段具有从核心内向左端粒读取、但在核苷酸15322处停止(使用GenBank#AY603355作为参比)并且继续以反义链向右端粒行进并且以核苷酸150816开始的序列(Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.B至D)。

如Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.D中所获得的序列表明MVA-CR19的左ITR可能通过与右ITR的重组而形成。重组位点(RS)位于缺失位点I下游和缺失位点IV上游。

接下来进行PCR，旨在扩增对于每种基因型应为独特的片段，以确认预计的重组确实已在MVA-CR19中发生。一个引物结合至在两个ITR的末端均发现的序列，并且面向中心(不论其退火至左ITR还是右ITR)。另一引物对于基因组核心中的序列是独特的，并且面向左ITR。以GenBank AY603355作为模板的预期扩增产物为9360bp(含有缺失位点I)和165444bp，其中165kb是由结合末端的单引物所跨越的区域。右ITR向左ITR的位置的重排将扩增产物增加至21312bp(Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.A)。确实分别获得了MVA-WT和MVA-CR19的此种不同扩增子，并且NruI、BclI和ApaLI的限制性片段多态性进一步证实了所得片段的预期特性(Fehler！Verweisquelle konnte nichtgefunden werden.B)。

左ITR中丧失的片段含有MAV001L至MVA013L(MVA014L为不受缺失影响的第一个基因)。其中仅MVA005R(C11R)、MVA006L(C10L)和MVA008L(D7L)似乎是功能基因(Antoine等，1998；Meisinger-Henschel等，2007)。MVA001L、MVA002L和MVA003L为假基因，并且还发现其在基因组右端的C-21265重叠群中复制。MVA004L为58个氨基酸的片段化基因，其在基因组右侧部分的188个氨基酸的完整开放阅读框中有备份(mirrored)(MVA189R，类似于根据Genbank条目U94848的注释的痘苗Copenhagen B22R)。MVA007R为91个氨基酸的基因，与242个氨基酸的基因即缺肢畸形(鼠痘)病毒的p28毒力因子具有同源性(Senkevich等，1994，1995)。据报道其在痘苗病毒株Copenhagen、Tian-Tan、WR和MVA中已被破坏(Esteban和Buller，2005)。基因MVA009L至MVA013L似乎为宿主范围决定簇的非功能性片段，其与天花病毒的D6L或牛痘病毒的CP77相似(Antoine等，1998；Meisinger-Henschel等，2007)。

2.3MVA-CR19.GFP的测序

以预计的重组创建了从Genbank条目AY603355开始的另一引导序列，但再次未成功以下一代测序恢复末端重复。用MVA-CR19.GFP制剂的分离的DNA进行新测序尝试，并覆盖了15557bp、89342bp和40737bp的三个重叠群中的总计145636bp(包含缺失位点III中的指示GFP表达盒)。通过常规PCR和测序将最终剩余的空位(因C-2412和C-131534之间无序列重叠而出现的形式)闭合。

可确认所有先前的突变，并且仅发现一个额外的点突变，即MVA082L(痘苗病毒命名法中的L3L)中的V110A。该点突变与偶然限制性位点多态性(HphI位点缺失)相关，所述限制性位点多态性允许将MVA-CR19和MVA-CR19.GFP与从果蝠细胞系上传代的野生型病毒获得的序列进行比较。HphI多态性证实了该点突变不是测序假像。HphI位点在野生型MVA病毒和蝙蝠细胞传代的MVA病毒中可检测，但在MVA-CR19中不可检测(Fehler！Verweisquellekonnte nicht gefunden werden.6)。在第2代MVA、第11代MVA和噬斑纯化的MVA-CR19的制剂中对L3L进行测序，并且观察到对于先前3个点突变而言的两个显著差异。首先，在MVA-CR11中似乎没有L3L基因型的明显混合群，并且在第2代制剂中无L3L存在的迹象(CR基因型的A9L突变在非噬斑纯化的MVA的第2代中已可见，并且所有CR基因型突变在MVA-CR11的色谱图中与野生型序列重叠，参见Jordan等，2013a的图2)。

表1.MVA-CR19中观察到的突变以及在野生型病毒中额外引入的沉默诊断突变的总结

¹这些基因中的沉默突变是用于确认重组包含了完整侧翼的标记。注意GenBank序列U94848列出了A10L中在该位点处的突变(cca aGA gta，R554K)。然而，在随后的分析中对该偏差进行了校正，因此认为U94848和AY603355是相同的(Antoine等，2006)。

2.4不同病毒种类的稳定性

转基因表达的维持、复制特性和减毒程度取决于病毒载体的基因组稳定性。尽管先前已描述了具有ITR中的缺失和重排(Moss等，1981；Paez等，1985；Pickup等，1982；Qin等，2011)以及通过固有免疫系统响应于选择压力的瞬时基因扩增(Elde等，2012)的病毒分离株，也已知MVA具有高遗传稳定性(Antoine等，2006)。接下来，通过在限定化学成分培养基中的鸭类连续悬浮细胞系(而非在血清存在下的鸡精蛋白原代贴壁培养，用于MVA生成的底物)中繁殖来研究野生型MVA和MVA-CR19的遗传标记的维持。将在缺失位点III中含有GFP表达盒或者GFP和mCherry双表达盒的噬斑纯化的重组病毒在CR.pIX悬浮培养中传代20次(Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.)。病毒的背景是野生型病毒或MVA-CR病毒，或在受影响的结构基因中具有CR基因型的点突变的野生型病毒。观察到没有A34R中的改变(无论朝向CR基因型还是朝向野生型均没有)、没有缺失位点III的丢失、没有MVA-CR中重组位点处的改变以及没有野生型中缺失位点I的丧失。对在朝向MVA-CR19第一轮噬斑纯化(其中将A34R中的点突变用作选择标记)中获得的分离株的基因组DNA进行的回顾性研究进一步揭示了大多数病毒已不含有缺失位点I，表明左ITR处的重排先于MVA-CR19的分离(数据未显示)。

2.5L3L突变的影响

在L3蛋白中，在MVA-CR19.GFP中发现了另外的突变，并且通过常规测序和亲代MVA-CR19中的限制性片段长度多态性证实了其存在(图6a)。L3蛋白主要在感染晚期表达，但仅松散地掺入(不作为结构组分)至病毒粒子中(Resch和Moss，2005)。L3L表达的丧失可降低进入的颗粒的感染活性，可能是因为新感染的核心的新生mRNA的转录或输出受到干扰(Resch和Moss，2005)。L3L的条件表达对与病毒扩散有关的肌动蛋白尾的形成、病毒粒子的加工或它们与宿主细胞膜的结合没有影响(Doceul等，2010；Resch和Moss，2005)。

将L3V110A突变***至野生型病毒中未导致48h PI噬斑表型的明显改变(Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.)。接下来，通过比较用不同重组病毒感染的贴壁细胞中病灶的扩张来测试增强的初始感染性。使用NyONE细胞成像仪(SynenTecGmbH，Germany)在两个时间点(24h PI和40h PI)以及增加的MOI(0.05、0.1和1)对表达GFP(经感染的)的细胞覆盖多少细胞区域进行量化。因正确的MOI是本研究中的重要参数，使用两种单独的MVA-WT.L3LCR.GFP制剂(野生型病毒骨架中MVA-CR19的L3L突变)。如图6c和图6d所示，在低于1的MOI下和最初24h中，病毒传播似乎无差异。只有MVA-CR19.GFP似乎在MOI1下具有轻微的初始优势。在40h PI时，不取决于MOI，野生型和L3L突变体的GFP阳性面积之间再次无显著差异。然而，MVA-CR19.GFP已占据了经感染的细胞单层的显著更大的面积。

L3L为痘苗病毒复制的必需基因(Upton等，2003)。然而，此处发现的L3突变未降低感染滴度，并且在野生型骨架中具有该突变的病毒以非常高的效率复制且不亚于单细胞悬浮液中的野生型参比(图6b)。复制至预期高滴度的MVA-CR19.GFP在同一实验中也未诱导聚集体，并且只有在诱导细胞聚集体时，具有所有观察到的CR基因型的突变的野生型病毒才复制至非常高的滴度。

3.讨论

已分离并表征了迄今为止未描述但高度稳定的载体株。4个突变的组表征了病毒的基因组DNA，并且对表型具有主要影响。在MVA-CR19的病毒基因组的左侧发生了非常广泛的变化。当借助用于表征MVA的6个缺失位点的引物系列(Kremer等，2012)对GFP-重组病毒进行分析时，未能检测到MVA-CR19衍生物中缺失位点I的信号。进一步的研究表明，已发生了基因组DNA的左侧被包含ITR的右侧替换的重组。该事件已导致许多基因(在Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.C中列出)的广泛对称和重复以及MAV001L至MVA013L的丧失。尚未对端粒进行测序。但通过使用Genbank序列U94848和诊断性长PCR的结果作为基础，则表征MVA-CR19的左基因组区域可从15327bp扩展至27108bp。因此，所述重排可能已增加了两个端粒之间的互补性区域，但未影响GC含量(对于CR19vs.野生型左端粒，16.3％vs.16.6％以及17.7％vs.17.5％)。

3个功能基因MVA005R(C11R)、MVA006L(C10L)和MVA008L(D7L)(Antoine等，1998；Meisinger-Henschel等，2007)似乎在此重排中不可逆地丧失并可能影响MVA-CR19的生物学特性。C11R基因的缺失可干扰MVA利用引起NF-κB活化的细胞外信号调节激酶2(ERK2)的能力(Martin等，2012)。由于NF-κB活化分叉为数个具有不同结果的信号转导途径(Santoro等，2003)，对病毒复制的最终影响是难以预测的。然而，痘苗病毒干扰NF-κB活化(Mohamed和McFadden，2009；Oie和Pickup，2001；Shisler和Jin，2004)，而据报道MVA已丧失针对NF-κB途径的防御因子(Antoine等，1998)。所以，由于潜在的抗病毒信号不再被已丧失其针对该特定信号级联的防御的一部分的病毒激活，剧烈程度较低的NF-κB活化可改善反应原性。

C10蛋白似乎通过掩蔽IL-1β的细胞受体来拮抗该促炎性细胞因子(Kluczyk等，2002)。因为另一病毒因子也干扰IL-1β(由MVA184R基因表达的可溶性受体)，MVA-CR19中C10的丧失可能仅在体内具有有限的作用(Blanchard等，1998)。示出了MVA184R的失活增强了MVA载体的反应原性并且延长了小鼠中的T细胞记忆应答(Staib等，2005)。该观察结果可表明，MVA-CR19中MVA184R的敲除可与C10的丧失协同作用，并且可具有进一步改善MVA的自我辅助特性的潜力。

先前已使用D7L的缺失来增强MVA的反应原性(Falivene等，2012)。D7蛋白由经感染的宿主细胞分泌。它可结合至感染部位的细胞外基质中的糖胺聚糖，并且可延迟炎症应答及干扰白细胞介素-18(通过固有免疫系统和适应性免疫系统用于抗病毒应答的中心信号分子)的功能(Damon等，1998；Esteban等，2004；Smith等，2000)。

先前已描述了痘苗病毒ITR中的异质性和重排(例如Moss等，1981；Paez等，1985；Pickup等，1982；Qin等，2011)。此处的结果与一些先前研究的不同在于不仅观察到缺失，还观察到广泛重排，其似乎改善(而非干扰)受影响的病毒的复制。本研究证实了多种噬斑纯化的MVA载体跨越几种遗传标记以及对于缺失位点III中的不同***物的高度突变稳定性和遗传稳定性。MVA-CR19基因组的左部分和右部分之间的重组导致缺失位点I的诊断丧失，并且与C11R、C10L和D7L的缺失相关。倾向于推测观察到的组合破坏可改善基于新型基因型的疫苗的反应原性。

本专利申请中使用以下缩写：

MVA，MVA-WT：改良安卡拉痘苗病毒，MVA-野生型。

MVA-CR19：第19代的新型菌株，与MVA相关并且从CR.pIX细胞的培养物中分离出。

MVA-WT A3A9A34L3：MVA-WT的突变体，其在基因A3L、A9L和A34R中含有点突变H639Y、K75E和D86Y。

MVA-WT L3：MVA-WT的突变体，其在基因L3L中含有点突变V110A。

PI：感染后。

MOI：感染复数。

CR.pIX：稳定表达pIX蛋白(人腺病毒2型的次要结构蛋白)的番鸭(Cairinamoschata)视网膜细胞系。

GFP：绿色荧光蛋白。

以下序列是序列表的一部分：

SEQ ID NO:1 A3L基因产物

SEQ ID NO:2 A34R基因产物

SEQ ID NO:3 A9L基因产物

SEQ ID NO:4 H639Y A3L基因产物突变体

SEQ ID NO:5 D86Y A34R基因产物突变体

SEQ ID NO:6 K75E A9L基因产物突变体

SEQ ID NO:7 A3L基因

SEQ ID NO:8 A34R基因

SEQ ID NO:9 A9L基因

SEQ ID NO:10 A3L基因突变体

SEQ ID NO:11 A34R基因突变体

SEQ ID NO:12 A9L基因突变体

SEQ ID NO:13 L3L基因产物

SEQ ID NO:14 V110A L3L基因产物突变体

SEQ ID NO:15 L3L基因

SEQ ID NO:16 L3L基因突变体

SEQ ID NO:17 LeftF引物

SEQ ID NO:18 LeftR引物

SEQ ID NO:19 RightF引物

SEQ ID NO:20 RightR引物

SEQ ID NO:21 PromEL序列

SEQ ID NO:22 A34F引物

SEQ ID NO:23 A34R引物

SEQ ID NO:24 L3F引物

SEQ ID NO:25 L3R引物

SEQ ID NO:26 A3F引物

SEQ ID NO:27 A3R引物

SEQ ID NO:28 A9F引物

SEQ ID NO:29 A10R引物

SEQ ID NO:30 D2RII引物

SEQ ID NO:31 D2引物

SEQ ID NO:32 AAP引物

SEQ ID NO:33 GSPD2-R引物

SEQ ID NO:34 RS469F引物

SEQ ID NO:35 RS469R引物

SEQ ID NO:36 ITR-M引物

SEQ ID NO:37 MVA相关病毒(MVA-CR19.GFP)

参考文献

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序列表

<110> ProBioGen AG

<120> 具有广泛基因组对称的MVA相关的新型痘苗病毒载体

<130> 513-31 PCT

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 644

<212> PRT

<213> MVA病毒(A3L基因产物)

<400> 1

Met Glu Ala Val Val Asn Ser Asp Val Phe Leu Thr Ser Asn Ala Gly

1 5 10 15

Leu Lys Ser Ser Tyr Thr Asn Gln Thr Leu Ser Leu Val Asp Glu Asp

20 25 30

His Ile His Thr Ser Asp Lys Ser Leu Ser Cys Ser Val Cys Asn Ser

35 40 45

Leu Ser Lys Ile Val Asp Asp Asp Phe Ile Ser Ala Gly Ala Arg Asn

50 55 60

Gln Arg Thr Lys Pro Lys Arg Ala Gly Asn Asn Gln Ser Gln Gln Pro

65 70 75 80

Ile Lys Lys Asp Cys Met Val Ser Ile Asp Glu Val Ala Ser Thr His

85 90 95

Asp Trp Ser Thr Arg Leu Arg Asn Asp Gly Asn Ala Ile Ala Lys Tyr

100 105 110

Leu Thr Thr Asn Lys Tyr Asp Thr Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Met

115 120 125

Leu Asn Ile Met Asn Lys Leu Asn Ile Val Arg Thr Asn Arg Asn Glu

130 135 140

Leu Phe Gln Leu Leu Thr His Val Lys Ser Thr Leu Asn Asn Ala Ser

145 150 155 160

Val Ser Val Lys Cys Thr His Pro Leu Val Leu Ile His Ser Arg Ala

165 170 175

Ser Pro Arg Ile Gly Asp Gln Leu Lys Glu Leu Asp Lys Ile Tyr Ser

180 185 190

Pro Ser Asn His His Ile Leu Leu Ser Thr Thr Arg Phe Gln Ser Met

195 200 205

His Phe Thr Asp Met Ser Ser Ser Gln Asp Leu Ser Phe Ile Tyr Arg

210 215 220

Lys Pro Glu Thr Asn Tyr Tyr Ile His Pro Ile Leu Met Ala Leu Phe

225 230 235 240

Gly Ile Lys Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ala Tyr Val His Gly Asp Thr

245 250 255

Tyr Ser Leu Ile Gln Gln Leu Tyr Glu Phe Arg Lys Val Lys Ser Tyr

260 265 270

Asn Tyr Met Leu Leu Val Asn Arg Leu Thr Glu Asp Asn Pro Ile Val

275 280 285

Ile Thr Gly Val Ser Asp Leu Ile Ser Thr Glu Ile Gln Arg Ala Asn

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Met His Thr Met Ile Arg Lys Ala Ile Met Asn Ile Arg Met Gly Ile

305 310 315 320

Phe Tyr Cys Asn Asp Asp Asp Ala Val Asp Pro His Leu Met Lys Ile

325 330 335

Ile His Thr Gly Cys Ser Gln Val Met Thr Asp Glu Glu Gln Ile Leu

340 345 350

Ala Ser Ile Leu Ser Ile Val Gly Phe Arg Pro Thr Leu Val Ser Val

355 360 365

Ala Arg Pro Ile Asn Gly Ile Ser Tyr Asp Met Lys Leu Gln Ala Ala

370 375 380

Pro Tyr Ile Val Val Asn Pro Met Lys Met Ile Thr Thr Ser Asp Ser

385 390 395 400

Pro Ile Ser Ile Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ser Met Ala Phe Asp Gly

405 410 415

Asn Ser Gly Arg Val Val Phe Ala Pro Pro Asn Ile Gly Tyr Gly Arg

420 425 430

Cys Ser Gly Val Thr His Ile Asp Pro Leu Gly Thr Asn Val Met Gly

435 440 445

Ser Ala Val His Ser Pro Val Ile Val Asn Gly Ala Met Met Phe Tyr

450 455 460

Val Glu Arg Arg Gln Asn Lys Asn Met Phe Gly Gly Glu Cys Tyr Thr

465 470 475 480

Gly Phe Arg Ser Leu Ile Asp Asp Thr Pro Ile Asp Val Ser Pro Glu

485 490 495

Ile Met Leu Asn Gly Ile Met Tyr Arg Leu Lys Ser Ala Val Cys Tyr

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515 520 525

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530 535 540

Asp Pro Leu Ser Val Phe Asn Pro Gly Ala Arg Asn Ala Arg Leu Met

545 550 555 560

Arg Ala Leu Lys Asn Gln Tyr Lys Lys Leu Ser Met Asp Ser Asp Asp

565 570 575

Gly Phe Tyr Glu Trp Leu Asn Gly Asp Gly Ser Val Phe Ala Ala Ser

580 585 590

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Leu Ile Tyr Ala Gln Asp Tyr Asp Gln Tyr Ile Ser Ala Arg His Ile

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Thr Glu Leu Phe

<210> 2

<211> 168

<212> PRT

<213> MVA病毒(A34R基因产物)

<400> 2

Met Lys Ser Leu Asn Arg Gln Thr Val Ser Arg Phe Lys Lys Leu Ser

1 5 10 15

Val Pro Val Ala Ile Met Met Ile Leu Ser Thr Ile Ile Ser Gly Ile

20 25 30

Gly Thr Phe Leu His Tyr Lys Glu Glu Leu Met Pro Ser Ala Cys Ala

35 40 45

Asn Gly Trp Ile Gln Tyr Asp Lys His Cys Tyr Leu Asp Thr Asn Ile

50 55 60

Lys Met Ser Thr Asp Asn Ala Val Tyr Gln Cys Arg Lys Leu Arg Ala

65 70 75 80

Arg Leu Pro Arg Pro Asp Thr Arg His Leu Arg Val Leu Phe Ser Ile

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100 105 110

Leu Asp Ile Asn Asn Asp Lys Asp Ile Asp Ile Ser Lys Leu Thr Asn

115 120 125

Phe Lys Gln Leu Asn Ser Thr Thr Asp Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Tyr

130 135 140

Lys Ser Gly Lys Leu Val Lys Thr Val Cys Lys Ser Thr Gln Ser Val

145 150 155 160

Leu Cys Val Lys Lys Phe Tyr Lys

165

<210> 3

<211> 94

<212> PRT

<213> MVA病毒(A9L基因产物)

<400> 3

Met Ser Cys Tyr Thr Ala Ile Leu Lys Ser Val Gly Gly Leu Ala Leu

1 5 10 15

Phe Gln Val Ala Asn Gly Ala Ile Asp Leu Cys Arg His Phe Phe Met

20 25 30

Tyr Phe Cys Glu Gln Lys Leu Arg Pro Asn Ser Phe Trp Phe Val Val

35 40 45

Val Arg Ala Ile Ala Ser Met Ile Met Tyr Leu Val Leu Gly Ile Ala

50 55 60

Leu Leu Tyr Ile Ser Glu Gln Asp Asn Lys Lys Asn Thr Asn Asn Asp

65 70 75 80

Lys Arg Asn Glu Ser Ser Ile Asn Ser Asn Ser Ser Pro Lys

85 90

<210> 4

<211> 644

<212> PRT

<213> MVA相关病毒 (H639Y A3L基因产物突变体)

<400> 4

Met Glu Ala Val Val Asn Ser Asp Val Phe Leu Thr Ser Asn Ala Gly

1 5 10 15

Leu Lys Ser Ser Tyr Thr Asn Gln Thr Leu Ser Leu Val Asp Glu Asp

20 25 30

His Ile His Thr Ser Asp Lys Ser Leu Ser Cys Ser Val Cys Asn Ser

35 40 45

Leu Ser Lys Ile Val Asp Asp Asp Phe Ile Ser Ala Gly Ala Arg Asn

50 55 60

Gln Arg Thr Lys Pro Lys Arg Ala Gly Asn Asn Gln Ser Gln Gln Pro

65 70 75 80

Ile Lys Lys Asp Cys Met Val Ser Ile Asp Glu Val Ala Ser Thr His

85 90 95

Asp Trp Ser Thr Arg Leu Arg Asn Asp Gly Asn Ala Ile Ala Lys Tyr

100 105 110

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115 120 125

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Leu Phe Gln Leu Leu Thr His Val Lys Ser Thr Leu Asn Asn Ala Ser

145 150 155 160

Val Ser Val Lys Cys Thr His Pro Leu Val Leu Ile His Ser Arg Ala

165 170 175

Ser Pro Arg Ile Gly Asp Gln Leu Lys Glu Leu Asp Lys Ile Tyr Ser

180 185 190

Pro Ser Asn His His Ile Leu Leu Ser Thr Thr Arg Phe Gln Ser Met

195 200 205

His Phe Thr Asp Met Ser Ser Ser Gln Asp Leu Ser Phe Ile Tyr Arg

210 215 220

Lys Pro Glu Thr Asn Tyr Tyr Ile His Pro Ile Leu Met Ala Leu Phe

225 230 235 240

Gly Ile Lys Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ala Tyr Val His Gly Asp Thr

245 250 255

Tyr Ser Leu Ile Gln Gln Leu Tyr Glu Phe Arg Lys Val Lys Ser Tyr

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

Pro Ile Ser Ile Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ser Met Ala Phe Asp Gly

405 410 415

Asn Ser Gly Arg Val Val Phe Ala Pro Pro Asn Ile Gly Tyr Gly Arg

420 425 430

Cys Ser Gly Val Thr His Ile Asp Pro Leu Gly Thr Asn Val Met Gly

435 440 445

Ser Ala Val His Ser Pro Val Ile Val Asn Gly Ala Met Met Phe Tyr

450 455 460

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Gly Phe Arg Ser Leu Ile Asp Asp Thr Pro Ile Asp Val Ser Pro Glu

485 490 495

Ile Met Leu Asn Gly Ile Met Tyr Arg Leu Lys Ser Ala Val Cys Tyr

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Asp Pro Leu Ser Val Phe Asn Pro Gly Ala Arg Asn Ala Arg Leu Met

545 550 555 560

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565 570 575

Gly Phe Tyr Glu Trp Leu Asn Gly Asp Gly Ser Val Phe Ala Ala Ser

580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

Leu Ile Tyr Ala Gln Asp Tyr Asp Gln Tyr Ile Ser Ala Arg Tyr Ile

625 630 635 640

Thr Glu Leu Phe

<210> 5

<211> 168

<212> PRT

<213> MVA相关病毒 (D86Y A34R基因产物突变体)

<400> 5

Met Lys Ser Leu Asn Arg Gln Thr Val Ser Arg Phe Lys Lys Leu Ser

1 5 10 15

Val Pro Val Ala Ile Met Met Ile Leu Ser Thr Ile Ile Ser Gly Ile

20 25 30

Gly Thr Phe Leu His Tyr Lys Glu Glu Leu Met Pro Ser Ala Cys Ala

35 40 45

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85 90 95

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Phe Lys Gln Leu Asn Ser Thr Thr Asp Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Tyr

130 135 140

Lys Ser Gly Lys Leu Val Lys Thr Val Cys Lys Ser Thr Gln Ser Val

145 150 155 160

Leu Cys Val Lys Lys Phe Tyr Lys

165

<210> 6

<211> 94

<212> PRT

<213> MVA相关病毒 (K75E A9L基因产物突变体)

<400> 6

Met Ser Cys Tyr Thr Ala Ile Leu Lys Ser Val Gly Gly Leu Ala Leu

1 5 10 15

Phe Gln Val Ala Asn Gly Ala Ile Asp Leu Cys Arg His Phe Phe Met

20 25 30

Tyr Phe Cys Glu Gln Lys Leu Arg Pro Asn Ser Phe Trp Phe Val Val

35 40 45

Val Arg Ala Ile Ala Ser Met Ile Met Tyr Leu Val Leu Gly Ile Ala

50 55 60

Leu Leu Tyr Ile Ser Glu Gln Asp Asn Lys Glu Asn Thr Asn Asn Asp

65 70 75 80

Lys Arg Asn Glu Ser Ser Ile Asn Ser Asn Ser Ser Pro Lys

85 90

<210> 7

<211> 1935

<212> DNA

<213> MVA病毒 (A3L基因)

<400> 7

atggaagccg tggtcaatag cgatgttttt ttaacatcta acgcaggact aaaatctagt 60

tatactaatc aaactctttc tttggtagat gaagatcata ttcacacttc tgataaatct 120

ttgtcttgta gtgtatgcaa ttcattatcc aaaattgtag acgatgactt tatatccgca 180

ggggctagaa atcaacgtac caaacctaaa cgtgcaggaa ataatcaatc tcaacagcct 240

atcaaaaagg attgtatggt ttccatcgac gaagtagcat ccacgcatga ttggagtacg 300

agattgagaa atgatgggaa tgcaattgct aaatatctaa ctactaacaa gtatgacaca 360

tctaacttta ctattcagga tatgcttaac attatgaata aactaaatat tgtcagaaca 420

aatagaaacg agctatttca actccttacc catgtaaaga gcacattgaa caatgctagt 480

gtttctgtga aatgtactca tcctttagta cttattcatt ctcgagctag tcctagaatc 540

ggtgaccaac tcaaagagtt agataaaata tactctccat ctaatcatca tattcttctg 600

tcgactacac gattccaatc catgcatttt accgatatgt ctagttcaca agatttgtct 660

tttatttata gaaaaccaga aactaattac tatattcatc ctattctgat ggcactattc 720

ggtattaaac ttcctgcgct cgagaacgcg tatgtacatg gagacaccta tagcctaatc 780

cagcaacttt atgaatttag aaaagtaaag tcttataatt atatgttgtt ggttaatcgt 840

cttacggagg ataatccgat agtgattaca ggtgtatcag atctaatttc cacagagatt 900

cagagagcaa acatgcatac catgattaga aaagcaatta tgaacattag aatgggaatt 960

ttttattgta acgatgatga tgcggtagat ccccatctaa tgaagattat tcatactgga 1020

tgctctcaag ttatgacaga tgaagaacag atattggctt ctattttgtc tatagttgga 1080

tttagaccta cgttggtttc tgtggctaga cctataaacg gcatcagtta cgatatgaaa 1140

cttcaggcgg caccatacat agttgttaat cctatgaaga tgatcacaac atccgacagt 1200

ccgatttcta tcaattccaa ggatatttat tctatggcat tcgatggcaa tagtggaaga 1260

gtggtgttcg ctcctcctaa cataggatat ggaagatgtt ctggagttac acacattgat 1320

ccattgggaa ctaatgtgat gggtagtgct gttcattccc ctgttatcgt taatggagca 1380

atgatgtttt atgtagaacg acgtcagaat aagaatatgt ttggtggaga atgttacacc 1440

ggctttagat ctctaataga tgatactccg attgacgtat caccagaaat catgctaaac 1500

ggtatcatgt ataggttaaa gtccgcagtt tgttacaaac tcggagacca attctttgat 1560

tgtggatcgt ctgatatctt cttgaaggga cattatacga ttctatttac agaaaatgga 1620

ccctggatgt acgatcctct ttctgttttc aatccgggag ctagaaatgc tagattgatg 1680

cgagctctca aaaaccagta caagaaatta tcaatggatt cagacgatgg tttttatgaa 1740

tggttgaatg gcgacggttc agtatttgct gcctcaaaac agcaaatgtt gatgaatcac 1800

gttgctaact ttgacgacga tcttctaact atggaagaag ccatgtcgat gatttcgaga 1860

cattgttgta tcttaattta tgcacaggat tatgatcaat atattagcgc tagacatatt 1920

acagaactat tttag 1935

<210> 8

<211> 507

<212> DNA

<213> MVA病毒 (A34R基因)

<400> 8

atgaaatcgc ttaatagaca aactgtaagt aggtttaaga agttgtcggt gccggtcgct 60

ataatgatga tactctcaac cattattagt ggcataggaa catttctgca ttacaaagaa 120

gaactgatgc ctagtgcttg cgccaatgga tggatacaat acgataaaca ttgttattta 180

gatactaaca ttaaaatgtc tacagataat gcggtttatc agtgtcgtaa attacgagcc 240

agattgccta gaccggatac tagacatctg agagtattgt ttagtatttt ttataaagat 300

tattgggtaa gtttaaaaaa gaccaatgat aaatggttag atattaataa tgataaagat 360

atagatatta gtaaattaac aaattttaaa caactaaaca gtacgacgga tgctgaagcg 420

tgttatatat acaagtctgg aaaactggtt aaaacagtat gtaaaagtac tcaatctgta 480

ctatgtgtta aaaaattcta caagtga 507

<210> 9

<211> 285

<212> DNA

<213> MVA病毒 (A9L基因)

<400> 9

atgtcatgtt atacagctat attaaaatct gtaggaggac tggcgctatt tcaagtagcc 60

aatggcgcca tagatttatg tagacatttc tttatgtatt tttgtgaaca aaagctacga 120

ccaaattcat tttggttcgt cgttgttaga gccattgcaa gcatgataat gtatttagta 180

ttaggcatag cattgctgta tatttctgaa caagataaca agaagaatac taataatgat 240

aaacgaaatg agtcgtctat aaattctaac tccagtccta agtaa 285

<210> 10

<211> 1935

<212> DNA

<213> MVA相关病毒 (A3L基因突变体)

<400> 10