阅读说明：本技术 一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用 (small yellow croaker ossein antibacterial peptide and application thereof ) 是由 叶常青 于 2019-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用,属于生物学技术领域,抗菌肽的氨基酸序列为HECEDCYSGCRNSCQH,分子量为1.87Da,可以抑制食品上的食品腐败微生物的生长,防止或抑制了被该微生物引起的所述食品的腐败变质,为实际无毒级,具有副作用或危险低的优势,安全性高；本发明抗菌肽可用于制备制备食品防腐剂,防止或抑制微生物引起的食品腐败变质；本发明抗菌肽与香豆素的合用具有较强的协同作用,可以增强抗菌活性,降低抗菌肽的使用量。(the invention provides a little yellow croaker ossein antibacterial peptide and application thereof, belonging to the technical field of biology, wherein the amino acid sequence of the antibacterial peptide is HECEDCYSGCRNSCQH, the molecular weight is 1.87Da, the antibacterial peptide can inhibit the growth of food spoilage microorganisms on food, prevent or inhibit the spoilage of the food caused by the microorganisms, is actually non-toxic, has the advantages of low side effect or risk and high safety; the antibacterial peptide can be used for preparing food preservatives to prevent or inhibit food spoilage caused by microorganisms; the combination of the antibacterial peptide and the coumarin has stronger synergistic effect, can enhance the antibacterial activity and reduce the using amount of the antibacterial peptide.)

一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用。

背景技术

胶原蛋白是动物体内的一种组织结构蛋白，约占动物体总蛋白含量的25％。胶原蛋白是细胞外基质中最主要的纤维状蛋白质，是机体***和间质组织的主要纤维组成成分，也是细胞骨架的重要组分。胶原蛋白广泛存在于皮肤、筋腱、骨头及韧带等实质器官中，使组织器官具有一定的结构以及机械力学性质，能够达到保护机体、支撑器官的作用。胶原多肽是胶原蛋白的酶解产物，分子质量要比胶原蛋白低得多，其肽链已经断开，可被人体直接吸收利用。目前，大量的研究表明，利用蛋白酶水解畜骨得到的水解产物胶原多肽具有多种生物活性功能，例如降血压、抗氧化、预防和治疗关节炎和抗衰老等。抗菌肽(antibacterial peptides,ABP)是具有抗菌活性的肽类的总称，不但具有广谱的抗菌活性，而且还有抗癌、抗病毒、抗寄生虫、促进伤口愈合等作用，具有较大的药用开发价值。从自然生物活体中提取的抗菌肽大多是由12-100个氨基酸残基构成，有典型的两亲结构，分子质量大约在4-10kDa之间。为将抗菌肽开发为新型的食品防腐剂，或抗菌、抗癌等药物，在近些年中，众多学者对抗菌肽进行了研究。

我国是一个水产品生产和消费的大国，据统计自年以来，我国的水产品生产总量已经连续年位居世界第一。然而，水产大国并不等于是水产强国，我国的水产品结构不合理，加工水平依然停留在初级阶段。主要表现在初级加工产品多，工业化程度较低，深加工产品少，加工品比例较低而且技术含量少，急需用新型技术加以改进和提高。目前我国的水产品加工率仅为，远远低于渔业发达国家的水平；而且我国水产加工业的废弃物利用水平较低，每年产生的大量水产品下脚料无法得到有效地加工利用，成了影响水产业经济效益的关键所在。以小黄鱼生产加工为例，我国含有丰富的小黄鱼资源，每年加工生产过程中会产生大量的鱼骨废弃物未得到有效的利用。面对如此巨大的骨资源，如不利用或者不合理利用，必将带来环境污染问题。胶原多肽的生产是一个变废为宝的过程，虽然原料低廉但成品价格却十分昂贵，大批量的生产可带动水产养殖业的发展，增加渔民收入，在大大促进经济发展的同时又减少了环境污染，对可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑菌活性强，可以抑制食品上的食品腐败微生物的生长，防止或抑制食品腐败变质的小带鱼源抗菌肽添加剂。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种小黄鱼骨胶原抗菌肽，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示。该抗菌肽可以抑制食品上的食品腐败微生物的生长，防止或抑制了被该微生物引起的食品的腐败变质。且抗菌肽对小鼠经口最大耐受量大于15g/kg，为实际无毒级。

优选的，抗菌肽的分子量为1.87Da。计算机模拟的等电点pI＝5.39。

本发明本发明的又一目的在于，提供小黄鱼骨胶原抗菌肽在制备食品防腐剂中的应用。

小黄鱼骨胶原抗菌肽具有副作用或危险低的优势，安全性高，经口可为消化酶分解为氨基酸，进而作为营养物质吸收。所以，该抗菌肽可以用于制备没有抗药菌的出现或副作用的问题、并且安全性极高的具有抗真菌活性的食品防腐剂。

优选的，食品防腐剂防止或抑制微生物引起的食品腐败变质。

优选的，微生物为细菌或真菌。

优选的，细菌是选自假单胞菌或芽孢杆菌的食品腐败种类细菌。

优选的，真菌是选自以下种属的食品腐败种类真菌：链格孢菌、曲霉菌、镰刀霉、葡萄孢菌、炭疽菌、酵母。进一步优选，真菌是选自克鲁维酵母或接合酵母种属的食品腐败种类真菌。

优选的，食品为源自、提供、或为，水果、坚果、蔬菜、种子、糖、奶制品、肉类、鱼类或面包。

优选的，防腐剂还包含香豆素。抗菌肽与香豆素的合用具有较强的协同作用，可以增强抗菌活性，降低抗菌肽的使用量。此外，该组合的使用可能减少其他防腐技术的使用，如加热法，保留食物自身风味；该组合的使用也可能减少其他化学防腐剂的使用，进而减少其副作用。

本发明本发明的又一目的在于，提供一种防止或抑制微生物引起的食品腐败变质的方法，其特征在于：包括给有需要的食品使用含有有效剂量的上述防腐剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明抗菌肽的氨基酸序列为HECEDCYSGCRNSCQH，可以抑制食品上的食品腐败微生物的生长，防止或抑制了被该微生物引起的所述食品的腐败变质，为实际无毒级，具有副作用或危险低的优势，安全性高；本发明抗菌肽可用于制备制备食品防腐剂，防止或抑制微生物引起的食品腐败变质；本发明抗菌肽与香豆素的合用具有较强的协同作用，可以增强抗菌活性，降低抗菌肽的使用量。

本发明采用了上述技术方案提供一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1是本发明实施例1中凝胶层析图谱；

图2是本发明实施例1中凝胶层析图谱中各组分峰的抑菌效果；

图3是本发明实施例1中离子交换层析图谱；

图4是本发明实施例1中离子交换层析图谱中各组分峰的抑菌效果；

图5是本发明实施例1中反相高效液相色谱图；

图6是本发明试验例2中抗菌肽和香豆素的抑菌效果。

具体实施方式

本发明所述多肽对食品的防腐可以发生于食品的储存过程、运输过程、处理操作过程、加工过程或展示过程。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明的一个实施方案是一种小黄鱼骨胶原抗菌肽，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示。该抗菌肽可以抑制食品上的食品腐败微生物的生长，防止或抑制了被该微生物引起的所述食品的腐败变质。

在一个实施方案中，抗菌肽的分子量为1.87Da。计算机模拟的等电点pI＝5.39。

本发明的一个实施方案是一种小黄鱼骨胶原抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将小黄鱼骨进行修整、清洗并破碎成1-20mm的鱼骨颗粒；

步骤2：按固液比为1:1-2g/mL将鱼骨颗粒中加入pH为8.0-9.0的磷酸盐缓冲液(含0.01-0.05μM香草醛)，用组织均质机磨碎，在温度为40-60℃的密闭容器中蒸煮15-30min；在水产品加工过程中，原料在高温蒸煮过程中的受热程度会严重影响最终产品的质量，但是蒸煮的温度和时间不易控制，容易导致蛋白质变性不够充分或者变性过度，从而影响酶解效果。而该步骤可使小黄鱼骨胶原蛋白结构在较低的蒸煮温度下即发生改变，使得胶原蛋白分子暴露出更多的酶切位点，有利于蛋白酶与蛋白的结合，从而得到氨基酸序列为HECEDCYSGCRNSCQH的抗菌肽，且该步骤的处理可以增大酶解反应速率和抗菌肽的得率；

步骤2：将步骤1得小带鱼中加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶，碱性蛋白酶的酶底比为400-600U/g，风味蛋白酶的酶底比为300-500U/g，在温度为50-60℃下进行酶解4-6h，然后灭酶，即得酶解液；

步骤3：将步骤2得酶解液加入截留分子量为3kDa的离心超滤管，在转速为3000-5000r/min下离心20-30min，得到＜3kDa部分粗品，然后采用凝胶层析分离、离子交换层析分离、反相高效液相色谱纯化，即得抗菌肽添加剂。

本发明的一个实施方案是小黄鱼骨胶原抗菌肽在制备食品防腐剂中的应用。

通过微生物的食品腐败变质是指微生物对食品的任何改变，例如，味道，气味或外观(如，形状、颜色、质地、硬度)，从而降低了其营养和/或商业价值。小黄鱼骨胶原抗菌肽具有副作用或危险低的优势，安全性高，经口可为消化酶分解为氨基酸，进而作为营养物质吸收。所以，该抗菌肽可以用于制备没有抗药菌的出现或副作用的问题、并且安全性极高的具有抗真菌活性的食品防腐剂。

在一个实施方案中，防腐剂中抗菌肽的质量浓度为0.01％-2％。

在一个实施方案中，食品防腐剂防止或抑制微生物引起的食品腐败变质。

在一个实施方案中，微生物为细菌或真菌。

在一个实施方案中，细菌是选自假单胞菌或芽孢杆菌的食品腐败种类细菌。

在一个实施方案中，真菌是选自以下种属的食品腐败种类真菌：链格孢菌、曲霉菌、镰刀霉、葡萄孢菌、炭疽菌、酵母。进一步优选，真菌是选自克鲁维酵母或接合酵母种属的食品腐败种类真菌。

在一个实施方案中，食品为源自、提供、或为，水果、坚果、蔬菜、种子、糖、奶制品、肉类、鱼类或面包。源自水果的食品包括果酒和果汁。提供种子的植物包括谷类(如玉米、小麦、大麦、高粱、小米、大米、燕麦和黑麦)以及豆类(如黄豆、豌豆和扁豆)。糖，优选蔗糖，可以源自甜菜或甘蔗。奶制品包括奶、奶油、奶酪和酸奶。液体或糊状食物包括汤、调味料、咸菜、蛋黄酱、色拉酱和其他色拉调味料、饯、糖浆和婴儿食品。所述肉类和/或鱼类食品估计可以是处理过或未处理过的，以及可以是烹饪过的或未烹饪过的。

在一个实施方案中，防腐剂还包含香豆素。香豆素是由顺式邻羟基桂皮酸脱水而形成的内酯，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗微生物、抗凝血等生物活性，香豆素通常分成4类：简单香豆素类(如瑞香内酯、蛇床子素等)、呋喃香豆素类(如花椒毒酚、紫花前胡内酯等)、吡喃香豆素类(如紫花前胡素、白花前胡丙素等)及其他香豆素类(如胀果香豆素甲、拟雌内酯等)。抗菌肽与香豆素的合用具有较强的协同作用，可以增强抗菌活性，降低抗菌肽的使用量。此外，该组合的使用可能减少其他防腐技术的使用，如加热法，保留食物自身风味；该组合的使用也可能减少其他化学防腐剂的使用，进而减少其副作用。

在一个实施方案中，抗菌肽与香豆素的摩尔比为1:0.05-3。该摩尔比范围内的抗菌肽与香豆素的协同作用最强。

本发明的一个实施方案是一种防止或抑制微生物引起的食品腐败变质的方法，其特征在于：包括给有需要的食品使用含有有效剂量的上述防腐剂。

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

实施例1：

一种小黄鱼骨胶原抗菌肽的制备方法，包括，

步骤1：将小黄鱼骨进行修整、清洗并破碎成1-20mm的鱼骨颗粒；

步骤2：按固液比为1:1.2g/mL将鱼骨颗粒中加入pH为8.5的磷酸盐缓冲液(含0.02μM香草醛)，用组织均质机磨碎，在温度为50℃的密闭容器中蒸煮20min；

步骤2：将步骤1得小带鱼中加入碱性蛋白酶和风味蛋白酶，碱性蛋白酶的酶底比为500U/g，风味蛋白酶的酶底比为400U/g，在温度为56℃下进行酶解5h，然后灭酶，即得酶解液；

步骤3：将步骤2得酶解液加入截留分子量为3kDa的离心超滤管，在转速为4000r/min下离心30min，得到＜3kDa部分粗品，浓缩、冷冻干燥；

步骤4：将步骤3得冻干粗品用pH为8.0 0.05mM磷酸盐缓冲液配制浓度为40mg/mL的溶液，通过0.22μm过滤器过滤，釆用sephadex G-25凝胶层析进一步分离纯化，选用柱管内径15mm，柱长50cm的层析柱，上样量为5mL，以pH为8.0、0.05mM磷酸盐缓冲液洗脱，流速0.8mL/min，凝胶层析图谱见图1所示，层析图中出现4个洗脱峰，重复进样并收集各洗脱峰组分，经浓缩、冷冻干燥，配成一定浓度的溶液，测定各组分峰的对枯草芽孢杆菌、曲霉菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果如图2所示，由图可知，组分III对枯草芽孢杆菌、曲霉菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，因此选择组分III进行进一步的分离纯化；

步骤5：将步骤4得组分III用pH为6.5、0.025M Tris-HCl缓冲液配制浓度为40mg/mL的溶液，通过0.22μm过滤器过滤，采用强酸型阳离子交换树脂(SPFF)进一步纯化，选用柱管内径10mm，柱长20cm的玻璃柱，上样量为4mL，用pH为6.5、0.02M Tris-HCl缓冲液洗脱，流速1.0mL/min，离子交换层析图谱见图3所示，层析图中出现2个洗脱峰，重复进样并收集各洗脱峰组分，经浓缩、冷冻干燥，配成一定浓度的溶液，测定各组分峰的对枯草芽孢杆菌、曲霉菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果如图4所示，由图可知，组分III-1对枯草芽孢杆菌、曲霉菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，因此选择组分III-1进行进一步的分离纯化；

步骤6：将得到的组分III-1用蒸馏水配制成浓度为20mg/mL的溶液，通过0.22μm过滤器过滤，取滤液进反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行进一步的分离纯化，纯化条件为：色谱柱Cosmosil5C18-PAQ(10mm×250mm)，梯度洗脱条件：0-45min，流动相由0.1％(v/v)TFA逐渐转变为80％乙腈(含有0.1％(v/v)TFA)；洗脱速度：1mL/min，检测波长：215nm；结果如图5所示，得到纯度很高的一个峰，重复进样并收集洗脱峰组分，经浓缩、冷冻干燥，即得抗菌肽，用自动氨基酸测序仪测序，抗菌肽的氨基酸序列为HECEDCYSGCRNSCQH。抗菌肽的分子量为1.87Da。计算机模拟的等电点pI＝5.39。

上述抗菌肽的抑菌活性的测定方法为：取100μL洗脱峰组分至96孔酶标板中，再加入100μL无菌生理盐水，作为空白组；100μL酶解产物液加入96孔酶标板中，再加入100μL的用LB培养基稀释为1.0×10⁵CFU/mL的菌悬液，作为试验组；在96孔酶板上加入100μL无菌生理盐水，再加入用LB培养基稀释为1.0×105CFU/mL的菌悬液100μL，作为对照组。分别将空白组、试验组、对照组置于37℃恒温培养箱中培养12h，用酶标法测定620nm下的吸收率。抑菌率按以下公式计算：抑菌率(％)＝(对照组OD值-(试验组OD值-空白组OD值))/对照组OD值×100％。

试验例1：

小鼠急性经口毒性试验

采用最大耐受量法进行试验。昆明种小鼠18-22g，20只，雌雄各半。试验例1得抗菌肽配制成浓度为0.25g/mL混悬液。小鼠禁食不禁水16h，称重，间隔4h分别以0.3mL/10g进行灌胃，总剂量为15g/kg。立即观察并连续定时观察14d，记录小鼠中毒症状、死亡情况及出现时间。小鼠在14d观察期内，未见任何中毒反应并无死亡状况，表明试验例1得抗菌肽对小鼠经口最大耐受量大于15g/kg。据急性毒性分级标准，试验例1得抗菌肽被判定为无毒。

试验例2：

设立试验例1得抗菌肽为试验组1、抗菌肽+蛇床子素(摩尔比为1:1)为试验组2、抗菌肽+花椒毒酚(摩尔比为1:1)为试验组3、抗菌肽+紫花前胡素(摩尔比为1:1)为试验组4，将各试验组配制成浓度为0.5mg/mL的样液，按照实施例2的测定方法测各试验组的抑菌活性。抑菌效果如图6，发现，试验组1对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母、曲霉菌、金黄色葡萄球菌、炭疽菌均具有较好的抑菌效果，亦即抗菌肽具有较好的杀菌效果；试验组2-4对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母、曲霉菌、金黄色葡萄球菌、炭疽菌的抑菌效果优于试验组1，这说明抗菌肽和香豆素的合用具有提高抗菌肽抑菌活性的作用。

试验例3：

抗菌肽与香豆素的合用具有较强的协同作用，可以增强抗菌活性。一般而言，对微生物并用抗菌物质时的协同作用的定义是指显示出明显大于2种药的独自作用之和的作用的情况。作为评价有无协同作用的基准，可以根据2种药的最小抑菌浓度(MinimumIhibitoryConcentration,简称MIC)求出的FIC系数(fractional inhibitoryconcentration index)。具体为：

1)设立抗菌肽为试验组1、蛇床子素为试验组2、花椒毒酚为试验组3、紫花前胡素为试验组4、抗菌肽+蛇床子素(摩尔比为1:1)为试验组5、抗菌肽+花椒毒酚(摩尔比为1:1)为试验组6、抗菌肽+紫花前胡素(摩尔比为1:1)为试验组7、空白对照组；

2)采用微量二倍稀释法测定各试验组对枯草芽孢杆菌、曲霉菌、金黄色葡萄球菌、炭疽菌的MIC值。通过麦氏比浊法取处于对数生长期的致病菌，用MH肉汤培养基将菌液稀释至10⁵CFU/mL。将灭好菌的酶标板的每个孔中加入100μL的MH肉汤培养基，在第一孔中加入浓度为320μg/mL抗菌肽溶液100μL，然后对抗菌肽溶液进行二倍稀释，即，第一孔中加入抗菌肽液后用移液枪反复吹打四次使之与肉汤充分混匀，然后吸取100μL至第二孔中再充分吹打混匀，重复至最后一孔，第8列吸出100μL弃掉。使抗菌肽溶液浓度依次调节为：320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL，共做三次平行。依照同样方法处理试验组2-5，接着在一排孔中再加入100μL的MH肉汤培养基，作为阴性对照。在一排孔中加入100μL的菌液作为阳性对照。将希瓦氏菌的酶标板放入28℃的恒温箱，其余放入37℃的恒温箱子培养放置12h后，观察结果。若有菌生长，孔板底部会有白色沉淀。MIC值的判定：96孔板横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度为该抗菌肽液的MIC值。

3)FIC系数可以利用下式求出：

FIC系数＝A₁/A₀+B₁/B₀

A₀：A药单独使用的MIC；

A₁：A药、B药并用时的A药的MIC；

B₀：B药单独使用的MIC；

B₁：A药、B药并用时的B药的MIC；

基于FIC系数的并用效果的评价：FIC≤0.5：协同作用，0.5＜FIC≤1.0：相加作用；1.0＜FIC≤2.0：无关；2.0＜FIC：拮抗作用。

结果如表1所示，可以看出抗菌肽和蛇床子素、花椒毒酚、紫花前胡素的合用对枯草芽孢杆菌、曲霉菌、金黄色葡萄球菌、炭疽菌显示出FIC≤0.5的协同作用。

表1抗菌肽与香豆素的FIC系数

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 舟山市常青海洋食品有限公司

<120> 一种小黄鱼骨胶原抗菌肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 小黄鱼(Larimichthys polyactis)

<400> 1

His Glu Cys Glu Asp Cys Tyr Ser Gly Cys Arg Asn Ser Cys Gln His

1 5 10 15