阅读说明：本技术 淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体及其作为植物抑菌剂的应用 (The self-assembly that allicin is formed in starch and garlic and its application as plant bacteriostatic agent ) 是由 张黎明 彭巧玲 时文佳 何希宏 金雪芹 闫鹏超 戴玉杰 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体及其作为植物抑菌剂的应用,属于食品添加剂领域。通过碘结合实验证明淀粉与大蒜中大蒜素所形成的自组装体的形成,对淀粉-大蒜素自组装体进行热稳定性分析表明,自组装体的形成能很好的提高大蒜中大蒜素的热稳定性。抑菌实验发现自组装体对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,沙门氏菌具有良好的抑菌效果。可作为植物抑菌剂用于制备抑菌剂、防腐剂,此外亦可以作为抑菌剂用于饲料添加剂。淀粉-大蒜素自组装体产物具有良好的热稳定性和生物活性,且制备工艺简单,成本低来源广泛,无任何化学试剂的添加,材料均为常见的天然物质,无任何毒副作用,具有良好的应用前景。(The present invention relates to the self-assembly of allicin formation in starch and garlic and its as the application of plant bacteriostatic agent, belong to food additives field.It is formed by the formation of self-assembly by allicin in iodine Binding experiment proof starch and garlic, thermal stability analysis is carried out to starch-allicin self-assembly and shows that the formation of self-assembly can improve the thermal stability of allicin in garlic well.Bacteriostatic experiment finds self-assembly to Escherichia coli, staphylococcus aureus, and bacillus subtilis, salmonella is with good fungistatic effect.It can be used as plant bacteriostatic agent and be used to prepare bacteriostatic agent, preservative, furthermore can also be used for feed addictive as bacteriostatic agent.Starch-allicin self-assembly product has good thermal stability and bioactivity, and preparation process is simple, and at low cost from a wealth of sources, the addition of no any chemical reagents, material is common natural materials, without any side effects, has a good application prospect.)

淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体及其作为植物抑菌剂的 应用

本发明属于食品添加剂领域，也可用于饲料添加剂行业，具体设计淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体的制备及在作为植物抑菌剂在食品添加剂中的应用。

背景技术

现今，人们为了延长食品的储藏期限，常常在储藏过程中添加防腐剂，而随着社会的发展，人们越来越追求“绿色”环保，所以对于杀菌抑菌剂也更偏向于使用以天然植物作为原料开发的产品。大蒜为百合科(Liliaceae)葱属植物生蒜(Allium savitum L.)的地下鳞茎，半年生草本植物。研究表明，大蒜是一种良好的抑菌杀菌植物，其抑菌活性成分主要是大蒜中的有机硫化合物(Organosulfur compounds，OSCs)，OSCs通过与细菌中含硫的酶结合，清除氧化剂，抑制脂肪酸的氧化，阻止致发炎性因子的合成，从而抑制细菌生长，对G+和G-细菌均有抑制作用。大蒜素(Allicin)是OSCs中主要的化合物，是新鲜大蒜细胞破碎后，细胞内的蒜氨酸酶(Allinase)催化细胞膜外蒜氨酸分解成2-烯丙基次磺酸，并且进一步发生聚合反应所生成的。大蒜素对多种巯基依赖性酶系统存在抑制的效应(Marchese A，Barbieri R，Sanches-Silva A，et al.Antifungal and antibacterial activities ofallicin：a review[J].Trends in Food Science&Technology，2016，52：49-56)。然而由于大蒜素的化学性质极不稳定、易挥发、遇热极易分解，且具有较强的大蒜臭味和对皮肤黏膜有刺激性，极大地限制了其在食品工业中的应用。

分子的自组装是指分子与分子在一定条件下，依赖非共价键分子间作用力自发连接成结构稳定的分子聚集态的过程。分子自发地通过无数非共价键地弱相互作用力地协同作用是发生自组装的关键，包括氢键、范德华力、静电力、疏水作用力、π-π堆积作用，阳离子-π吸附作用等。分子自组装用途广泛，大分子自组装形成的高分子超分子体系是食品、医药、保健等多种领域的研究热点。

淀粉是由α-D-葡萄糖单体通过α-D-1，4糖苷键和α-D-1，6糖苷键构成多糖，属于高分子化合物，相对分子质量极大。在一定条件下，淀粉中不含支链的淀粉链能通过氢键形成右手螺旋结构，该螺旋结构的羟基均分布在螺旋外，内部形成疏水空腔，一些疏水性分子如脂肪酸、小分子芳香化合物等通过疏水作用能进入该螺旋空腔，进行自组装形成自组装体。另外在一定条件下淀粉中的螺旋空腔可以与I₃ ^-等离子，形成螺旋状络合物，在可见光波长450-700nm处有吸收，但如果体系中存在多种疏水性分子，可以产生竞争而削弱淀粉与碘离子的结合，利用这一性质可以验证自组装体的形成。淀粉与这些疏水性分子的自组装，能提高这些物质的稳定性，使其不易被氧化和分解，通过热分析，可以看到这一变化。

研究表明，利用淀粉分子中这些“内疏水，外亲水”的螺旋空腔结构，借用外界作用，使新鲜大蒜中的大蒜素能充分释放并进入空腔内部，可以形成淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体。例如公开号为107594406A的中国专利文献中，以马铃薯淀粉为载体，通过研磨法原味包埋了新鲜大蒜中的大蒜素，掩蔽了大蒜中不良风味并保护了大蒜中的活性成分。

淀粉大蒜素自组体的制作方法安全简单且能掩蔽不稳定有刺激性气味的大蒜素，使其具有良好的热稳定性。在一定条件下，自组装体中的大蒜素从螺线空腔里缓慢释放，能对环境体系中的微生物产生生长抑制或杀灭作用。

发明内容

本发明的目的在于扩展大蒜加工产品的应用范围，提供淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体在抑菌中的应用。

淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体的制备采用破壁法，具体包括如下步骤：筛选出组织完整，没有发芽，没有霉变的新鲜大蒜，去皮，洗净，晾干备用。按照大蒜(干基)∶淀粉∶蒸馏水质量比(g/g)为3∶1∶1～3∶2∶6的比例分别称取大蒜、淀粉和蒸馏水，并置于破壁机的容器中，在破壁机内破壁处理40～60min。所得样品再冷冻干燥、研磨粉碎、乙醇洗涤、真空干燥得淀粉-大蒜素自组装体。采用高效液相色谱法测定自组装体中大蒜素含量，根据大蒜素含量计算大蒜素包埋率。

本发明测定了按不同大蒜(干基)与淀粉比例制备的自组装体的碘结合特性，实验表明，随着大蒜比例增加，复合物中淀粉与碘的络合物的吸光性质降低，说明淀粉与大蒜中的大蒜素等疏水性分子发生了自组装，形成了自组装体。大蒜素通过进入淀粉中直链淀粉的螺旋空腔与淀粉发生类似碘与淀粉络合的反应。

本发明通过对原淀粉、淀粉对照、大蒜粉及复合物的热重分析表明，淀粉大蒜素自组装后能增加大蒜中大蒜素等物质的热稳定性。

本发明通过抑菌实验发现，淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体具有抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生长的作用。基于此，淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体可用于抑菌中。所述的淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体包括玉米淀粉、马铃薯淀粉和高直链淀粉包埋大蒜得到的淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体，这三种大蒜素淀粉自组装体能抑制大肠杆菌(Escherichia coli，G-)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，G+)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，G+)、沙门氏菌(Salmonella，G-)的生长。

淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体能降低大蒜的特殊刺激性味道，可添加进调味品中调节食品的风味的同时并兼具抑菌防腐作用。可用于果汁饮料、乳制品、糕点、零食等多种食品的风味调节并延长食品的保质期。与食品包装材料混合也可用于食品包装，防止外界微生物进入食物中，延长食品的货架期。

因此淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体可用于制备食品防腐剂和抑菌剂。

一种防腐剂和抑菌剂可以根据不同目的利用不同的淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体性质按不同比例的一种或多种添加，还可以包含其他食品上允许的添加剂。

本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明的特征在于产生抑菌作用的淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体对多种细菌具有良好的抑菌性能。抑菌实验证明淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体可不同程度抑制细菌生长，兼具防腐剂的作用。

(2)本发明的特征在于淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体为天然无毒的添加剂：淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体从材料到制备成品的过程中都未引入有毒有害试剂，材料价格低廉易得，可广泛添加进各种食品中，有效规避其他人工合成的有机试剂和无机试剂可能带来的毒害问题，提高食品加工和制造行业的安全系数。

(3)本发明的特征在于产生抑菌作用的淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体具有良好的热稳定性，且大蒜的刺激性气味低，在烹饪或加工过程中活性物质不易损失，能产生持久的抑菌活性。

(4)本发明的特征是淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体中还具有其他生物活性物质，具有一定的药理作用。

附图说明

图1大蒜素生物活性机理示意图

图2淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体的形成(A)及自组装体中大蒜素释放(B)过程。

图3淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体中大蒜素含量(A)玉米淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体(B)马铃薯淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体(C)高直链淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体(D)大蒜粉。

图4淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体的碘结合特性(A)玉米淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体(B)马铃薯淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体(C)高直链淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体。

图5淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体的热重图(A)玉米淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体(B)马铃薯淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体(C)高直链淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体。(a：淀粉；b：淀粉对照；c：大蒜粉；d：淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体)

图6淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体对四种细菌的抑菌圈图(A)大肠杆菌E.coli(B)金黄色葡萄球菌S.aureus(C)枯草芽孢杆菌B.subtilis(D)沙门氏菌S.typhimurium的抑菌圈图(a：玉米淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体b：马铃薯淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体；c：高直链淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体)

图7淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体的扫描电镜照片图(A)玉米淀粉-大蒜素自组装体(B)马铃薯淀粉-大蒜素自组装体(C)高直链淀粉-大蒜素自组装体

具体实施方式

下面结合附图详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

以下实验步骤应用于整个实施例中：

实验案例1

玉米淀粉-大蒜素自组装体的制备：筛选出组织完整，没有发芽，没有霉变的新鲜大蒜，去皮，洗净，晾干备用。先称取大蒜(干基)120g，玉米淀粉80g，再量取蒸馏水50mL，将大蒜、玉米淀粉、蒸馏水加入破壁机的容器中，在破壁机内破壁处理40min。所得样品再冷冻干燥、研磨粉碎、乙醇洗涤、真空干燥得玉米淀粉-大蒜素自组装体。制备的玉米淀粉-大蒜素自组装体中大蒜素含量为1.18±0.01μg/mg，包埋率为89.71±1.20％。

实施案例2

马铃薯淀粉-大蒜素自组装体的制备：筛选出组织完整，没有发芽，没有霉变的新鲜大蒜，去皮，洗净，晾干备用。先称取大蒜(干基)120g，马铃薯淀粉60g，再量取蒸馏水200mL，将大蒜、马铃薯淀粉、蒸馏水加入破壁机的容器中，在破壁机内破壁处理50min。所得样品再冷冻干燥、研磨粉碎、乙醇洗涤、真空干燥得马铃薯淀粉-大蒜素自组装体。制备的马铃薯淀粉-大蒜素自组装体中大蒜素含量为1.26±0.04μg/mg，包埋率为91.87±2.10％。

实施案例3

高直链淀粉-大蒜素自组装体的制备：筛选出组织完整，没有发芽，没有霉变的新鲜大蒜，去皮，洗净，晾干备用。先称取大蒜(干基)120g，高直链淀粉40g，再量取蒸馏水200mL，将大蒜、高直链淀粉、蒸馏水加入破壁机的容器中，在破壁机内破壁处理60min。所得样品再冷冻干燥、研磨粉碎、乙醇洗涤、真空干燥得高直链淀粉-大蒜素自组装体。制备的高直链淀粉-大蒜素自组装体中大蒜素含量1.41±0.01μg/mg，包埋率为89.01±2.90％。

实验案例4淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体的碘结合特性实验

分别精密称取大蒜粉10mg、淀粉对照10.0mg以及不同大蒜(干基)/淀粉质量比(1∶2、1∶1、2∶1、6∶1，g/g)的自组装体(固定每个样品中淀粉的总重量为10.0mg)置于试管中，分别加入5mL的NaOH溶液(1moL/mL)，在下水浴加热5min，使其混合均匀。待冷却至室温后，分别移取5.0mL的上清液到烧杯中，用1mol/mL的HCl溶液调pH值到3.5，然后加入0.5mL碘试剂(2％KI+0.2％I2溶液)显色。再将显色液转至50mL容量瓶中，用去离子水定容。用分光光度计在450-900nm的波长范围内进行扫描，得到碘结合特性谱图。

实验案例5淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体的热重分析

将原淀粉、淀粉对照、大蒜粉及自组装体(大蒜干基/淀粉质量比1∶1，破壁时间40min制备的自组装体)等样品在真空干燥箱中干燥24h待用。精确称取10～12mg样品置于铂金坩埚中，按起始温度20℃，终止温度600℃，升温速率10℃/min，氮气流速60mL/min进样分析，绘制温度和重量百分比的关系曲线。

实验案例6淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体的抑菌实验

(1)液体培养基的配制：分别称取5.0g酵母粉、5.0g蛋白胨、2.5g NaCl置于1L锥形瓶中，加500mL蒸馏水，待溶剂全部溶解后，用1mol/mL的NaOH调pH到7.1-7.3，用八层纱布塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，标记好放入灭菌锅内121℃，灭菌20min。另按上述液体培养基配制方法配制一份液体培养基，加入15％的琼脂粉，待溶剂完全溶解后用八层纱布塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，标记好放入灭菌锅内121℃，灭菌20min。

(2)大蒜素悬浊液的制备

使用电子天平准确称取6.0g按大蒜干基/淀粉质量比1∶1，破壁时间40min制备的自组装体样品于圆底烧瓶内，并加入44mL无菌蒸馏水。在50℃水浴搅拌1h，制得浓度为120mg/mL的淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体悬浊液。

(3)细胞悬浊液的制备

在无菌操作条件下，从斜面中取一环菌加入含有20mL液体的LB培养基的锥形瓶中，在转速160r/min，温度为37℃的摇床条件下培养20h，见菌液浑浊后，将菌液用LB培养基液稀释，用紫外分光光度计测量活菌稀释液OD值，使其稀释液OD_600nm为0.1，即菌量约1～2×10⁸CFU/mL。取100μL已稀释菌液加入到2.9mL培养基中制得菌悬液备用。

(4)淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体对细菌的抑菌直径测定实验

按无菌操作要求，将配制好的固体培养基加热溶解，冷却至50℃左右，按1∶100的比例将稀释后的菌液加入未凝固的培养基中，混合均匀。将混合均匀后的培养基倒入玻璃培养皿中，每个培养皿15mL左右，待其冷却凝固。用无菌铁筒在平板内琼脂中间打一直径10.0mm的孔，小心用灭菌镊子夹取培养基小块做成圆孔，往孔中填入0.1g样品，4℃预扩散2h，将平板倒扣培养18-24h，观察，测定抑菌圈直径，重复3次取平均值，结果见表1。

表1 3种自组装体对4种细菌的抑菌直径

(5)淀粉与大蒜中大蒜素形成的自组装体的最低抑菌浓度(MIC)测定实验：

在无菌条件下取9支无菌试管，各加入5mL灭菌LB培养基。然后取5mL制备的样品悬浊液(60mg/mL)加入第一支试管，混匀后从第一支试管中吸取5mL混合液加入第二支试管，混匀后在第2支试管中取5mL到第3支试管，重复上述步骤依次连续稀释至第7支试管，从第7支试管中弃除5mL混合液体，第8，9支试管中分别加入5mL生理盐水和5mL青霉素作为阴性对照和阳性对照，并弃除5mL混合液体，使1-7支试管中淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体的浓度为30、15、7.5、3.8、1.9、1.0和0.5mg/mL。最后分别向8，9支试管中加入0.1μL菌悬液(每支试管菌液浓度约为1×10⁵CFU/mL)。将试管置于37℃恒温培养20h，肉眼可见试管中所能见完全抑制细菌生长的最低抑菌浓度为淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体的最小抑菌浓度(MIC)，结果见表2。

表2 3种自组装体对4种细菌的最小抑菌浓度

据后期观察，10d后所有样品试管中含淀粉与大蒜中大蒜素的自组装体的浓度为30和15mg/mL的试管仍澄清无细菌生长。

上述实施案例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施案例限制，其他的未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。