一种树鼩外周血单个核细胞的分离方法
阅读说明：本技术 一种树鼩外周血单个核细胞的分离方法 (Separation method of tree shrew peripheral blood mononuclear cells ) 是由 唐安洲 夏巍 陈泓霖 李骅 冯清源 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种树鼩外周血单个核细胞的分离方法,主要涉及细胞分离技术领域。包括采用不同密度分离溶液的梯度离心方法,对树鼩稀释抗凝全血细胞成份进行分离,并获得PBMC。本发明有益效果在于：1、提供合适的树鼩PBMC分离密度及相应的分离溶液配制方法,以便快速获得数量多、纯度高的树鼩PBMC；2、当需要获得树鼩外周血中所有白细胞(包括PBMC)成份时,本发明也给出了使用不同体积的红细胞裂解液对树鼩外周血进行直接裂解的效果评价,为树鼩外周血免疫细胞的获取及相关研究提供了参考。(The invention discloses a separation method of tree shrew peripheral blood mononuclear cells, and mainly relates to the technical field of cell separation. Involving the use of different densities And (3) separating the diluted anticoagulated whole blood cell components of the tree shrew by a gradient centrifugation method of the separation solution, and obtaining the PBMC. The invention has the beneficial effects that: 1. providing suitable density of PBMC separation of tree shrews and corresponding A separation solution preparation method is adopted so as to rapidly obtain the tree shrew PBMCs with large quantity and high purity; 2. when all white blood cell (including PBMC) components in the tree shrew peripheral blood need to be obtained, the invention also provides the effect evaluation of direct lysis of the tree shrew peripheral blood by using erythrocyte lysate with different volumes, and provides reference for the acquisition of tree shrew peripheral blood immune cells and related research.)
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，具体是一种树鼩外周血单个核细胞的分离方法。
背景技术
树鼩(Tupaia Belangeris)是一种类似于松鼠的小型哺乳动物，属于小型灵长类，主要发现于南亚、东南亚。根据中国科学院昆明动物研究所的遗传分析，发现树鼩在神经系统和免疫系统方面与人类高度相似。研究表明，树鼩的免疫反应较啮齿动物更接近人类。当暴露于多种人类病原体时，树鼩表现出类似于人类感染的临床症状。
外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，是细胞免疫学研究中最常见的细胞模型。将树鼩用作实验动物模型以获得PBMC并进行体外研究，这在人类免疫性疾病的发病机制和治疗中具有重要的现实意义。
但是，现有技术的方法和试剂的应用中，没有关于树鼩PBMC分离的参考方法和相应试剂，在现实工作中，研究人员不得不选择其它物种的分离液进行分离，但是由于物种之间的差异性，其所获得的树鼩PBMC的浓度和纯度都不甚理想，这一方面会增加树鼩采血需求，损害动物福利；一方面也阻碍了树鼩免疫细胞相关的进一步研究。
发明内容
提供合适的树鼩PBMC分离密度及相应的分离溶液配制方法，以便它能够快速获得高纯度数量多、纯度高的树鼩PBMCs；此外，当需要获得树鼩外周血中所有白细胞(包括PBMC)成份时，本发明也给出了，给出使用不同体积的红细胞裂解液对树鼩外周血进行直接裂解的效果评价的影响，为高质量的树鼩PBMCs外周血免疫细胞的获取及人类免疫系统相关的研究提供了参考。本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种树鼩外周血单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：
步骤1，采集树鼩静脉血，抗凝处理后，与全血稀释液等比例混合，得树鼩稀释抗凝全血；
步骤2，使用原液和8.5％NaCl溶液按照9:1体积比混合以达到生理渗透压，即得100％溶液；
步骤3，基于100％溶液和0.85％NaCl溶液配得浓度在55％-63％范围内的低浓度生理盐水溶液和浓度在60％-70％范围内的高浓度生理盐水溶液，低浓度生理盐水溶液的浓度比高浓度生理盐水溶液的浓度低；
步骤4，使用无菌的胎牛血清，自下而上通过高浓度生理盐水溶液和低浓度生理盐水溶液获得密度分层的清晰界面，缓慢加入树鼩稀释抗凝全血，离心25min，得到包含有粒细胞层的多层分层。
进一步的，还包括步骤5，对应粒细胞层吸取粒细胞。
进一步的，所述步骤3具体包括，基于100％溶液和0.85％NaCl溶液配得67％生理盐水溶液和60％生理盐水溶液；
所述步骤4具体包括，使用无菌的胎牛血清，自下而上通过67％生理盐水溶液和60％生理盐水溶液获得密度分层的清晰界面，缓慢加入树鼩稀释抗凝全血，离心25min，得自上而下的血浆和PBS层、PBMC层、分离层、粒细胞层、分离液层、红细胞层。
进一步的，所述采血过程在30s之内。
进一步的，整个操作过程的温度控制在18～25℃，操作时间控制在4h以内。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
本方法所用的树鼩股静脉采血方法与密度梯度离心法相结合，采用高浓度和低浓度分离溶液的不连续密度梯度离心方法，成功分离出树鼩粒细胞。可用于从树鼩静脉血中分离外周血单个核细胞。
附图说明
附图1是树鼩外周血在分离液中的离心结果。
图1中：a：50％浓度离心结果；
b：55％浓度离心结果；
c：60％浓度离心结果；
d：63％浓度离心结果；
e：70％浓度离心结果。
附图2是密度梯度离心后细胞Wright-Giemsa染色(×400)。
图2中：a：60％浓度分离液离心后PBMCs层细胞涂片染色；
b：63％浓度分离液离心后PBMCs层细胞涂片染色。
附图3是60％及67％浓度工作液不连续密度梯度离心。
图3中：a：不连续密度梯度离心后结果；
b～d：下层细胞Wright-Giemsa染色。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：建立从实验树鼩外周血中分离单个核细胞的方法及验证
1材料与方法
1.1实验动物采用昆明医科大学实验动物中心人工繁育和人工养殖的滇缅种成年树鼩，饲养于广西医科大学实验动物中心普通级树鼩饲养房中，单笼饲养，室内温度(24±1)℃，相对湿度40％～50％，人工照明12h/d。每天定期清洁粪便，喂食营养颗粒面包虫、水果，自由饮水。本研究动物实验遵守“3R”原则。
1.2主要试剂和仪器分离液(Sigma，美国)；Hanks平衡盐溶液(Solarbio，北京)；全血和组织稀释剂(Solarbio，北京)；红细胞裂解液(×10)(BD，美国)；Wright-Giemsa染料络合物溶液(Solarbio，北京)。台式高速低温离心机(eppendorf5810R，德国)；荧光正置显微镜(奥林巴斯，日本)。
1.3血样采集树鼩禁食12h后，于清醒状态下经股静脉采血2～2.5mL，血液置于含有EDTA的抗凝采血管中，混匀。
1.4密度梯度离心法分离PBMCs
将原液和8.5％NaCl溶液按照9:1体积比混合以达到生理渗透压，即为100％溶液(1.127g/mL)。在此基础上，添加不同比例的0.85％NaCl溶液将其配成50％、55％、60％、63％、67％、70％的生理盐水溶液。将生理盐水溶液加入15mL离心管中，然后沿管壁缓慢加入1mL与全血稀释液等比混合的稀释抗凝全血，离心25min。观察分层情况、拍照。转移至新的15mL离心管中，加入10mL不含Ca2+、Mg2+的Hanks平衡盐溶液，离心10min，弃上清。加入100μLHanks平衡盐溶液并充分混合。取4μL细胞悬液，显微镜下计数。取4μL细胞悬液制作细胞涂片。
用无菌的胎牛血清浸湿15mL离心管，然后用巴氏管轻轻去除多余的血清，用注射器取1mL的67％生理盐水溶液，沿管壁注入，再用另一注射器吸取60％生理盐水溶液，沿管壁注入，以形成从高密度分层到低密度分层的清晰界面；缓慢加入1mL稀释的抗凝剂血液，离心25min。观察分层情况、拍照。小心吸取淋巴细胞层和粒细胞层，并用Hanks平衡盐溶液洗涤两次。取4μL细胞悬液制作细胞涂片。
1.5 Wright-Giemsa染色涂抹后自然晾干。干燥后，固定甲醇30min，然后风干。加入2滴Wright-Giemsa染色溶液以覆盖整个样品并染色2min。滴加等量pH＝6.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或超纯水，轻轻摇动玻片，用Wright-Giemsa染液染色5min。纯水洗、吸干、在正置光学显微镜下观察结果。
1.6树鼩外周血红细胞的裂解用蒸馏水将10×BD红细胞裂解液稀释至1×，并在黑暗中保存。抽取2mL树鼩外周血，均分为4份，分别加入4倍体积、6倍体积、8倍体积、10倍体积的1×红细胞裂解液，混匀后室温避光裂解10min，计算细胞数。分析获得的白细胞数量并进行比较，以获得更合适的裂解液体积比。
2结果
2.1不同浓度的分离液密度梯度离心结果50％的分离液仅将试管中的液体分为3层，没有云雾状的单个核细胞层；55％、60％和63％的分离液将树鼩外周血分为4层，从上到下为血浆和血液稀释液层、单个核细胞层、分离液层和红细胞层，其中63％分离液离心后单个核细胞层中肉眼可见明显的红细胞污染；使用分离液后，血液与分离液无法清晰分离，只能看到血浆和PBS层的分离，见图1。随着分离液密度的增加，分离的白细胞数量增加，见表1。
表1不同密度分离液中细胞计数
2.2 PBMC层的细胞数量和组成工作液分离的细胞数少于工作液，中性粒细胞稀有，见图2。随着工作液的比重的增加，分离细胞中嗜中性粒细胞和红细胞的污染也增加。
60％及67％浓度工作液密度梯度离心后，可见分为6层，从上到下为血浆和PBS层、PBMC层、分离层、粒细胞层、分离液层、红细胞层，其中粒细胞层可见各种粒细胞和大量的红细胞，见图3。
2.3不同体积红细胞裂解液对树鼩外周血红细胞裂解作用的影响随着裂解液体积的增加，裂解后的细胞数量减少，见表2。6倍体积裂解液与8倍体积裂解液裂解后所得细胞数比较，P＝0.061，可以认为在白细胞数较少的前提下可以获得更佳的红细胞裂解效果，因此8倍体积裂解液为最佳体积比。
表2不同体积红细胞裂解液裂解后细胞计数
3讨论
人的红细胞相对密度为1.093，粒细胞的相对密度为1.092，单个核细胞的相对密度1.076～1.090，因此国内外常用的淋巴细胞分离液的相对密度为(1.077±0.001)g/mL。为了分离动物PBMC，国内外科学家通常使用密度为(1.077±0.001)g/mL和(1.083±0.001)g/mL的分离液。其中，小鼠和大鼠通常使用密度为(1.083±0.001)g/mL的分离溶液来分离淋巴细胞。为了分离大型哺乳动物中的PBMCs，研究人员经常使用1.077密度的分离液。例如，2009年，Kuldova等[13]从猪和山羊血液中分离出PBMCs；2009年，韩忠燕等[14]分离牛PBMCs；2010年，胡永波等[15]从伊犁马、新疆驴、各种犬种、新疆双峰驼、天山马鹿和荣昌猪中分离出动脉血PBMCs。
本研究中，使用5种不同密度的分离液对树鼩外周静脉血PBMCs进行分离，其中密度为1.064g/mL(50％)和1.090g/mL(70％)明显分离失败，1.071～1.083g/mL发现，随着分层溶液密度的增加，白细胞分离的数量增加，但颗粒细胞污染的情况加重。1.077g/mL(60％)密度的分离液在同等实验条件下最适于分离树鼩静脉血PBMCs。用1.077和1.086g/mL(67％)密度的分离液对树鼩静脉血进行不连续密度梯度离心时，发现两层分离液之间的浑浊白细胞层富含各种粒细胞，可用此方法分离树鼩粒细胞。
为了提高分离PBMCs分离的效果，根据本实验积累的经验，应注意以下实验细节：(1)凝血会导致PBMCs分离失败，因此完成采血过程的时间尽可能少于30s；(2)离心温度过低，导致红细胞和颗粒细胞掺入PBMCs层造成分界不清晰及污染，确保在18～25℃内完成实验；(3)血液在室温下长期存放会影响PBMCs的活性，如果需要在实验室中培养PBMC，须在4h内完成PBMCs的分离。
综上，在没有专用试剂的情况下，分离树鼩的外周血中的单核细胞可以使用密度为1.077的分离液或者密度相同的人淋巴细胞分离液，而人淋巴细胞分离液则更加价廉物美。本文所用的树鼩股静脉采血方法与密度梯度离心法相结合，从树鼩静脉血获得外周血淋巴细胞相对简单、快速，无需处死动物，提高动物利用率，减少对动物的伤害，并且更符合“3R”原则。
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