一种体外高效诱导人外周MDSCs分化和扩增的方法
阅读说明：本技术 一种体外高效诱导人外周MDSCs分化和扩增的方法 (Method for efficiently inducing differentiation and amplification of human peripheral MDSCs in vitro ) 是由 祁荆荆 李霞 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种体外高效诱导人外周MDSCs分化和扩增的方法,所述诱导方法如下：将人外周单核细胞置于加入人GM-CSF和IL-6各80 ng/ml的含10%FBS的RPMI-1640完全培养液,于5%CO-(2)、37℃恒温培养箱中培养14天。培养体系稳定、诱导效率高,可诱导单核细胞高效分化为CD33～(+)MDSCs(68.48±8.174)；特异性强,诱导出的CD33～(+)MDSCs可显著抑制T细胞增殖与活化；成本较低,相比人AB血清,胎牛血清价格低廉；操作简便,人外周血取材丰富且方便,细胞培养易于操作。(The invention discloses a method for efficiently inducing differentiation and amplification of human peripheral MDSCs in vitro, which comprises the following steps: human peripheral monocytes were placed in 10% FBS-containing RPMI-1640 complete medium supplemented with 80 ng/ml each of human GM-CSF and IL-6 in 5% CO 2 And culturing in a constant temperature incubator at 37 ℃ for 14 days. The culture system is stable, the induction efficiency is high, and the monocyte can be induced to be efficiently differentiated into CD33 + MDSCs (68.48 ± 8.174); strong specificity, induced CD33 + MDSCs can obviously inhibit the proliferation and activation of T cells; the cost is low, and compared with human AB serum, the fetal calf serum is low in price; simple operation, abundant and convenient human peripheral blood, and easy operation of cell culture.)
技术领域
本发明涉及细胞与分子免疫学领域，尤其涉及一种体外高效诱导人外周MDSCs分化和扩增的方法。
背景技术
髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）是骨髓来源的未成熟髓系异质细胞群。早期研究发现，肿瘤患者体内累积大量MDSCs，可通过产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、精氨酸酶（arginase, ARG）-1和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）等因子有效地抑制T细胞功能，导致患者免疫功能低下，促进肿瘤细胞免疫逃逸。然而，越来越多的研究发现，感染、肥胖和自身免疫病等多种疾病中MDSCs也显著增加并发挥重要作用。虽然MDSCs的一个重要特征是抑制T细胞增殖，但不同疾病中复杂的微环境可导致MDSCs表现出复杂多变的免疫学特征。
通常认为，小鼠MDSCs标志为CD11b+Gr-1+，人MDSCs标志为Lin-HLA-DR-CD11b+CD33+。CD33是一种唾液酸糖蛋白，表达于人髓系细胞表面，是鉴定人MDSCs的重要表面标志，且靶向CD33可清除人MDSCs。但仅用表面标志仍无法将MDSCs与单核细胞及中性粒细胞明确区分开，因此免疫抑制功能检测对于体外鉴定MDSCs不可或缺。目前，利用疾病模型可顺利开展体内外动物实验，以探究MDSCs在不同疾病模型中的作用及机制。
研究表明，MDSCs的产生与扩增受多种信号调控，其中粒细胞巨噬细胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）、粒细胞集落刺激因子（granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF）及巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）等信号分子可促进未成熟髓系细胞扩增；干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)、白细胞介素-1β (interleukin, IL-1β)及IL-6等炎症因子和危险相关信号分子则促使MDSCs异常活化。目前，体外诱导MDSCs分化和扩增的方法基本上有如下几种：
（1）以小鼠GM-CSF和IL-6各40ng/ml共同刺激培养小鼠骨髓细胞4天后，即可诱导产生大量MDSCs，是体外扩增培养小鼠MDSCs的标准实验方法。
（2）用加入人GM-CSF和IL-6各10 ng/ml的含10% FBS的RPMI 1640完全培养液培养人外周血单个核细胞（PBMCs）7天，可诱导出具有免疫抑制特性的CD33+ MDSCs，但是诱导效率较低；
（3）用加入人GM-CSF和IL-6各10 ng/ml的含10%人AB血清的RPMI 1640完全培养液培养人外周CD14+单核细胞 6天，可诱导出较高比例CD33+ MDSCs（>99%），但人AB血清价格较高，是同等体积FBS价格的10多倍，研究中并不常用。
综上所述，目前人MDSCs体外大量扩增技术仍不成熟，使得对于MDSCs在临床疾病中作用及机制研究的开展受限。因此，亟待探究出一种人MDSCs体外高效分化与扩增的方法，以满足更深入的临床实验研究。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种体外高效诱导人外周MDSCs分化和扩增的方法。
本发明的技术解决方案是：一种体外高效诱导人外周MDSCs分化和扩增的方法，是将人外周单核细胞置于培养液，于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养，所述培养液是加入人GM-CSF和IL-6的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液，其特征在于：所述人GM-CSF和IL-6的加入量均为80 ng/ml，所述培养时间是14天。
本发明采用加入人GM-CSF和IL-6各80 ng/ml的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液，于5% CO2、37℃恒温培养箱中对人外周单核细胞培养14天，所诱导出的CD33+ MDSCs特异性强，可显著抑制T细胞增殖与活化；即使采用相比人AB血清价格低廉的胎牛血清，依旧具有较高的诱导效率，诱导单核细胞高效分化为CD33+ MDSCs（68.48±8.174）。
附图说明
图1是不同浓度诱导剂培养人外周单核细胞7天，诱导单核细胞分化为CD33+MDSCs流式代表图及统计结果示意图。
图2和图3是相同浓度诱导剂培养人外周单核细胞不同时间，诱导单核细胞分化为CD33+ MDSCs流式代表图及统计结果示意图。
图4是本发明实施例与现有技术诱导人外周单核细胞分化为CD33+ MDSCs统计结果示意图。
图5是本发明实施例诱导的CD33+ MDSCs抑制T细胞增殖流式代表图及统计结果示意图。
图6是本发明实施例诱导的CD33+ MDSCs抑制T细胞分泌IFN-γ流式代表图及统计结果示意图。
具体实施方式
本发明的一种体外高效诱导人外周MDSCs分化和扩增的方法，是将人外周单核细胞置于培养液，于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养14天，所述培养液是加入人GM-CSF和IL-6的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液，其中人GM-CSF和IL-6的加入量均为80 ng/ml，培养期间第5天及第10天换一次新鲜培养液。
实验：
1. 不同浓度诱导剂培养人外周单核细胞7天
将人外周单核细胞置于培养液，于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养7天，所述培养液是分别加入不同浓度人GM-CSF和IL-6的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液，培养期间第4天换一次新鲜培养液，所述人GM-CSF和IL-6的加入量分别是10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml及80 ng/ml。
培养7天后，收集细胞于15 ml离心管中，加满PBS，300 g离心5 min，弃上清；以2ml PBS重悬细胞，计数；取5×104个细胞于流式管中，以加入2 μl anti-human CD33 Alexa647（Biolegend, clone P67.6）的50 μl PBS重悬细胞，室温避光孵育15 min；以3 ml PBS洗涤细胞，然后用100 μl PBS重悬细胞，并于流式细胞仪上检测CD33+细胞百分比。结果如图1所示。
图1中从左至右依次是10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml及80 ng/ml诱导剂诱导人外周单核细胞分化为CD33+ MDSCs流式代表图及统计结果示意图。
图1结果表明：人外周单核细胞培养7天，CD33+ MDSCs的百分比并不随诱导剂浓度的增加而升高，诱导剂浓度为40 ng/ml时，CD33+ MDSCs的百分比最小，而诱导剂浓度为10ng/ml和80 ng/ml时，CD33+ MDSCs的百分比相当。
2. 相同浓度诱导剂培养人外周单核细胞不同时间
2.1将人外周单核细胞置于培养液，于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养7天、14天和21天，所述培养液是加入人GM-CSF和IL-6各10 ng/ml的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液，培养期间每4/5天换一次新鲜培养液。
培养结束后，分别收集细胞于15 ml离心管中，加满PBS，300 g离心5 min，弃上清；以2 ml PBS重悬细胞，计数；取5×104个细胞于流式管中，以加入2 μl anti-human CD33Alexa 647（Biolegend, clone P67.6）的50 μl PBS重悬细胞，室温避光孵育15 min；以3ml PBS洗涤细胞，然后用100 μl PBS重悬细胞，并于流式细胞仪上检测CD33+细胞百分比。结果如图2所示。
图2中从左至右依次是培养7天、14天及21天人外周单核细胞分化为CD33+ MDSCs流式代表图及统计结果示意图。
图2结果表明：人外周单核细胞在加入人GM-CSF和IL-6各10 ng/ml的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液中，CD33+ MDSCs的百分比并不随培养天数的增加而升高，相反还呈下降趋势，即CD33+ MDSCs的百分比随着培养天数的增加而下降。
2.2将人外周单核细胞置于培养液，于5% CO2、37℃恒温培养箱中培养7天、14天和21天，所述培养液是加入人GM-CSF和IL-6各80 ng/ml的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液，培养期间每4/5天换一次新鲜培养液。
培养结束后，分别收集细胞于15 ml离心管中，加满PBS，300 g离心5 min，弃上清；以2 ml PBS重悬细胞，计数；取5×104个细胞于流式管中，以加入2 μl anti-human CD33Alexa 647（Biolegend, clone P67.6）的50 μl PBS重悬细胞，室温避光孵育15 min；以3ml PBS洗涤细胞，然后用100 μl PBS重悬细胞，并于流式细胞仪上检测CD33+细胞百分比。结果如图3所示。
图3中从左至右依次是培养7天、14天及21天人外周单核细胞分化为CD33+ MDSCs流式代表图及统计结果示意图。
图3结果表明：人外周单核细胞在加入人GM-CSF和IL-6各80 ng/ml的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液中，CD33+ MDSCs的百分比并不随培养天数的增加而升高，而是培养14天CD33+ MDSCs的百分比最高，而培养21天CD33+ MDSCs的百分比反而下降。
3. 现有技术与本发明实施例结果对比
上述2.1培养14天（现有技术）和2.2培养14天（本发明实施例）CD33+ MDSCs百分比的结果对比示意图如图4所示。
图4结果表明：本发明实施例可诱导人单核细胞稳定分化为较高比例的CD33+ MDSCs (68.48±8.174)，其转化率远高于现有技术。
4. 本发明实施例的CD33+ MDSCs细胞抑制T细胞增殖与活化
取外周血单个核细胞（PBMCs）并标记CFSE；CFSE标记的PBMCs单独或与本发明实施例培养并纯化的CD33+细胞以2：1比例，用加入anti-human CD3和anti-human CD28各2 μg/ml的含10% FBS的RPMI-1640完全培养液完全培养液，于96孔培养板中共培3天。
收集并洗涤细胞，以含PMA（0.1 μg/ml）、Ionomycin（5 μg/ml）和BFA（25 μg/ml）的100 μl RPMI-1640完全培养液重悬细胞，于细胞培养箱中刺激培养4 h，洗涤；先标记表面抗体anti-human CD3 PerCP；用细胞固定破膜液，避光固定破膜，洗涤；加入anti-humanIFN-γ APC，避光孵育30 min，洗涤；采用流式细胞术检测CD3+ T细胞增殖及CD3+IFN-γ+ T细胞比例，结果如图5和6所示。
本发明实施例诱导的CD33+ MDSCs抑制T细胞增殖流式代表图及统计结果示意图如图5所示。
本发明实施例诱导的CD33+ MDSCs抑制T细胞分泌IFN-γ流式代表图及统计结果示意图如图6所示。
图5和图6结果表明：本发明实施例所得到的CD33+ MDSCs细胞特异性强，可显著抑制T细胞增殖与活化。
本发明所用人外周单核细胞来源如下：
经大连医科大学医学伦理委员会批准，在志愿者知情同意的情况下，取健康人新鲜全血，用Ficoll法分离外周血单个核细胞（PBMCs）；将PBMCs接种于细胞培养瓶中，在恒温培养箱中静置2小时，去除悬浮细胞；用加入诱导因子的培养液，于培养箱中培养即可。