猪血小板裂解液及其制备方法
阅读说明：本技术 猪血小板裂解液及其制备方法 (Porcine platelet lysate and preparation method thereof ) 是由 于童 潘欠欠 罗鹏飞 朱娜娜 项天宇 马洋洋 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及细胞生物学领域,特别涉及一种猪血小板裂解液及其制备方法。该制备方法包括：将从猪全血中采集到的血小板重悬于已离心去除纤维蛋白原的猪血浆中,经反复冻融,离心后收集上清,上清液经过滤器进行过滤除菌,滤过液即为猪血小板裂解液。本发明以猪血液为来源制备血小板裂解液,减少异源血清造成的异种蛋白残留风险,减少可能存在的未知牛内源性传染病对培养猪细胞产生影响的隐患。(The invention relates to the field of cell biology, and particularly relates to a porcine platelet lysate and a preparation method thereof. The preparation method comprises the following steps: and (2) suspending the platelets collected from the pig whole blood in the pig plasma which is centrifuged to remove fibrinogen, repeatedly freezing and thawing, centrifuging, collecting supernatant, filtering and sterilizing the supernatant by a filter, and obtaining filtrate which is the pig platelet lysate. The invention prepares the platelet lysate by taking the pig blood as a source, reduces the risk of foreign protein residue caused by heterologous serum, and reduces the hidden danger that the possibly existing unknown cattle endogenous infectious diseases have influence on the cultured pig cells.)
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种猪血小板裂解液及其制备方法。
背景技术
血小板是血液的一种成分，在血管损伤出血时发生凝血级联反应，从而形成血凝块，在伤口愈合与组织再生中起重要作用。血小板中储存的凝血因子和一系列生物活性物质、各种趋化因子和生长因子主要存在于α-颗粒中，如血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGFAA、-AB和-BB)、转化生长因子-β(Transforming growthfactor-β,TGF-β)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor,IGF-1)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)等。血小板激活后，释放各种免疫分子、细胞因子和趋化因子，刺激巨噬细胞和粒细胞发生免疫反应促进伤口愈合，并且bFGF、EGF和VEGF等生长因子的刺激和抑制作用促进了成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的迁移和增殖，使得血管得以重塑和组织开始修复。
血小板裂解液(Platelet Lysate,PL)是浓缩血小板(Platelet concentrate,PC)在各种物理或化学处理方式下使血小板颗粒裂解，内容的诸多生长因子释放。随着再生医学和细胞疗法的发展，细胞培养的要求也在相应增加。除了人以外，各种模式动物的细胞培养要求也在相应增高。相同物种的PL可以有效避免异种间的异源感染问题。2018年爆发非洲猪瘟对地方猪遗传资源安全造成重大威胁，为避免猪遗传资源丢失，国家大力推进地方猪遗传资源保护工作，其中很重要的一项便是保存猪体细胞，以便于在未来可以通过体细胞克隆与胚胎移植技术重新建立良好的地方猪种质资源。然而保存体细胞涉及细胞分离培养，目前为止多选用胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)分离培养猪的体细胞，然而在未来对体细胞进行克隆与移植将会产生异种免疫反应。
目前文献中出现最多的是人血小板裂解液(Human platelet lysate,HPL)，且大部分HPL制备原料来源于血液中心机采浓缩血小板，部分研究采用手工分离血小板方法，富血小板血浆法(platelet rich plasma,PRP)和白膜法(buffy coat,BC)。两种方法均经过两次离心，不同的是离心速度的不同，各个研究中离心速度范围在100g-3200g之间，差异十分明显。以往研究中动物浓缩血小板的分离一般均参考人浓缩血小板的分离的方法，但是这些方法、标准不见得适用于猪和其他哺乳动物。
现有专利均围绕人血小板裂解液的制备方法，其中专利申请CN104307208A包含了大鼠小鼠的血小板分离，均未涉及猪血小板裂解液(Porcine Platelet Lysate,PPL)的制备方法。在很多血小板裂解液的制备方法中，在含PL的培养基中加入2IU/mL的肝素，以防止培养基的凝胶化。但近期研究表明肝素会影响细胞生长，而在PL中直接添加氯化钙可能会降低PL中生长因子含量。如何制备猪血小板裂解液，并将其用于体外的细胞培养，是目前需要研究的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种猪血小板裂解液及其制备方法。本发明方法成功制备猪血小板裂解液，填补了猪血小板裂解液制备方法的空白。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种猪血小板裂解液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集猪血小板和猪血浆；
(2)离心去除步骤(1)中猪血浆中的纤维蛋白原；
(3)将猪血小板重悬于已离心去除纤维蛋白原的血浆中；
(4)将步骤(3)得到的样品反复冻融，离心后收集上清液，即为血小板裂解液。
优选地，所述步骤(1)包括以下步骤，
a.选取健康待宰生猪，在屠宰时收集血液；
b.将步骤a采集的抗凝猪血液转移到第一离心管中，离心观察到血液分层；
c.取第一离心管中部分富血小板血浆(PRP)层转移到第二离心管中；
d.将步骤c取完部分PRP层剩余的液体，按照1:1的比例添加缓冲液，将离心管倒置混匀；对离心管进行离心，将上清液转移到另一离心管中；
e.将步骤d中离心管得到的上清液体进行富集、并离心，得到血小板；
f.对第二离心管中液体进行富集、并离心，得到血小板和血浆；
g.将上述步骤e或步骤f得到的血小板冷冻保存。
优选地，所述猪血小板裂解液的制备方法步骤(4)中，在-80℃和4℃条件反复冻融2-5次。
优选地，所述步骤b)、步骤d)离心条件为以100-200g离心15-20min；步骤e)、步骤f)离心条件为在20-22℃下以2500-3200r离心15-30min。
优选地，将步骤f得到的血浆过滤除菌，冷冻保存；优选地，将步骤f得到的血浆经0.22μm滤器过滤除菌。
优选地，在步骤a收集血液，将抗凝剂与血液以28:200的比例混匀。；优选地，所述抗凝剂为CPDA-1枸橼酸钠类抗凝剂。
优选地，步骤(3)中所述去除纤维蛋白原采用的物质为无机钙化合物，优选为氯化钙；优选地，血浆中CaCl2添加浓度为9.3-21.7mmol/L。
在一个实施例中，提供了上述任一项所述的制备方法制得的猪血小板裂解液。
在另一个实施例中，采用上述任一项所述制备方法制得的血小板裂解液培养细胞。
本发明提供一种猪血小板裂解液的制备方法，该方法将血小板和血浆的制备单独分开，并发现了最适浓度的血小板裂解物浓度，去除血浆中纤维蛋白原，提高生长因子含量，减少血小板的活化，提高了血小板裂解液的质量。
附图说明
图1从猪全血中分离血小板的流程图；
图2血浆凝固程度；
图3以标准品制作内毒素标准曲线，两条虚线间为测得血小板裂解物产品内毒素含量范围。
具体实施方式
本发明公开了一种血小板裂解液的制备方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的血小板裂解液的制备方法及其应用中所用仪器或试剂均可由市场购得。
HEP缓冲液的配置方法如下：
将上述组分加入到800mL双蒸水中，加热溶解，用2N NaOH调节溶液pH至7.4，双蒸水定容至1000mL，0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。
CPDA-1抗凝剂配制方法如下：
组成：
将上述组分加入到800mL双蒸水中，加热溶解，用2N NaOH调整pH至7.4，双蒸水定容至1000mL，0.22μm的微孔滤器过滤，4℃保存备用。
在本发明的提供的一个施例中，从猪全血中采集血小板包括以下步骤，流程参考图1：
a)选取健康待宰生猪，促凝管采集血液，收集血清，进行传染病检测。b)预先将100-130mL CPDA-1抗凝剂添加至采血瓶中，每头猪在屠宰时收集1-2L血液(包含抗凝剂)。
c)用移液管将采集的抗凝猪血液转移到15mL离心管A中。特别地，大量分离血小板时，可将血液静置或低速离心分层取上层至15mL离心管中。
d)将15mL离心管A在20-22℃下以200g离心20min，可以观察到血液分层：
底层：红细胞，占总体积的50％-80％；
中层：非常薄的白细胞及血小板层(buffy coat，BC)
上层：富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)
e)使用移液管将离心管A中PRP上层2/3转移到新的离心管L中。f)向离心管A的液体中按1:1的比例添加HEP缓冲液，慢慢将离心管倒置混匀。
g)离心管A在20-22℃下以100-200g离心15-20min，将上清液用移液管转移到新15mL离心管F中。
h)将数个离心管F中液体聚集在管H中，在20-22℃下以3200r离心20min；血小板颗粒沉积在底部，上层转移至离心管J中，获得少量血小板。
i)将数个管L富集到离心管M中，在20-22℃下以3200r离心20min；血小板颗粒沉积在底部，上层血浆转移至离心管O中，管H获得少量血小板。
j)可将H离心管中获得血小板富集至一个离心管中，存于-20℃冰箱冷冻保存。将离心管O的血浆经0.22μm滤器过滤除菌。将采集到的无菌血浆存于-20℃冰箱冷冻保存。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：
实施例1猪血小板裂解液的制备
(一)猪血小板的分离
具体操作流程及其描述参照图1。
A.选取健康待宰生猪，促凝管采集血液，收集血清，进行传染病检测。
B.预先将123mL CPDA-1抗凝剂添加至采血瓶中，每头猪在屠宰时收集1L血液(包含抗凝剂)。
C.用移液管将采集的抗凝猪血液转移到15mL离心管A中。(大量分离血小板时，可将血液静置或低速离心分层取上层至15mL离心管中)
D.将15mL离心管A在20-22℃下以200g离心20min，可以观察到血液分层如离心管B所示：
底层：红细胞(占总体积的50％-80％)
中层：非常薄的白细胞及血小板层(buffy coat,BC)
上层：富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)
E.使用移液管将离心管B中PRP上层2/3的液体转移到新的离心管L中，余下液体如管C所示。
F.向管C的液体中按1:1的比例添加HEP缓冲液，慢慢将离心管倒置混匀如离心管D状。
G.离心管D在20-22℃下以100-200g离心15-20min，将上清液用移液管转移到新15mL离心管F中。
H.将数个离心管F中的液体聚集在管H中，在20-22℃下以3200r离心20min；如离心管I所示血小板颗粒沉积在底部，上层转移至离心管J中。获得少量血小板如离心管K所示。
I.将数个离心管L中的PRP富集到离心管M中，在20-22℃下以3200r离心20min；如离心管N所示血小板颗粒沉积在底部，上层血浆转移至离心管O中。获得少量血小板如管K所示。
J.可将K离心管中获得血小板富集至一个离心管中，-20℃冰箱冷冻保存。将离心管O的血浆经0.22μm滤器过滤除菌。将采集到的无菌血浆于-20℃冰箱冷冻保存
(二)猪血浆中纤维蛋白原的去除
本试验优化了去除纤维蛋白原最适Ca2+添加量，设计实验如表1。在室温条件下向透明小管的血浆中添加不同浓度的CaCl2后，每20min向小管内投入钢珠以检测血浆凝固情况。每两分钟观察一次血浆凝固情况，并记录。
表1 CaCl2添加浓度滴定优化实验
如表2和图2所示，试验结果表明，在添加不同浓度CaCl2后，血浆发生了不同程度的凝固。其中，20min内，CaCl2添加浓度在0-3.1mmol/L时钢珠沉底，表明血浆中的纤维蛋白原无法析出，血浆仍保持液体状态；CaCl2添加浓度在6.2-9.3mmol/L时钢珠挤压凝固的纤维蛋白凝胶后使得凝胶压缩后到达近底部，表明血浆中的纤维蛋白原部分析出，血浆部分凝固；添加浓度在12.4-21.7mmol/L时，钢珠停留在血浆凝块表面，表明纤维蛋白原已充分析出，血浆完全凝固。当试验时长达到40min，CaCl2添加浓度为9.3mmol/L时，第二颗钢珠无法落下，表明血浆完全凝固，纤维蛋白原已充分析出。因此在大量制备去纤维蛋白原血浆(血清)时，采取了以497:3的比例添加浓度为1.55mol/L CaCl2溶液，并在室温条件下充分凝固40min以上，即可获得凝固的血浆，在此基础上通过高速离心的方法即可大量制备去除了纤维蛋白原的血浆(血清)。
表2 CaCl2添加浓度滴定试验
(三)猪血小板裂解液的制备
将从1L猪全血中采集到的血小板重悬于70mL已离心去除纤维蛋白原的血浆中，在-80℃和4℃条件下反复冻融三次，6000g离心30min后收集上清，上清液经0.22μm孔径过滤器进行过滤除菌，滤过液即为猪血小板裂解液，为减少个体及批次间差异，将多个供体的PL进行混匀，分装后-80℃保存。
实施例2血浆中内毒素含量测定
使用厦门鲎试剂生物科技有限公司的内毒素检测鲎试剂盒测定采集到的血浆中的内毒素含量。以标准品制作内毒素标准曲线(如图3所示)后，根据试剂盒检测方法测定1-9#血浆405nm处的OD值，结果如表3所示。根据表中数据与标准曲线可得知1-9#血浆中除8#血浆外内毒素含量(图3中虚线部分是实际测得的OD值范围)均小于0.1EU/mL，其中8#血浆根据标准曲线可得内毒素含量为0.06EU/mL。特级FBS的内毒素含量通常小于10EU/mL，相较之下，本发明采集获得的材料中内毒素含量远低于特级FBS内毒素含量标准，可以推断在此条件下PPL中的内毒素含量远不能引起细胞应激。
表3血浆中内毒素含量检测结果
本发明以猪血液为来源制备血小板裂解液，减少异源血清造成的异种蛋白残留风险，减少可能存在的未知牛内源性传染病对培养猪细胞产生影响的隐患。
本发明提供的血小板裂解液的制备方法可明显提高血小板裂解液中细胞因子含量，且可进行细胞因子的定量平衡，有利于减少产品批间的差异，可达到稳定的促进人源性细胞生长的作用；
采用本发明制备方法所制备的猪血小板裂解液可代替小牛血清培养细胞；本发明测定了血浆中的内毒素的含量以避免制备的PPL含有较高内毒素从而对培养的细胞造成损伤。
本发明分离血小板的方法，选择从猪全血中分离获得血浆与血小板，为了避免细胞培养过程中培养基凝胶化，选择去除血浆中的纤维蛋白原，这种方法既成功避免了培养基凝胶化，又可以避免直接去除PL中纤维蛋白原而引起纤维蛋白凝块吸附并带走PL中部分生长因子的状况，也避免了以往加入肝素对细胞生长的影响。由于最初血液采集过程中选择了使用枸橼酸钠类抗凝剂，因此可以选择添加CaCl2溶液，使血浆中Ca2+浓度升高，以便让纤维蛋白原析出并得以去除。
本发明提供一种猪血小板裂解液的制备方法，该方法将血小板和血浆的制备单独分开，并发现了最适浓度的血小板裂解物，去除血浆中纤维蛋白原，提高生长因子含量，减少血小板的活化，提高了血小板裂解液的质量。通过反复冻融裂解、离心、过滤的方法制备了PPL，未添加任何外源性物质，为猪细胞提供了无异源的培养基。
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。