具体实施方式

以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

实施例1：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

磁性纳米粒子的合成：将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入去离子水中，通氮气除氧，然后加入氨水，在60℃的温度下反应2h，磁铁分离，洗涤，得到四氧化三铁纳米粒子。六水氯化铁的添加量为去离子水的0.6wt%，四水氯化亚铁的使用量为六水氯化铁的46.67wt%，氨水的添加量为去离子水的4.15wt%。

改性磁性纳米粒子：将磁性纳米粒子磁分离，加入去离子水中，超声分散得到磁性纳米粒子分散液，通氮气除氧，在80℃的温度下加入油酸、蝶酸和烷醇乳酸酯，反应4h后，洗涤，氮气吹干，得到改性磁性纳米粒子。磁性纳米粒子分散液中磁性纳米粒子的含量为0.9wt%，油酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的1.6wt%，蝶酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.14wt%，烷醇乳酸酯的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.26wt%。

羧基化磁性纳米粒子制备：将改性磁性纳米粒子分散在水相溶液中得到磁流体，然后加入油相溶液，加入乳化剂，加入引发剂，搅拌分散10min，氮气保护下在80℃的温度下反应12h，反应完成后，磁分离，洗涤，得到羧基化磁性纳米粒子。水相溶液中包括三丙烯乙二醇醚、无水乙醇和去离子水，水相溶液中三丙烯乙二醇醚的含量为15wt%，水相溶液中无水乙醇的含量为80wt%，改性磁性纳米粒子的使用量为水相溶液的20wt%；油相溶液中包括苯乙烯、丙烯酸、二乙烯基苯，油相溶液中苯乙烯的含量为85wt%，油相溶液中丙烯酸的含量为9wt%，油相溶液的使用量为水相溶液的26wt%；乳化剂为SDS，乳化剂的使用量为水相溶液的0.28wt%；引发剂为过硫酸钠，引发剂的使用量为油相溶液的0.8wt%。

功能化磁性纳米粒子：将羧基化磁性纳米粒子加入MES溶液中，超声分散得到羧基化磁性纳米粒子分散液，加入链霉亲和素，加入EDC溶液，振荡反应3h，反应完成后，MES溶液清洗，得到功能化磁性纳米粒子。MES溶液的溶剂为去离子水，MES溶液中MES的含量为0.28wt%，MES溶液的pH为6.5；羧基化磁性纳米粒子分散液中羧基化磁性纳米粒子的含量为0.45wt%，链霉亲和素的使用量为羧基化磁性纳米粒子的2wt%，EDC溶液由EDC加入MES溶液中配制得到，EDC溶液中EDC的含量为5.7wt%，EDC溶液的使用量为羧基化磁性纳米粒子分散液的3.6wt%。

外泌体分离：脑脊液经0.22μm滤膜过滤，向脑脊滤液中加入功能化磁性纳米粒子、Tim4蛋白和氯化钙溶液，在4℃的温度下振荡48h，静置20min，弃去上清液，分离得到捕获外泌体的磁性纳米粒子。功能化磁性纳米粒子的使用量为脑脊滤液的0.9wt%，Tim4蛋白的使用量为脑脊滤液的0.4wt%，氯化钙溶液的浓度为0.06wt%，氯化钙溶液的使用量为脑脊滤液的40wt%。

实施例2：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例1相比，不同之外仅在于，改性磁性纳米粒子制备步骤中，蝶酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.21wt%，烷醇乳酸酯的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.36wt%。

实施例3：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例1相比，不同之外仅在于，改性磁性纳米粒子制备步骤中，蝶酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.32wt%，烷醇乳酸酯的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.49wt%。

实施例4：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例1相比，不同之外仅在于，改性磁性纳米粒子制备步骤中，油酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的1.0wt%，蝶酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.36wt%，烷醇乳酸酯的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.24wt%。

实施例5：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例1相比，不同之外仅在于，改性磁性纳米粒子制备步骤中，油酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的1.3wt%，蝶酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.26wt%，烷醇乳酸酯的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.46wt%。

实施例6：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

磁性纳米粒子的合成：将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入去离子水中，通氮气除氧，然后加入氨水，在60℃的温度下反应2h，磁铁分离，洗涤，得到四氧化三铁纳米粒子。六水氯化铁的添加量为去离子水的0.6wt%，四水氯化亚铁的使用量为六水氯化铁的46.67wt%，氨水的添加量为去离子水的4.15wt%。

改性磁性纳米粒子：将磁性纳米粒子磁分离，加入去离子水中，超声分散得到磁性纳米粒子分散液，通氮气除氧，在80℃的温度下加入油酸、蝶酸和烷醇乳酸酯，反应4h后，洗涤，氮气吹干，得到改性磁性纳米粒子。磁性纳米粒子分散液中磁性纳米粒子的含量为0.9wt%，油酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的1.6wt%，蝶酸的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.32wt%，烷醇乳酸酯的添加量为磁性纳米粒子分散液的0.49wt%。

羧基化磁性纳米粒子制备：将改性磁性纳米粒子分散在水相溶液中得到磁流体，然后加入油相溶液，加入乳化剂和异戊二烯基乙酸酯，加入引发剂，搅拌分散10min，氮气保护下在80℃的温度下反应12h，反应完成后，磁分离，洗涤，得到羧基化磁性纳米粒子。水相溶液中包括三丙烯乙二醇醚、无水乙醇和去离子水，水相溶液中三丙烯乙二醇醚的含量为15wt%，水相溶液中无水乙醇的含量为80wt%，改性磁性纳米粒子的使用量为水相溶液的20wt%；油相溶液中包括苯乙烯、丙烯酸、二乙烯基苯，油相溶液中苯乙烯的含量为85wt%，油相溶液中丙烯酸的含量为9wt%，油相溶液的使用量为水相溶液的26wt%；乳化剂为SDS，乳化剂的使用量为水相溶液的0.28wt%；异戊二烯基乙酸酯的使用量为水相溶液的0.16wt%；引发剂为过硫酸钠，引发剂的使用量为油相溶液的0.8wt%。

功能化磁性纳米粒子：将羧基化磁性纳米粒子加入MES溶液中，超声分散得到羧基化磁性纳米粒子分散液，加入链霉亲和素，加入EDC溶液，振荡反应3h，反应完成后，MES溶液清洗，得到功能化磁性纳米粒子。MES溶液的溶剂为去离子水，MES溶液中MES的含量为0.28wt%，MES溶液的pH为6.5；羧基化磁性纳米粒子分散液中羧基化磁性纳米粒子的含量为0.45wt%，链霉亲和素的使用量为羧基化磁性纳米粒子的2wt%，EDC溶液由EDC加入MES溶液中配制得到，EDC溶液中EDC的含量为5.7wt%，EDC溶液的使用量为羧基化磁性纳米粒子分散液的3.6wt%。

外泌体分离：脑脊液经0.22μm滤膜过滤，向脑脊滤液中加入功能化磁性纳米粒子、Tim4蛋白和氯化钙溶液，在4℃的温度下振荡48h，静置20min，弃去上清液，分离得到捕获外泌体的磁性纳米粒子。功能化磁性纳米粒子的使用量为脑脊滤液的0.9wt%，Tim4蛋白的使用量为脑脊滤液的0.4wt%，氯化钙溶液的浓度为0.06wt%，氯化钙溶液的使用量为脑脊滤液的40wt%。

实施例7：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例6相比，不同之外仅在于，羧基化磁性纳米粒子制备中，异戊二烯基乙酸酯的使用量为水相溶液的0.48wt%。

实施例8：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例7相比，不同之外仅在于，羧基化磁性纳米粒子制备中，水相溶液中包括三丙烯乙二醇醚、无水乙醇和去离子水，水相溶液中三丙烯乙二醇醚的含量为13wt%，水相溶液中无水乙醇的含量为75wt%，改性磁性纳米粒子的使用量为水相溶液的16wt%。

实施例9：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例7相比，不同之外仅在于，羧基化磁性纳米粒子制备中，油相溶液中包括苯乙烯、丙烯酸、二乙烯基苯，油相溶液中苯乙烯的含量为76wt%，油相溶液中苯乙烯的含量为6wt%，油相溶液的使用量为水相溶液的25wt%。

实施例10：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本实施例与实施例7相比，不同之外仅在于，羧基化磁性纳米粒子制备中，水相溶液中三丙烯乙二醇醚的含量为18wt%，异戊二烯基乙酸酯的使用量为水相溶液的0.36wt%。

对比例1：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本对比例与实施例3相比，不同之外仅在于，改性磁性纳米粒子制备步骤中未加入烷醇乳酸酯。

对比例2：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本对比例与实施例3相比，不同之外仅在于，改性磁性纳米粒子制备步骤中未加入蝶酸。

对比例3：

一种分离脑脊液中外泌体的方法，

本对比例与实施例3相比，不同之外仅在于，改性磁性纳米粒子制备步骤中未加入蝶酸和烷醇乳酸酯。

试验例1：

1.纳米粒子粒径

测试样品：各实施例和对比例制备得到的功能化磁性纳米粒子。

测试方法：动态光散射DLS表征测试样品的粒径。

功能化磁性纳米粒子的有效水力直径测试结果如图1所示，其中，实施例3的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的有效水力直径为1579.64nm，对比例3的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的有效水力直径为1267.34nm，实施例3与对比例3相比，表明在改性磁性纳米粒子制备中，采用蝶酸、烷醇乳酸酯和油酸共同使用对磁性纳米粒子处理后，通过后续步骤制备得到功能化磁性纳米粒子的有效水力直径大大提高，表明蝶酸、烷醇乳酸酯的使用具有显著的效果；对比例1的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的有效水力直径为1277.16nm，实施例3与对比例1相比，表明按本发明方法制备改性磁性纳米粒子时，蝶酸、烷醇乳酸酯的共同使用优于蝶酸的单独使用；对比例2的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的有效水力直径为1283.78nm，表明按本发明方法制备改性磁性纳米粒子时，蝶酸、烷醇乳酸酯的共同使用优于烷醇乳酸酯的单独使用；实施例3与对比例1-3之间相比，表明将蝶酸、烷醇乳酸酯替换为两种物质中任一种时，对所得到功能化磁性纳米粒子的有效水力直径的提升效果十分微弱，而蝶酸、烷醇乳酸酯共同使用且在油酸存在时，所得到功能化磁性纳米粒子的有效水力直径的提高则十分显著。实施例6-7与实施例3相比，表明在羧基化磁性纳米粒子制备中，异戊二烯基乙酸酯的使用，对后续制备得到功能化磁性纳米粒子的有效水力直径有提高效果。

本发明制备得到的功能化磁性纳米粒子的有效水力直径为1400-1750nm。

2.功能化磁性纳米粒子的接枝量

测试样品：各实施例和对比例制备得到的功能化磁性纳米粒子。

测试方法：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒的方法对测试样品上的接枝量进行表征。以吸光度表征接枝上链霉亲和素的量。设置未接枝链霉亲和素的羧基化磁性纳米粒子作为空白对照，以下作为表征链霉亲和素接枝量的蛋白吸光度中扣除空白对照吸光度。

功能化磁性纳米粒子上接枝的链霉亲和素的值以蛋白吸光度进行表征，蛋白吸光度测试结果如图2所示，其中，实施例3的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的蛋白吸光度为0.41，对比例3的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的蛋白吸光度为0.32，实施例3与对比例3相比，表明在改性磁性纳米粒子制备中，采用蝶酸、烷醇乳酸酯和油酸共同使用对磁性纳米粒子处理后，通过后续步骤制备得到功能化磁性纳米粒子的链霉亲和素的接枝量提高，表明蝶酸、烷醇乳酸酯的使用具有显著的效果；对比例1的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的蛋白吸光度为0.33，实施例3与对比例1相比，表明按本发明方法制备改性磁性纳米粒子时，蝶酸、烷醇乳酸酯的共同使用优于蝶酸的单独使用；对比例2的方法制备得到的功能化磁性纳米粒子的蛋白吸光度为0.34，表明按本发明方法制备改性磁性纳米粒子时，蝶酸、烷醇乳酸酯的共同使用优于烷醇乳酸酯的单独使用；实施例3与对比例1-3之间相比，表明将蝶酸、烷醇乳酸酯替换为两种物质中任一种时，对所得到功能化磁性纳米粒子上链霉亲和素的接枝量的提升效果十分微弱，而蝶酸、烷醇乳酸酯共同使用且在油酸存在时，所得到功能化磁性纳米粒子上链霉亲和素的接枝量的提高则十分显著。实施例6-7与实施例3相比，表明在羧基化磁性纳米粒子制备中，异戊二烯基乙酸酯的使用，对后续制备得到功能化磁性纳米粒子上链霉亲和素的接枝量有提高效果。

本发明制备得到的功能化磁性纳米粒子上链霉亲和素的接枝量以蛋白吸光度表示，吸光度为0.35-0.5。

3.外泌体捕获效率

测试方法：各实施例和对比例的方法。

按本发明方法检测脑脊液中外泌体含量时，加入功能化磁性纳米粒子与Tim4蛋白经振荡处理后，功能化磁性纳米粒子与Tim4蛋白会捕获到外泌体。

捕获后的蛋白浓度测试方法：将测试样品采用洗脱液将外泌体洗脱，然后采用BCA蛋白浓度测定试剂盒的方法进行检测蛋白浓度。

捕获前的蛋白浓度测试方法：过滤后的脑脊液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒的方法进行检测蛋白浓度。

外泌体捕获效率=捕获外泌体的蛋白吸光度/捕获前脑脊滤液中蛋白吸光度×100%。

本发明方法对脑脊液外泌体的捕获效率的测试结果如图3所示，其中，实施例3的方法对脑脊液外泌体的捕获效率为18.08%，对比例3的方法对脑脊液外泌体的捕获效率为13.65%，实施例3与对比例3相比，表明在改性磁性纳米粒子制备中，采用蝶酸、烷醇乳酸酯和油酸共同使用对磁性纳米粒子处理后，通过后续步骤制备得到功能化磁性纳米粒子，所得功能化磁性纳米粒子、Tim4蛋白和氯化钙对脑脊液中外泌体的捕获效率大幅提高，表明蝶酸、烷醇乳酸酯的使用具有显著的效果；对比例1的方法对脑脊液外泌体的捕获效率为14.18%，实施例3与对比例1相比，表明按本发明方法制备改性磁性纳米粒子时，蝶酸、烷醇乳酸酯的共同使用优于蝶酸的单独使用；对比例2的方法对脑脊液外泌体的捕获效率为13.8%，表明按本发明方法制备改性磁性纳米粒子时，蝶酸、烷醇乳酸酯的共同使用优于烷醇乳酸酯的单独使用；实施例3与对比例1-3之间相比，表明将蝶酸、烷醇乳酸酯替换为两种物质中任一种时，所得到功能化磁性纳米粒子按本发明方法用于捕获脑脊液中外泌体的捕获率提高，而蝶酸、烷醇乳酸酯共同使用且在油酸存在时，所得到功能化磁性纳米粒子按本发明方法捕获脑脊液中外泌体的捕获率的提高效果十分显著。实施例6-7与实施例3相比，表明在羧基化磁性纳米粒子制备中，异戊二烯基乙酸酯的使用，对后续制备得到功能化磁性纳米粒子按本发明方法捕捉脑脊液中外泌体的捕获效率有提高效果。

本发明方法对脑脊液中外泌体的捕获效果好，捕获效率为15-22%。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。