靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白msln的car载体及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白msln的car载体及其构建方法和应用 (CAR vector of targeted gastric cancer cell-specific high-expression protein MSLN and construction method and application thereof ) 是由 田晓丽 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于免疫细胞技术领域,具体涉及靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体及其构建方法和应用。所述的CAR载体包含编码嵌合抗原受体的基因,CAR的结构为SP-MSLNscFv-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ。以病毒感染方式获得含有该载体的CAR-T细胞,此特异性CAR-T细胞通过表达此独特的CAR结构,可识别并靶向杀伤高表达肿瘤相关抗原MSLN的胃癌细胞。(The invention belongs to the technical field of immune cells, and particularly relates to a CAR vector of a target gastric cancer cell specific high-expression protein MSLN, and a construction method and application thereof. The CAR vector comprises a gene for coding a chimeric antigen receptor, and the structure of the CAR is SP-MSLNscFv-TM-CD28-4-1BB-CD3 zeta. The CAR-T cell containing the vector is obtained by means of virus infection, and the specific CAR-T cell can recognize and target and kill gastric cancer cells highly expressing tumor associated antigen MSLN by expressing the unique CAR structure.)
技术领域
本发明属于生物医药免疫细胞技术领域，具体涉及靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体及其构建方法和应用。
背景技术
胃癌是我国目前临床比较常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高死亡率的特点，在我国，胃癌的发病率和死亡率占恶性肿瘤的第三位。目前，胃癌的治疗方式主要有手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗。手术是唯一可能治愈胃癌的方式，但进展期胃癌的单纯手术治疗可能会存在肉眼或镜下残留灶，使复发转移率大大增加；放化疗毒副作用大，疗效也不能达到满意效果；分子靶向治疗如曲妥珠单抗治疗存在耐药、无明显获益等问题；免疫治疗如免疫检查点抑制剂PD-L1抗体在胃癌中并没有观察到明显缓解，这可能和肿瘤细胞本身及其微环境有关。
细胞免疫疗法曾被认为是最有前途的治疗方法，LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段。在众多的细胞免疫疗法中，CAR-T疗法是一种比较有潜力的免疫疗法。
但是如何避免肿瘤免疫逃逸的发生，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗胃癌的效果，仍然是CAR-T治疗亟待解决的问题。
间皮素(mesothelin，MSLN)是一种在细胞表面表达的糖蛋白，在体腔内仅在间皮组织中表达。MSLN在胃癌组织、恶性间皮瘤、卵巢上皮恶性肿瘤、胰腺癌中呈过度表达，与肿瘤的发生、发展密切相关。靶向MSLN的CAR-T在间皮瘤、肺癌、胰腺癌等癌症上得到过验证。中国科学院广州生物医药与健康研究院李鹏研究组提出MSLN可作为CAR-T治疗胃癌的有效新靶点，为胃癌的治疗特别是耐药性胃癌的治疗提供了全新的治疗思路，有望从根本上改进胃癌的治疗方法从而改善胃癌的预后。李鹏组研究人员构建了CAR-T载体，在与靶细胞共培养时展示出强大的靶向杀伤能力和细胞因子分泌能力。本发明较其相比，构建的CAR-T载体结构与其具有本质区别，获得的CAR-T细胞可用于临床实验。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，本发明提供了能靶向MSLN的独特的CAR载体，此CAR载体既可以识别MSLN阳性表达的胃癌细胞，又可以增强T淋巴细胞的杀伤能力，从而提高CAR-T免疫疗法治疗胃癌的效果。此外，本发明还提供了靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体的构建方法。
本发明可以通过如下的技术方案实现：
一种重组载体，其包含编码嵌合抗原受体的基因，
所述嵌合抗原受体用于靶向胃癌细胞特异性高表达的蛋白MSLN，
所述嵌合抗原受体的结构为SP-MSLNscFv-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ，
其中，SP为引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，MSLNscFv为特异性识别蛋白MSLNscFv的单链抗体，TM为连接胞外抗原结合域和胞内信号域的跨膜区，CD28-4-1BB为共刺激结构域，CD3ζ为信号转导域。
所述SP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，
所述MSLNscFv由VH、VL以及连接VH和VL的柔性连接链构成，所述VH的核苷酸序列由如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中所示的一种构成，所述VL的核苷酸序列由如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7中所示的一种构成，所述柔性连接链的氨基酸序列由GGGGSGGGGSGGGGS构成，
优选地，在本发明中MSLN的单链抗体核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示的重链可变区(VH)和SEQ ID NO.5所示的轻链可变区(VL)构成。
进一步地，根据scFv的过程规则，VH和VL序列通过一段柔性连接链氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS连接在一起，形成scFv序列。
所述TM的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，
所述CD28-4-1BB中，所述CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，
所述CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明中所述的重组载体，为包含编码嵌合抗原受体的基因的PUC19质粒或慢病毒载体。
在某些实施方式中，所述重组载体为包含编码嵌合抗原受体的基因的PUC19质粒，在某些实施方式中为慢病毒载体。
优选的，在某些实施方式中，所述的慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-FF1-Puro。
本发明还提供了靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体的构建方法，步骤如下：
(1)将编码所述嵌合抗原受体的基因保存在PUC19质粒上；
(2)将步骤(1)中的PUC19质粒进行双酶切，将酶切产物经过凝胶电泳分离，获得包含编码嵌合抗原受体的基因的目的基因片段，
(3)将慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物经过凝胶电泳分离，获得双酶切后的慢病毒载体，
(4)将步骤(2)中的目的基因片段和步骤(3)中的双酶切后的慢病毒载体进行连接，
(5)将步骤(4)中的连接产物进行转化，获得重组载体。
在某些实施方式中，上述步骤(2)中的双酶切位点为EcoRI和NotI，所述步骤(4)中的含有嵌合抗原受体的目的基因的片段和慢病毒载体的摩尔比为5∶1。
本发明还提供了靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体的应用，包装感染获得CAR-T细胞。将上述步骤中所获得的任一CAR载体进行慢病毒包装，并经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒悬液，用该慢病毒悬液感染T细胞，获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过识别特异性蛋白MSLN靶向杀伤胃癌细胞。
在某些实施方式中，慢病毒包装采用293T细胞作为包装细胞，并采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和所述的重组CAR载体，所述PSPAX2质粒、所述pMD2G质粒及重组CAR载体的比例为27∶3∶20。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体包括MSLN单链抗体；MSLN单链抗体是根据MSLN在胃癌的组织中高表达而确定的特异性结构，该结构表达的抗体Anti-MSLN负责识别胃癌组织中高表达的MSLN，一方面可靶向性结合胃癌细胞；另一方面，赋予T细胞新的抗原特异性，可有效避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。当T细胞通过病毒感染方式获得该载体并表达该CAR结构后，T细胞即可靶向性识别并杀伤胃癌细胞。
本发明与现有技术相比，在体外杀伤实验中，当效靶比为2.5∶1时，能够在很短时间内快速杀伤肿瘤细胞；在体内杀伤实验中，CAR-T细胞的有效性及安全性也得到良好的效果；本发明在小鼠肿瘤模型中，注射CAR-T细胞能够完全清除肿瘤。同时本发明中低效靶比的CAR-T细胞杀伤效果、细胞因子释放与李鹏组研究人员构建的CAR-T相比能够达到相同的效果。
附图说明
图1是本发明的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-FF1-Puro结构示意图；
图2是本发明的CAR结构示意图；
图3是胃癌样本上MSLN靶点的表达情况图；
图4是胃癌细胞系AGS上MSLN的表达检测结果图；
图5是MSLN-CAR-T细胞对胃癌细胞系AGS的杀伤作用效果图；
图6是MSLN-CAR-T细胞在效靶比为2.5∶1下对不同细胞系的杀伤结果对比图；
图7是MSLN-CAR-T细胞对胃癌细胞系AGS的杀伤作用效果图；
图8是MSLN-CAR-T细胞对胃癌PDX动物模型的药效作用效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明提供了靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体，具体方案如下：包括嵌合抗原受体和载体，嵌合抗原受体连接在载体上，嵌合抗原受体包括MSLN单链抗体，MSLN单链抗体由如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5的核苷酸序列、以及柔性Linker构成。表达针对胃癌细胞表面的肿瘤相关抗原MSLN的抗体Anti-MSLN，Anti-MSLN负责识别胃癌组织中高表达的MSLN，大大增加了CAR-T细胞的靶向性，降低肿瘤免疫逃逸。
嵌合抗原受体的结构组成为SP-MSLNscFv-TM-CD28-4-1BB-CD3ζ(如图2所示)。SP可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，SP的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，MSLNscFv表示MSLN单链抗体，所述TM为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，将CAR结构锚定于T细胞膜上，核苷酸序列如SEQID NO.8所示，CD28-4-1BB为共刺激结构域，转导增殖信号并诱导细胞因子产生、刺激T细胞活化，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，4-1BB核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，CD3ζ为信号转导域，当胞外区和目标抗原结合时，向胞内传导TCR样信号，激活T细胞，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。本发明中提到的CAR结构赋予了T细胞更强的增殖性，持久的生命力，使其表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。
载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，其结构如图1所示。通过Snap Gene软件分析该载体并查找相关文献可知，pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用EcoRI与NotI双酶切插入片段。该表达载体包括：CMV启动子-是哺乳动物细胞特异性启动子，驱动能力较强；多克隆位点(MCS)-包含多个限制性酶切位点(restriction site)，是外源基因插入的位置；WPRE元件-可提高mRNA的polyA加尾效率，改进转移基因的表达效率；SV40 polyA序列-能有效终止转录以及为转录的mRNA添加PolyA尾；杂交型RSV/5’LTR-含有启动子和增强子等调控元件，使其在293T细胞中高水平的表达全长病毒转录物；遗传要素(cPPT，gag，env，LTRs)-用于包装、转导和稳定地将病毒表达结构整合到宿主的基因组DNA中；SV40 origin-使质粒在包装细胞中稳定增殖。
该慢病毒表达载体可作为使目的基因在几乎所有哺乳动物细胞包括非分裂细胞和分裂细胞中表达的最有效载体，其可容载外源基因片段大，转染效率较高，对T细胞也能达到满意的转染效果。
一、实验材料
1.慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2购自SBI；慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，结构如图1所示；
2.CAR结构序列由上海怡豪生物科技有限公司设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以PUC19质粒形式保存；
3.限制性核酸内切酶EcoRI、NotI购自NEB；
4.T4 DNA ligase、Free H2O购自宝生物；
5.感受态细胞购自Trans；
6.胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；
7. 293T细胞、AGS细胞购自中科院细胞库；
8.FBS、DMEM、1640培养基，PBS，Opti-MEM，lipofectamine 2000购自Gibco；
9.CD3单抗、CD28单抗、CH38蛋白、IL-2购自于上海近岸蛋白质科技有限公司；
10.Multiskan GO酶标仪+uDrop超微量板、流式细胞仪购自ThermoFisher；
11.HE120水平电泳槽、Tanon凝胶成像仪购自Tanon；
12.隔水式恒温培养箱、恒温培养摇床购自上海一恒科技有限公司；
13.Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型电泳系统购自Bio-Rad；
14.奥林巴斯显微镜购自奥林巴斯；
15.接种环、涂布棒购自洁特生物过滤股份有限公司；
16.注射器，0.45μm滤膜、各规格的培养皿，培养瓶，多孔培养板，各种规格离心管购自Corning。
二、靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体的构建方法
(一)质粒提取
LB液体培养基的配制方法：电子天平称取5g液体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃-50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素(AMP)，小心混匀后，转入到干净的500mL试剂瓶中备用，储存条件为4℃。
LB固体培养基的配制方法：电子天平称取5g固体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL超纯水，锡箔纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃-50℃时，以1000:1加入0.2％AMP，小心混匀后，倒板，凝固后，贴封口膜储存于4℃。
从-80℃冰箱分别取出含有慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和PUC19质粒的甘油菌，分别取5μL接种于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床振荡培养12-16h，条件为37℃，250rmp。
按照购自天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒(货号：DP103-03)的说明书进行质粒提取，获得慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和含有靶点(MSLN单链抗体)CAR结构的PUC19质粒。
(二)酶切、连接、转化
将已提取的慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和靶点(MSLN单链抗体)CAR结构的PUC19质粒同时进行EcoRI、NotI双酶切，将酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察并记录结果。
用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号：DP209-02)说明书进行目的条带回收，将回收片段按CAR结构：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro＝5:1的摩尔比进行连接，并进行转化至感受态细胞，将转化后的感受态细胞滴于预热的固体培养基上，做好标记，37℃孵箱过夜。
(三)提质粒、酶切验证、测序
挑取部分菌落于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，于恒温摇床进行增菌培养并进行质粒抽提，质粒抽提之前取出500μL于1.5mL Ep管中，用作菌种保存，储存于-80℃；将抽提产物采用EcoRI、NotI双酶切验证，取条带正确的质粒1μg送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，条带异常的质粒以及留存的菌液均丢弃。将测序结果正确的质粒进行抽提，测序结果错误的质粒及其菌液均丢弃。
三、靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体的应用
(一)浓缩病毒液的制备
采用三质粒包装系统进行慢病毒包装。三质粒分别为含有CAR结构的慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro，慢病毒包装质粒pMD2G，载体质粒PSPAX2。细胞为293T细胞。
具体实施步骤如下：
(1)转染前24h内进行铺板：一般选择传代次数在3代以内的细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度，生长密度达到80％的293T细胞进行铺板；
(2)待生长密度达60-90％，细胞状态良好，即可进行病毒包装；
(3)按照PSPAX2质粒、pMD2G质粒、靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体(重组质粒)的比例为27:3:20进行病毒包装，以6cm皿为例，所需的三质粒混合液配比如下：按照各质粒浓度确定质粒加入量。
重组质粒 3μg
pMD2G 0.5μg
PSPAX2 4μg
(4)转染试剂选择lipofectamine 2000(4℃保存)，加入量为2μL/μg质粒；
(5)将(3)中质粒混合物与(4)中转染试剂混合物混于一管中，室温静止20min后，加入换液细胞中，继续培养；
(6)分别收集48h、72h后培养上清，通过0.45μm滤膜过滤；
(7)将收集的病毒液采用PEG8000浓缩法进行浓缩，并测定病毒滴度，储存于-80℃备用。
(二)病毒液感染T细胞
1、PBMC分离
1)用含有肝素的真空采血管收集约6mL人外周新鲜血液；
2)稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀；
3)加样：取50mL离心管，吸取6mL Ficoll(淋巴细胞分离液)于离心管中(Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1)，离心管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面；
4)离心：18-20℃，2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；
5)回收：将移液管直接插入云雾层(或者先吸去上层的血浆)，轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中；
6)洗涤：加入至少于PBMC(外周血单个核细胞)体积3倍的PBS，18-20℃，2000rpm，10min，两次；
7)细胞计数：弃上清，加1mL淋巴细胞培养基，吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。采用血细胞计数板计数：取一滴PBMC悬液与一滴2％台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。细胞数/mL＝4个大方格细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
2、T细胞的激活与慢病毒感染
(1)实验前准备：
1)Anti-CD3单抗液配制：CD3单抗50μg溶于5mLPBS溶液中，配制成浓度为10μg/mL的溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
2)Anti-CD28单抗液配制：CD28单抗50μg溶于5mLPBS溶液中，配制成浓度为10μg/mL的溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
3)CH-38蛋白液配制：CH38蛋白500μg溶于10mL PBS溶液中，配制成50μg/mL溶液，溶解后按照每EP管400μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存。(此浓度下每24孔板内加入175μL抗体溶液)；
4)IL-2因子配制：IL-2蛋白固体按1×107U/mg进行配制，每50μg IL-2蛋白加入500μL的PBS溶液，配制成103U/μL的浓度，配制后按照每EP中加入32μL进行分装，并置于-80℃冰箱保存；
5)淋巴细胞培养基配制：Takara-551h3淋巴细胞培养基每50mL加入30μL已分装的IL-2溶液，0.5mL双抗，250μL自体血清。
(2)实验流程：
Day0：24孔板包被：取Corning 24孔板，以2孔为例，在2孔中各加入CD3单抗液175μL，CD28单抗液175μL，CH-38蛋白液175μL。加入后轻震荡混匀后，用封口膜将孔板封闭，放入4℃冰箱内过夜。细胞复苏：取液氮中的PBMC细胞，复苏；
Day1：清洗包被板：取出昨日包被的24孔板，弃去上清，PBS清洗2次后，加入PBS待用；
PBMC铺板：收集PBMC细胞，计数并将浓度最终调整到0.7×106cells/mL，每孔中加入400μL细胞悬液，即每孔中加入2.8×105个cells；
病毒感染：以MOI＝30进行感染，配制1mL病毒培养基悬液，加入24孔板中，1000g离心30min，将离心机温度调节至32℃；
Day1-Day2：观察细胞状态；
Day3：将24孔板中的所有细胞转移至加入10mL培养基的25cm2培养瓶中，观察细胞状态；
Day4-Day7：观察细胞状态以及细胞数量，若细胞开始明显扩增，并局部区域细胞密度较多，加入10mL培养基；
Day8：此时25cm2培养瓶中的细胞已经长满，转移到加入20mL培养基的75cm2培养瓶中继续培养；
Day9-Day10：观察细胞状态，当细胞在75cm2培养瓶中处于充满状态时，停止继续生长，富集细胞并计算扩增比例，流式检测检测细胞分型，进行细胞杀伤检测或细胞冻存等后续实验。
四、CAR-T细胞的鉴定与检测
(一)流式细胞术检测CAR结构阳性表达率
1、检测细胞CD3、CD4、CD8、CCR7、CD45RA阳性率
1)将取得的NC组细胞(未进行病毒感染)和样本组细胞(已进行病毒感染)使用PBS+2％BSA温和洗涤2次，离心条件为1500rpm、3min；
2)NC管中加入1000μL PBS+2％BSA，分装成5管，分别为NC、NC-CD3、NC-CD4、NC-CD8、NC-CD3/4/8，样本管中加入200μL PBS，标记为样本-CD3/4/8，分别加入CD3/4/8抗体5μL/20μL/20μL，温和混匀；
3)室温避光孵育30min后，1500rpm，3min，弃去废液；
4)加入200μL PBS+2％BSA，温和混匀重悬，1500rpm/3min，弃去废液；
5)加入100μL PBS+2％BSA，温和混匀重悬后即可上机检测；
2、检测CAR结构阳性表达率
1)将取得的NC组细胞(未进行病毒感染)和样本组细胞(已进行病毒感染)，使用PBS+2％BSA温和洗涤2次，1500rpm/6min，弃去废液；
2)NC管中加入200μL PBS，重悬；样本管中加入100μL PBS，重悬，再加入100μL一抗工作液(3μg/mL)，混匀；
3)室温孵育1h，1500rpm/3min，弃去废液；
4)加入200μLPBS，温和混匀重悬，1500rpm/3min，弃去废液；
5)NC管中加入200μL PBS，重悬；样本管中加入200μL PBS，重悬，再加入5μL二抗工作液，混匀；
6)室温避光孵育1h后，1500rpm/3min，弃去废液，使用PBS+2％BSA温和洗涤3次，离心条件为1500rpm、3min，弃去废液；
7)加入100μL PBS，温和混匀重悬后上机检测(图4)。
(二)RTCA实时细胞杀伤检测
1)以胃癌AGS细胞为例，消化后制备成细胞悬液，吹打混匀后进行细胞计数；
2)将细胞悬液稀释成5×104cells/mL浓度，放置在冰上备用；
3)将RTCA检测板取出，加入50μL培养基；
4)在RTCA检测仪程序中编选本次试验的试验程序；
5)将RTCA检测板置入检测仪中，观测程序中Messege项是否正常，待正常后启动实验程序；
6)程序1运行完毕后取出检测板，在对应孔中加入肿瘤细胞悬液100μL，加入之前混匀每管细胞悬液；
7)细胞悬液加入后，将检测板置入培养箱中静置30min，使细胞自然沉降；
8)30min后，将检测板放入检测仪中，运行程序2；
9)24h后观察细胞生长曲线，待细胞处于对数生长期时，准备加入效应T细胞；
10)培养瓶中取出效应T细胞，离心，清洗，计数，按不同效靶比配制效应组细胞浓度；
11)暂停程序，取出检测板，对应位置加入效应细胞50μL，放回检测仪中，继续程序，每天观察(图5、6)。
(三)ELISA检测细胞因子分泌
1)用ddH2O稀释10×包被液buffer，按比例配制250×包被蛋白，例如2mL包被液buffer中加入8μL 250×包被蛋白；
2)向Corning 9018Elisa高亲和96孔板中加入100μL/孔1)中配制完成的包被液，密封放入4℃冰箱中，过夜；
3)使用PBST(0.05％Tween 20)对已包被的96孔板进行清洗，3次；
4)用ddH2O配制5×封闭液，200μL/孔加入，室温下封闭1h；
5)按瓶装标准品要求加入1×封闭液进行配制，进行7次倍比稀释，同时对样品(取RTCA检测实验中的CAR-T细胞对AGS杀伤24h后的上清液)进行5倍稀释；
6)PBST清洗封闭后的板子5次，加入标准品和稀释后的样品液，室温孵育2h或4℃过夜；
7)PBST清洗4次；
8)使用1×封闭液稀释250×检测抗体，100μL/孔中加入，室温孵育1h；
9)PBST清洗4次，使用1×封闭液稀释250×HRP，100μL/孔中加入，室温孵育30min；
10)PBST清洗5次，每孔中加入1×TMB试剂100μL，室温孵育15min；
11)加入50μL/孔终止液终止显色；
12)酶标仪450nm检测OD值。
图7为CAR-T细胞对AGS杀伤24h后IFN-gamma因子的ELISA检测，图中5:1表示为效应细胞：靶细胞＝5:1；2.5:1表示为效应细胞：靶细胞＝2.5:1；1.25:1表示为效应细胞：靶细胞＝1.25:1；NC表示为空白对照。CAR-T细胞与AGS细胞共培养24h后，有明显的细胞因子IFN-gamma释放，效应细胞：靶细胞为5:1时，细胞因子IFN-gamma释放最多。
综上所述，本发明提供的靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白MSLN的CAR载体应用于感染T细胞，获得CAR-T细胞表达针对胃癌细胞表面的肿瘤相关抗原MSLN的抗体Anti-MSLN，使得其能够更精准的识别并杀伤表达上述肿瘤相关抗原的胃癌细胞；另外，本发明中提到的CAR结构赋予了T细胞更强的增殖性，持久的生命力，使其表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。
(四)胃癌PDX小鼠模型
1)使用临床胃癌样本进行PDX动物模型建立，待动物模型肿瘤能够检测到时，准备实验；
2)将PDX动物模型进行随机分组，分为药效组及对照组；
3)分别对各组进行CAR-T细胞与NC-T细胞注射。如图8所示，在D1时间点向药效组注射2.5×106MSLN-CAR-T cells/只，对照组注射相同总细胞数的NC-T cells。
上述仅为本发明可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。