一种复配普洱茶功能组合物的制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种复配普洱茶功能组合物的制备方法和用途 (Preparation method and application of compound Pu' er tea functional composition ) 是由 董悦生 何良宇 修志龙 王银波 虞诗强 余洋 杨睿 于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种复配普洱茶功能组合物的制备方法和用途,属于生物技术与医药领域。普洱茶、石斛及桑属植物有效部位经由水提、醇提、醇沉、有机溶剂萃取、浓缩、干燥等步骤获得提取物,经过复配得到具有改善高脂高糖饮食诱发疾病的组合物。本发明的组合物可改善高脂高糖饮食诱发的高血糖症、高血脂症以及非酒精性脂肪肝；与普洱茶提取物单用相比效果显著,具有明显的应用价值。本发明所述复配功能食品中的原料均属于药食同源植物,绿色健康,副作用低、安全性好,易实现产业化,具有明显的社会效益和经济价值。(The invention discloses a preparation method and application of a compound Pu' er tea functional composition, and belongs to the field of biotechnology and medicine. The effective parts of Pu' er tea, dendrobium and morus plants are subjected to water extraction, alcohol precipitation, organic solvent extraction, concentration, drying and other steps to obtain extracts, and the composition for improving high fat and high sugar diet induced diseases is obtained through compounding. The composition can improve hyperglycemia, hyperlipidemia and non-alcoholic fatty liver induced by high-fat high-sugar diet; compared with the single use of the Pu' er tea extract, the effect is obvious, and the application value is obvious. The raw materials in the compound functional food belong to homologous plants of medicine and food, are green and healthy, have low side effect and good safety, are easy to realize industrialization, and have obvious social benefit and economic value.)
技术领域
本发明属于生物技术与医药领域，公开了一种复配普洱茶功能组合物的制备方法以及在改善高脂高糖饮食诱导疾病的应用。
背景技术
随着社会发展和人们生活水平的提高，高脂高糖饮食的摄入量逐年增加，长期食用高脂高糖食品易对人体产生综合性的影响，使机体处于亚健康状态。高脂高糖饮食可以导致脂肪堆积，形成肥胖，并会导致血液中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白的含量增加，引发动脉粥样硬化等高血脂症或心脑血管疾病。高脂高糖饮食还会导致血糖水平升高，导致肝脏、胰腺等器官负荷加重，引起胰岛素抵抗，从而导致2型糖尿病；这一过程还常伴随碳水化合物、蛋白质和脂肪等的代谢紊乱现象，损害全身血管，影响神经、心脏和肾脏等身体重要的组织和器官，诱发各种糖尿病并发症。高脂高糖饮食还是非酒精性脂肪肝的主要诱因，其病变主体在肝小叶，以肝细胞内甘油三酯蓄积过多和弥漫性肝细胞脂肪变性、脂肪空泡为主要病理特征(Journal of Gastroenterology&Hepatology,2010,22:293-303)。
目前临床上治疗高脂高糖诱发疾病的药物主要是以西药为主，如治疗高血糖的双胍类、噻唑烷二酮类、磺酰脲类和格列奈类、ɑ-糖苷酶抑制剂类等药物；治疗高血脂的贝特类和他汀类等药物；治疗非酒精性脂肪肝的胰岛素增敏剂、抗氧化剂、微生态制剂、降脂和减肥等药物。然而这些治疗高脂高糖饮食诱发疾病的药物均有毒副作用，如降糖西药常有腹胀、腹痛、恶心、呕吐等肠道反应，并有代谢中毒、体重增加、低血糖、低血压、继发性失效等副作用；降脂西药有胃肠道副反应、影响肝功能等不足；同时肝损伤和胃肠副反应也是非酒精性肝病治疗药物的主要副作用。
天然产物常用于治疗高血糖、高血脂以及非酒精性脂肪肝等疾病，具有药性温和、毒副作用小等特点，可以通过调控体内蛋白和激素的表达分泌、调控肠道菌群等多通路、多靶点的方式发挥降糖、降脂和改善非酒精性脂肪肝作用，在改善高脂高糖饮食诱发疾病领域具有重要用途。
普洱茶是深受广大民众喜爱的茶品，种植和应用历史悠久。中医药学研究表明普洱茶温胃养脾，清补平衡，避免过度伤津耗液。现代科学研究发现，普洱茶的主要活性物质包括茶多酚、儿茶素、黄烷双醇等黄酮类成份以及茶色素、酚酸等。近年来的研究也表明，普洱茶在发酵加工和储存过程中会产生一系列的酶促和非酶促反应，改变茶色素的含量，如发酵后茶黄素和茶红素的含量降低，茶褐素含量升高，这些茶色素含量的变化赋予普洱茶改善高脂高糖诱发疾病的功效，比如茶褐素具有降脂、减肥的保健功效。然而单用普洱茶的减肥作用较弱，比如研究表明每天小鼠灌胃3000mg速溶普洱茶才能够显示降低小鼠体重的作用。而人体实验表明，口服50mg/(kg·d)的速溶普洱茶4个月(相当于60kg体重的成年人每天口服3g)，也没有明显降低体重(Nature Communications,2019,10,4971)。
石斛是经典的药用植物，2020年1月铁皮石斛被国家卫健委批准为药食同源物质试点品种。中医药研究表明石斛性味甘淡微咸，寒，归胃、肾、肺经；用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明，并具有益胃生津，滋阴清热的功效。现代研究发现，石斛活性成份中多糖含量最高，结构独特，是其抗氧化活性、免疫调节作用、抗肿瘤作用等多种生物活性的物质基础(食品科学,2020,41:8)。桑属植物也是药食同源植物，其有效部位包括桑叶、桑枝和桑白皮等，味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏风清热和平肝明目的功效。桑属植物有效部位的黄酮成份具有广泛的生物、药理活性，如抗氧化和清除氧自由基作用、抗炎杀菌作用等，药用价值极高(蚕业科学,2005,31:351-353)。目前还没有普洱茶提取物、石斛多糖提取物和桑属植物有效部位黄酮提取物通过复配改善高脂高糖饮食诱发疾病的报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补普洱茶单用改善降糖、降脂以及非酒精性脂肪肝作用较弱的问题，提供一种含普洱茶、石斛和桑属植物有效部位提取物的复配功能组合物，用于改善高脂高糖饮食诱发的疾病，是一种作用好、副作用低的组合物，具有广阔的应用前景。
本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种复配组合物的制备方法，其主要包括以下步骤：
(1)向普洱茶中加水，50～90℃回流1-5h，过滤，重复以上操作两次以上，合并滤液，浓缩、干燥得普洱茶提取物；
(2)向干燥的石斛中按料液质量比1:(10～60)加水，200-1000rpm搅拌1-4h后，100-500W超声破碎5-30min，向所得的提取液中加入三氯乙酸至终浓度为1.5％(v/v)，沉淀蛋白，用NaOH调节pH至5～8，3000-5000r/min离心10-30min，收集上清，浓缩至原体积的0.1-0.5倍后加无水乙醇沉淀石斛多糖，4℃沉降12-24h，3000-5000r/min离心10-30min，得沉淀，冷冻干燥得石斛多糖提取物；
(3)向干燥的桑属植物有效部位按料液质量比1:(3～15)加乙醇水溶液，室温浸提12-48h，过滤除去残渣后，蒸去溶剂，加入石油醚萃取，除去油脂，所得的混悬液加入体积比1:1的乙酸乙酯-水溶液提取二次以上，将所得的乙酸乙酯相合并，用无水硫酸钠脱水，蒸干溶剂，得桑属植物有效部位黄酮提取物；
(4)将步骤(1)得到的普洱茶提取物与步骤(2)得到的石斛多糖提取物、步骤(3)得到的桑属植物有效部位黄酮提取物混合，获得具有复配的组合物。
进一步地，步骤(1)提取干燥普洱茶时的料液质量比为1:(1～6)。
进一步地，步骤(2)中所述石斛选自铁皮石斛、金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、紫皮石斛、铜皮石斛、环草石斛、马鞭石斛、黄草石斛。
进一步地，步骤(2)沉淀石斛多糖时乙醇终浓度为60-80％(v/v)。
进一步地，步骤(3)中桑属植物有效部位包括桑枝、桑叶和桑白皮。
进一步地，步骤(3)提取桑属植物有效部位时的乙醇水溶液浓度为60-90％(v/v)。
进一步地，步骤(1)所得的普洱茶提取物中茶褐素的含量不低于5％。
进一步地，步骤(2)所得的石斛多糖提取物中多糖含量不低于40％。
进一步地，步骤(2)所得的桑属植物有效部位黄酮提取物中黄酮的含量不低于13％。
本发明还提供了一种由上述制备方法获得的复配组合物，普洱茶提取物、石斛多糖提取物和桑属植物有效部位黄酮提取物的质量份数比为(0.5～5):(0.5～5):1。
本发明还提供了一种功能性食品，包含有上述的复配组合物。
本发明还提供了上述的复配的组合物在改善高脂高糖饮食诱发疾病的食品和/或药品中的应用。
进一步地，所述食品和/或药品的剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、冲服散剂、粉剂、溶液剂等；优选口服剂型，如：冲服散剂、口服液等。
进一步地，所述高脂高糖饮食诱发的疾病为高血糖症、高血脂症和非酒精性脂肪肝。
进一步地，所述食品和/或药品通过抑制α-葡萄糖苷酶活性、提高胰岛素敏感性来增强降糖效果。
进一步地，所述食品和/或药品通过增加对油脂的吸附、减肥、防止脂肪细胞肥大和降低总胆固醇含量作用增强降脂效果。
进一步地，所述食品和/或药品能够通过防止肝细胞肿大和肝脏细胞坏死、减少脂肪空泡等作用增强改善非酒精性脂肪肝效果。
本发明的优点和积极效果
本发明提供了一种由普洱茶、石斛与桑属植物有效部位提取物复配的功能性组合物，通过对普洱茶、石斛和桑属植物有效部位中的有效成份高效、选择性地提取，获得了有效成份提取物，提取物经过复配显示较强的改善高脂高糖饮食诱发疾病作用。主要表现在：可显著降低机体血糖水平，增强胰岛素敏感性，进而改善高血糖症状；可显著增强油脂的吸附作用、降低总胆固醇含量，降低体重，进而改善高血脂症状；可显著防止肝细胞肿大和肝细胞坏死、减少脂肪空泡，进而改善高脂高糖饮食诱发的非酒精性脂肪肝；与普洱茶单用的作用功效相比，具有显著的增效作用，具有明显的应用价值。本发明所述复配功能食品中的原料均属于药食同源植物，绿色健康，副作用低、安全性好等优点，适合产业化应用，具有明显的社会效益和经济价值。
附图说明
图1：不同配比的功能性组合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；图A：普洱茶提取物、石斛多糖提取物与桑叶黄酮提取物复配组合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；图B：普洱茶提取物、石斛多糖提取物与桑枝黄酮提取物复配组合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用；其中，C1-C3为普洱茶提取物单用组；MLF：普洱茶提取物、石斛多糖提取物与桑叶黄酮提取物复配组；MF：普洱茶提取物、石斛多糖提取物与桑枝黄酮提取物复配组；MLF1-7、MF1-7分别是不同配比复配组，各成份配比详见实施例9。
图2：复配功能组合物的体内降糖作用；图A：功能性组合物对前驱糖尿病小鼠餐后血糖(OGTT)的影响；图B：功能性组合物对前驱糖尿病小鼠餐后血糖(OGTT)曲线下面积的影响。统计分析：图B中相同字母之间无显著性差异，不同字母之间有显著性差异(p<0.05)；其中，NC：正常对照组；Pre：前驱糖尿病组；MET：二甲双胍阳性对照组；T：普洱茶提取物单用组；MLF：桑叶黄酮提取物单用组；DP：石斛多糖提取物单用组；MLF+T：复配功能组合物1组，其中普洱茶提取物、石斛多糖提取物和桑叶黄酮提取物的质量比为5:2:2。
图3：复配功能组合物的体内改善胰岛素抵抗作用；图A：复配功能组合物对前驱糖尿病小鼠胰岛素含量的影响；图B：复配功能组合物对前驱糖尿病小鼠胰岛素抵抗指数HOMA-IR的影响。统计分析：图A和图B数据显示法为平均值±标准差，相同字母之间没有显著性差异，不同字母之间有显著性差异(p<0.05)；图中各样品名缩写的含义同图2。
图4：复配功能组合物体内对体重和总胆固醇含量的影响。图A：普洱茶复配功能组合物对前驱糖尿病小鼠体重的影响；图B：普洱茶复配功能组合物对前驱糖尿病小鼠总胆固醇含量的影响。统计分析：图A和图B数据显示法为平均值±标准差，相同字母之间没有显著性差异，不同字母之间有显著性差异(p<0.05)；其中，MF：桑枝黄酮提取物单用组；MF+T:普洱茶复配功能组合物2组，其中普洱茶提取物、石斛多糖提取物和桑叶黄酮提取物的质量比为5:2:2，其他样品名缩写的含义同图2。
图5：复配普洱茶功能组合物体内对脂肪组织形态变化的影响；图中各样品名缩写的含义同图2。
图6：复配普洱茶功能组合物体内对肝脏组织的影响；图中各样品名缩写的含义同图2。
具体实施方式
为能进一步阐述本发明的内容、特点及功效，结合以下具体实施例，并配合附图详细说明。需要注意的是，下述实施例是非限制性的，不以任何方式限制本发明。
本发明使用的材料及方法
如无特别说明，本说明书述及液体溶液的浓度时均指质量浓度。本发明中提取用溶剂均为分析纯试剂。
(一)实验材料
1、实验动物：SPF级C57BL/6小鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司。
2、主要试剂：链脲佐菌素(STZ)购自索莱宝有限公司；胰岛素检测试剂盒购自武汉华美有限公司；总胆固醇(TC)检测试剂盒购自南京建成有限公司；高脂高糖饲料，型号：D12451，购自常州鼠一鼠二生物科技有限公司
(二)实验分析方法
1.普洱茶提取物中茶色素含量分析：
称取3克普洱茶提取物，加入125mL水，沸水浴10min后，用102滤纸过滤，滤液冷却至室温；量取50mL该滤液加入50mL乙酸乙酯，震荡5分钟，待其分层，用95％乙醇将4mL乙酸乙酯层(上层)稀释至25mL(A液)；量取2mL水层并加入6mL水、2mL饱和草酸和15mL 95％乙醇组成总体系25mL(D液)；之后再量取25mL乙酸乙酯层(上层)加入25mL NaHCO3(2.5g/100mL)，摇动30s；4mL的乙酸乙酯层用95％乙醇稀释定容至25mL(C液)；另外量取25mL茶滤液加入25mL丁醇，震荡3分钟，待其分层，取2mL水层并加入6mL水、2mL饱和草酸溶液和15mL95％乙醇组成总体系25mL(B液)。在380nm下测定各组的吸光度，茶黄素(TFs)、茶红素(TRs)和茶褐素(TBs)的含量按照公式(1)-(3)计算。
EA，EB，EC，ED分别为A，B，C，D溶液对应的吸光度值
m——试样干物质含量百分率，％
2.石斛提取物多糖的含量分析：
标准曲线制作:准确称取0.5g分析纯葡萄糖溶于10mL蒸馏水中，制备50mg/mL的标准葡萄糖溶液，将标准溶液分别稀释成0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.5mg/mL溶液，分别取各溶液100μL于试管内，加入200μL的50mg/mL苯酚溶液，混匀后立即在各个管中加入1mL浓硫酸，漩涡混匀，静置30min后在490nm下测定吸收光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标(x)，吸光值为纵坐标(y)，进行线性拟合，得到多糖的标准曲线(以葡萄糖计)(式4)。
y＝0.7291x+0.1395R2＝0.9928 (4)
样品中石斛总多糖含量的测定方法和标准曲线测定方法基本相同，只是将分析纯葡萄糖换为石斛提取物样品。
3.桑属植物有效部位总黄酮的分析方法：
标准曲线的绘制：分别精密吸取0mL、0.2mI、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1mL的芦丁标准品工作溶液(0.2mg/mL)置于试管中。依次加入60％乙醇溶液3mL、5％NaNO2溶液1mL、10％Al(NO3)3溶液1mL、4％NaOH溶液4mL,加水至体系为10mL，摇匀。于510nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标(x)，吸光值为纵坐标(y)，进行线性拟合，得到黄酮的标准曲线(以芦丁计)(式5)。
y＝2.9268x+0.0031 R2＝0.9957 (5)
样品桑属植物有效部位总黄酮含量的测定方法和标准曲线测定方法基本相同，只是将芦丁换为桑属植物有效部位提取物样品。
4.α-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法：
小鼠禁食不禁水24h后断颈处死，取小肠段称重，剪碎，按0.02g/L的比例置于4℃的PBS缓冲液中，用玻璃匀浆器在冰上研磨至均匀。得到的小肠匀浆液在4℃下12000g/min离心5min，取上清即为α-葡萄糖苷酶溶液，-20℃保存。反应在PBS缓冲液中进行，总体积为250μL(125μLPBS缓冲液+50μL酶溶液+25μL样品液+50μL1g/20mL麦芽糖底物)，空白组的酶溶液用等体积的PBS缓冲液代替。原酶组的样品液用等体积的PBS缓冲液代替。体系在37℃孵育20min，沸水浴5min终止反应。冷却至室温用葡萄糖测定试剂盒中的葡萄糖氧化酶法测定反应生成的葡萄糖浓度，在505nm处测定其OD值表示生成的葡萄糖浓度，计算按照式(6)计算α-葡萄糖苷酶抑制率，重复三次。
抑制率(％)＝(OD原酶-OD样品)/(OD原酶-OD空白)×100％ (6)
5.油脂吸附试验：
准确称取普洱茶提取物或复配普洱茶组合物(W1)于50mL离心管中，加入6.0g食用花生油，置于37℃恒温环境静置1h，然后4500r/min离心20min，弃去上层油层并用纸将沉淀上的游离花生油吸干，称重得W2，吸油量按照式(7)计算：
吸油量(g/g)＝(W2–W1)/W1 (7)
6.口服糖耐量实验(OGTT实验)：
小鼠禁食不禁水过夜，每只小鼠腹腔注射剂量为2g/Kg的葡萄糖溶液。葡萄糖溶液浓度为200mg/ml，体重20g的小鼠注射剂量为0.2ml。注射葡萄糖后0min，30min，60min，90min和120min采用尾静脉取血方式测定小鼠血糖值。
实施例1：普洱茶提取物的制备1
称取100g干燥普洱茶与400mL蒸馏水混合，70℃回流2h，过滤，重复三次，合并滤液并浓缩干燥得普洱茶提取物。根据式(1)-(3)茶色素测定方法，测得茶褐素含量为6.47％，高于茶黄素的0.27％和茶红素的1.91％，是普洱茶提取物中主要茶色素。
实施例2：石斛多糖的制备1
将烘干的紫皮石斛10g与200mL蒸馏水混合，500rpm搅拌2h，400W超声破碎20min，柠檬酸调节pH 7.0，加三氯乙酸至终浓度(v/v)为1.5％沉淀蛋白，NaOH调节pH 7，4000r/min转速离心10min，收集上清，65℃真空浓缩至原体积的0.2倍，浓缩液加无水乙醇至终浓度为80％，4℃过夜，4000r/min离心10min，取沉淀，-50℃冷冻干燥得石斛多糖提取物。根据上述多糖测定方法，测得总多糖含量为51％。
实施例3：桑枝黄酮的制备1
称取50g干燥的桑枝嫩皮，粉碎后加入500mL 80％乙醇水溶液于室温浸提24h。粗提液用滤纸抽滤2次，旋转蒸发仪蒸去溶剂，加入石油醚除去油脂，混悬液加入体积比1:1的乙酸乙酯-水溶液提取三次，将乙酸乙酯相合并，用无水硫酸钠脱水后，蒸干溶剂，得到桑枝黄酮提取物。根据上述总黄酮测定方法，测得总黄酮含量为34％。
实施例4：桑叶黄酮的制备1
称取50g干燥桑叶，粉碎后加入500mL 80％乙醇水溶液于4℃浸提24h，得提取液。对提取液进行过滤除去残渣，蒸去乙醇，加入石油醚萃取除去油脂，混悬液加入体积比1:1的乙酸乙酯-水溶液提取三次，将乙酸乙酯相合并，用无水硫酸钠脱水后，蒸干溶剂，得到桑叶总黄酮；根据上述黄酮测定方法，测得总黄酮含量为15.7％。
实施例5：普洱茶提取物的制备2
按照实施例1的方法，只是将加水量调整为200mL(料液比1：2)。根据上述茶色素测定方法，测定普洱茶提取物的茶黄素、茶红素和茶褐素的含量。结果显示茶褐素含量为5.78％，高于茶黄素的0.30％和茶红素的1.79％，是普洱茶提取物中主要茶色素。
实施例6：石斛多糖的制备2
按照实施例2的方法，只是将紫皮石斛换为铁皮石斛，蒸馏水加入量改为400ml(料液比1:40),沉淀多糖的乙醇终浓度调整为60％。根据上述多糖测定方法，测得总多糖含量为45％。
实施例7：桑枝黄酮的制备2
按照实施例3的方法，只是将提取的乙醇浓度调整为70％。根据上述总黄酮测定方法，测得总黄酮含量为33.5％。
实施例8：桑叶黄酮的制备2
按照实施例4的方法，只是将提取的乙醇水加入量调整为250mL(料液比1:5)。根据上述黄酮测定方法，测得总黄酮含量为14.9％。
实施例9：普洱茶提取物、石斛多糖提取物以及桑属植物有效部位黄酮提取物的复配
将普洱茶提取物、石斛多糖提取物以及桑属植物有效部位黄酮提取物按照不同配比进行复配，MF1-MF7为普洱茶提取物、石斛多糖与桑枝黄酮的复配物；MLF1-MLF7为普洱茶提取物、石斛多糖与桑叶黄酮的复配物。各复配组合物中普洱茶提取物、石斛总多糖与桑属植物有效部位黄酮的配比如表1所示。
表1：复配的功能组合物的质量配比
实施例10：不同配比的复配组合物体外对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
根据上述α-葡萄糖苷酶抑制活性测定方法，测定了实施例9中不同配比的复配组合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，并设置了三个普洱茶提取物单用剂量C1、C2和C3，其中C1终浓度200μg/mL，和MF1,MF4～MF7，以及MLF1,MLF4～MLF7复配组的普洱茶提取物终浓度相同，C2终浓度500μg/mL，和MF2以及MLF2复配组中普洱茶提取物终浓度相同，C3终浓度1000μg/mL，和MF3以及MLF3复配组中普洱茶提取物终浓度相同。这些样品抑制α-葡萄糖苷酶活性如图1所示，结果显示，无论是普洱茶提取物、石斛多糖与桑叶黄酮复配的MF1～MF7、还是普洱茶提取物、石斛多糖与桑叶黄酮复配的MLF1～MLF7对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率均显著高于相应的普洱茶提取物单用组。例如复配组MF1、MF4～7、MLF1、MLF4～7的α-葡萄糖苷酶抑制率是单用组C1的10倍以上；复配组MF2、MLF2的α-葡萄糖苷酶抑制率是单用组C2的7倍以上；复配组MF3、MLF3的α-葡萄糖苷酶抑制率是单用组C3的2倍以上。表明不同配比的复配组合物比普洱茶提取物单用，显示更好的降糖活性。
实施例11：不同配比的复配组合物体外对油脂的吸附作用
研究表明，对油脂吸附能力能够反映药物或功能食品降脂的作用(Chem Foods2003,80,221-229)，本发明取实施例9配置的MLF1、MLF2和MLF3考察了复配普洱茶功能组合物对油脂的吸附作用，同样地，用普洱茶提取物单用组C1做对照，其普洱茶提取物含量和MLF1中普洱茶提取物质量相同。结果如表2所示，各组不同配比复配普洱茶组合物MLF1、MLF2和MLF3的每克吸油量分别是普洱茶提取物单用组的1.58倍、2.34倍和4.62倍，表明不同配比的普洱茶复配功能食品显著提高了油脂吸附作用，进而提高降脂作用。
表2：复配普洱茶功能组合物对油脂的吸附作用
实施例12：复配普洱茶功能组合物的降糖作用1
根据体外活性的结果，选取实施例9具有代表性的复配组合物的配比，进行体内实验动物的药效功能研究。
在动物体内实验中使用高脂高糖辅助链脲菌素诱导的前驱糖尿病模型，前驱糖尿病是2型糖尿病的前期，具有和2型糖尿病特征相似，即血糖异常、胰岛素抵抗等，同时模型也能表征与血糖异常密切相关的血脂异常，也能表征非酒精性脂肪肝等病变，是评价高脂高糖饮食诱发疾病的一个较好的模型(Journal of Functional Foods,2017,37,339-353，CN 104840962)。
1、前驱糖尿病鼠模型建立
饲养环境：实验动物饲养于屏障系统动物房中，温度22±2℃，相对湿度40％～60％，控制照明时间为黑天和白天各半，分笼饲养，自由进食及饮水，定时更换垫料清洗鼠笼等。实验动物适应性喂养一周后开始实验。
前驱糖尿病的造模方法参考已发表的文献并做适当修改(Journal ofFunctional Foods,2017,37,339-353)，使用18～22g的C57BL/6小鼠，连续喂养小鼠表1所示高脂高糖食物2周后，每只小鼠腹腔注射45mg/kg链脲佐菌素(STZ)，喂食高脂高糖食物一周后，对注射STZ的小鼠进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)：葡萄糖灌胃量为2g/kg，用血糖仪测定餐后2h血糖值，挑选血糖值大于等于7.8mmol/L且小于11.1mmol/L的小鼠，继续喂食高脂高糖食物3周稳定小鼠血糖，再次对所挑选的小鼠进行口服葡萄糖耐量实验，选取餐后2h血糖值大于等于7.8mmol/L且小于11.1mmol/L的小鼠作为模型小鼠，将模型小鼠和正常小鼠随机分为9组，每组8只，雌雄各半，分别标号，进行后续实验。
2、实验动物分组
小鼠分为正常对照(NC)、模型组(DC)、阳性对照组、单用组、复配组。成模的糖尿病小鼠饲喂高脂高糖饲料，正常组小鼠饲喂动物基础饲料，自由饮食，每天定时灌胃。复配组(复配普洱茶功能组合物1)：主要成份为普洱茶提取物、石斛多糖提取物与桑叶黄酮提取物按5:2:2的质量比复配，具体剂量为普洱茶提取物(250mg/kg)，石斛多糖(100mg/kg)以及桑叶黄酮(100mg/kg)；单用组共3个，分别为普洱茶提取物单用(250mg/kg)、石斛多糖单用(100mg/kg)；桑叶黄酮单用(100mg/kg)；阳性对照为二甲双胍(200mg/kg)，灌胃10周。
给药10周后进行了口服糖耐量实验(OGTT实验)，结果如图2所示，复配普洱茶功能组合物1组和普洱茶提取物单用组、石斛多糖单用组以及桑叶黄酮单用组相比，可显著降低餐后两小时血糖水平，其降糖作用与阳性对照组(二甲双胍)无显著性差异。同时测定了各组的血清胰岛素(FINS)含量和空腹血糖，并计算了胰岛素敏感指数HOMA-IR值(HOMA-IR＝空腹血糖*空腹胰岛素/22.5)，结果显示，和各单用组相比，复配物能够显著增强了胰岛素敏感性，与正常组无显著性差异(图3)，表明本发明提供的复配功能组合物和普洱茶提取物单用相比，能够显著降低餐后血糖、增强胰岛素敏感性，进而提高降糖作用。
实施例13：复配普洱茶功能组合物的降脂作用1
按照实施例12的方法进行实验动物的药效评价，只是将复配普洱茶功能组合物中的桑叶黄酮提取物换成桑枝黄酮提取物，得复配普洱茶功能组合物2，同时把桑叶黄酮提取物单用换为桑枝黄酮提取物单用做对照。复配组(复配普洱茶功能组合物2)具体组成和剂量为：普洱茶提取物组(250mg/kg)，石斛多糖(100mg/kg)以及桑枝黄酮(100mg/kg)；3个单用组：普洱茶提取物单用组(250mg/kg)、石斛多糖提取物单用组(100mg/kg)；桑枝黄酮提取物单用组(100mg/kg)；阳性对照为二甲双胍(200mg/kg)，灌胃10周。测定各组小鼠的体重，计算了其体重变化。检测了其血样中的总胆固醇含量，结果表明，与普洱茶提取物、石斛多糖提取物、桑枝黄酮提取物单用组相比，复配普洱茶功能组合物2组能够显著减轻体重，且优于阳性对照(图4A)，说明其具有更好的减肥、降脂作用。同时复配普洱茶功能组合物2还能显著降低总胆固醇(T-CHO)含量(图4B)，表明复配普洱茶功能组合物是通过降低体重和总胆固醇含量增强了降脂的作用。
实施例14复配普洱茶功能组合物的降脂作用2
将动物实验的实施例12-13中各组的脂肪组织切片，观察其形态和大小。结果如图5所示，正常组脂肪组织的脂肪细胞较小，无细胞肥大现象；而模型组组织出现了严重的脂肪细胞肥大、脂肪堆积的现象。普洱茶提取物单用组、石斛多糖提取物单用组以及桑叶/桑枝黄酮提取物单用组虽然有一定的改善脂肪细胞肥大作用，但作用均较弱，复配普洱茶功能组合物1和2给药后，脂肪组织细胞肥大现象显著减弱，脂质堆积状况明显改善，接近于正常组。因此复配普洱茶功能组合物通过减弱脂肪细胞肥大、改善脂质堆积作用增强了降脂效果。
实施例15复配普洱茶功能组合物改善非酒精性脂肪肝的作用
将动物实验的实施例12-13中各组的肝脏组织进行切片，观察其病变和改善情况。结果如图6所示，正常组肝组织的肝细胞大小均一，无异常和病变；而模型组肝脏出现了严重的病变，是非酒精性脂肪肝的典型症状，表现为细胞肿大，脂肪化严重，甚至出现大面积的细胞坏死和脂肪空泡等情况。虽然普洱茶提取物单用组、石斛多糖提取物单用组或桑叶/桑枝黄酮提取物单用组能使症状得到改善，但作用均较弱。而给药复配普洱茶功能组合物1和2后，肝脏组织细胞肿大、肝细胞坏死的程度显著减弱，脂肪空泡基本消失，接近于正常组。因此普洱茶复配组合物是通过防止肝细胞肿大和肝脏细胞坏死，降低脂肪空泡等作用增强对非酒精性脂肪肝的改善效果。
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