具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

材料和方法：

菌株、细胞株和载体

Mycobacterium bovis BCG(Tokyo-172)和pET-22b载体均购自ATCC菌株中心，

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞均购自天根生化科技有限公司。

主要试剂：

7H9和LB培养基均购自BD生物科学公司，

NdeⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶及相关缓冲液、EMSA试剂盒、M-280羊抗兔抗体磁珠均购自Thermo Fisher Scientific公司，

琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒Gel Extraction Kit和小提质粒试剂盒PlasmidMini Kit I均购自OMEGA公司，

IPTG、氨苄西林抗生素和相关氨基酸均购自Amresco公司，

弗氏不完全佐剂和甲基绿均购自Sigma-ALDRICH公司，

IDDye山羊抗兔免疫球蛋白IgG和山羊抗鼠免疫球蛋白IgG均购自LI-COR公司，

小鼠单克隆抗His抗体购自天根生化科技公司，

放线菌素D购自Alphabio公司，SYBR Green mix购自BIO-RAD公司，ChIP IPURE试剂盒购自Diagenode公司。

实施例1引物设计与合成

参考GenBank数据库中rv0324(Gene ID：886548)基因序列SEQ ID NO:1，分别设计特异性引物SN221f和SN221r，引物信息见表1。

表1引物信息表

实施例2表达重组蛋白Rv0324

1、BCG基因组提取

使用细菌基因组提取试剂盒(天根)提取。

(1)将BCG菌液进行10 000rpm离心1min，弃上清，收集菌液沉淀。

(2)500mL菌液加入约1mL溶菌酶(20mg/mL)分为两管，500μL/管。破碎菌体：超声：35％振幅，on 3s，off 5s，2min，随后研磨棒研磨2min。37℃水浴1h。

(3)每管加入4μL RNase，室温，作用5min。

(4)加入20μL蛋白酶K处理。

(5)加入440μL GB，震荡15s，70℃放置10min，短暂离心。

(6)加入440μL无水乙醇，震荡15s，10 000rpm离心5min。

(7)将上清加入到吸附柱CB3中，10 000rpm离心1min，将流出液再倒入吸附柱中，10 000rpm离心1min，弃流出液。

(8)向吸附柱中加入500μL GD，12 000rpm离心1min，弃流出液。

(9)向吸附柱中加入750μL漂洗液PW，12 000rpm离心1min，弃流出液。

(10)重复步骤(9)一次。

(11)12 000rpm空离2min。

(12)换新EP管，室温静置2min后，用温育的ddH₂O(高压过的)50μL/柱洗脱，10000rpm离心1min。

(13)进行琼脂糖凝胶电泳验证，并测浓度。

2、表达载体构建及表达

以Mycobacterium bovis BCG(Tokyo-172)基因组为模板，扩增rv0324基因，利用连接NdeⅠ和XhoⅠ双酶切rv0324基因片段和pET-22b载体，构建重组质粒pET-22b-rv0324，并转化至E.coliDH5α，双酶切和测序确定重组蛋白的基因序列。将测序正确的重组质粒pET22b-rv0324转化E.coli BL21(DE3)中，于37℃、180r/min摇床中培养至溶液OD600nm为0.8，终浓度1mmol/L的IPTG于30℃、180r/min下诱导表达6h后，收集菌体。超声破碎并收集上清，通过亲和层析法纯化蛋白Rv0324。浓缩Rv0324后，以小鼠单克隆抗His抗体(1:5000)为一抗，山羊抗鼠IDDye荧光素IgG(1:10000)为二抗，用红外荧光扫描仪扫描，通过WesternBlot法分离鉴定Rv0324。-80℃保存蛋白，用于后续实验。

3、蛋白纯化

1)将诱导表达后收集的菌体取出，用80mL裂解液重悬。用细胞超声破碎仪进行超声破碎，37％振幅，超3s，停5s，超声1h至菌液清亮。

2)将超声后的菌液转移到高速离心管中，4℃，10 000离心30min。留上清，弃沉淀。

3)用0.22μM滤膜将上清过滤。

4)取2mL Ni-NTA亲和树脂放入层析柱中，加一柱裂解液，使其自然流下，平衡树脂。

5)将上清加入到层析柱中，自然流下，如此反复5次，使蛋白与树脂充分结合。

6)加两柱ddH₂O，自然流下。

7)分别用洗杂液1、2、3、4、5各100mL进行洗杂。

洗杂液1：20mM Tris-HCl；500mM NaCl；20mM咪唑；3％甘油；PH＝8.0。

洗杂液2：20mM Tris-HCl；500mM NaCl；40mM咪唑；3％甘油；PH＝8.0。

洗杂液3：20mM Tris-HCl；500mM NaCl；50mM咪唑；3％甘油；PH＝8.0。

洗杂液4：20mM Tris-HCl；500mM NaCl；60mM咪唑；3％甘油；PH＝8.0。

洗杂液5：20mM Tris-HCl；1M NaCl；PH＝8.0。

8)加两柱ddH₂O，使其自然流下。

9)然后加入3mL洗脱液到层析柱中，将层析柱放在冰上静置10min，流下洗脱液，此步骤重复2次，得到纯蛋白。

洗脱液：20mM Tris-HCl；150mM NaCl；500mM咪唑；5％甘油；PH＝8.0，

纯化该蛋白后，通过Western Blot实验鉴定，结果显示有一约25ku大小的条带(图1)，与目的蛋白Rv0324大小一致，表明成功表达并获得Rv0324。

实施例3 Rv0324和p/o rv3597c体外结合实验

以Mycobacterium bovis BCG(Tokyo-172)基因组为模板，SN395f/r为引物PCR扩增得到p/o rv3597c，进行凝胶迁移实验(EMSA)。配制EMSA反应体系30μL：1μL 40ng/μL p/orv3597c，6μL 5×Binding Buffer，不同终浓度(0.16μmol/L、0.33μmol/L、0.67μmol/L、0.83μmol/L、0.99μmol/L)Rv0324蛋白，并用ddH₂O补足。于37℃孵育30min后，用8％聚丙烯酰胺凝胶在200V下电泳3h，分离复合物，染色后使用凝胶成像系统，紫外透射成像，以验证Rv0324和p/o rv3597c在体外能结合。5’端Cy5标记引物SN395f/r，PCR扩增BCG(Tokyo-172)基因组得到Cy5标记的p/o rv3597c，与未标记的p/o rv3597c竞争结合Rv0324，进行EMSA。EMSA反应体系30μL：0.5μL 0.1mmol/L Rv0324，1μL 20ng/μL Cy5标记p/o rv3597c，3μL 10×binding buffer，3μL 25mmol/L DTT，1.5μL1mg/mL poly(dI-dC)，1.5μL 50％glycerol，1.5μL 100mmol/L MgCl₂，以及高于Cy5标记p/o rv3597c 60倍和120倍的未标记p/orv3597c，并用ddH₂O补足。37℃下避光孵育30min，8％聚丙烯酰胺凝胶在200V下电泳3h，分离复合物，使用双色红外激光成像系统，扫描成像进行分析，以验证Rv0324和p/o rv3597c体外特异性结合。

0μmol/L、0.16μmol/L、0.33μmol/L和0.67μmol/L的Rv0324分别与p/o rv3597c孵育后，进行EMSA，结果显示，随着Rv0324浓度的升高，游离的p/o rv3597c减少，当Rv0324终浓度为0.67μmol/L时，有一明显滞后带，此时p/o rv3597c完全与Rv0324结合(图2A)，表明Rv0324能与p/o rv3597c在体外结合。

将高于Cy5标记p/o rv3597c的60倍、120倍未标记p/orv3597c，分别和Cy5标记p/orv3597c竞争结合Rv0324，进行EMSA，结果显示，加入60倍的未标记p/o rv3597c后，Rv0324和Cy5标记p/o rv3597c的结合复合物减少，出现游离的Cy5标记p/o rv3597c；加入120倍的未标记p/o rv3597c后，游离的Cy5标记p/o rv3597c增多(图2B)，说明未标记p/o rv3597c可竞争性地抑制Cy5标记p/o rv3597c与Rv0324的结合，表明Rv0324和p/o rv3597c在体外是特异性结合。

实施例4兔抗Rv0324蛋白多克隆抗体的制备

将两只新西兰大白兔设为空白对照组，另外两只新西兰大白兔设为免疫组。等体积比混合Rv0324和弗氏不完全佐剂后，分别皮下注射400μg于免疫组的两只兔，每隔14d注射一次，共三次。空白对照组不做注射处理。对空白组和免疫组进行心脏采血后，制备血清，于-80℃保存。通过辛酸-硫酸铵法、protein G亲和层析柱纯化免疫组血清和空白对照组血清，分别得到Rv0324多克隆抗体及阴性对照血清抗体。将上述重组蛋白Rv0324作为抗原，以Rv0324多抗(1:500)为一抗，山羊抗兔IDDye荧光素IgG(1:10000)为二抗，用红外荧光扫描仪扫描，通过Western Blot法鉴定Rv0324多抗，用于后续染色质免疫共沉淀实验(ChIP)。

将重组蛋白Rv0324乳化后对兔进行免疫，纯化该兔的血清后，通过SDS-PAGE凝胶电泳和western blot鉴定，成功获得了Rv0324蛋白多抗(图3)。使用Rv0324多抗进行ChIP，对ChIP中收集到的DNA进行qRT-PCR实验，采用Ct差值比较法进行分析，结果显示，阴性对照组中p/o rv3597c的富集度是0.53；多抗组中p/o rv3597c的富集度是1.57，是对照组的2.96倍(图4)，表明Rv0324能与p/o rv3597c在菌体内结合，Rv0324直接调控rv3597c的转录。

实施例5Rv0324和p/o rv3597c体内结合实验

进行染色质免疫共沉淀实验(ChIP)，将BCG培养至溶液OD_600nm为0.8时，以终浓度为1％甲醛进行交联10min，终浓度125mmol/L甘氨酸作用5min终止反应后，3500r/min离心20min，收集菌体。加入3mL IP Buffer重悬菌体沉淀，超声破碎后，转移上清至新EP管中。取上清100μL进行反交联，通过酚氯仿法提取菌体中的DNA后，琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段大小。将上述1.6中制备的Rv0324多克隆抗体20μL和阴性对照血清抗体20μL分别同M-280羊抗兔抗体偶联包被磁珠于4℃孵育，作为多抗组和阴性对照组，取超声破碎后上清1.2mL同包被磁珠于4℃孵育16h。洗涤磁珠后，使用IPURE试剂盒收集磁珠上的复合物，纯化分离复合物中的DNA，通过乙醇沉淀得到DNA。

将上述收集的DNA稀释1000倍后作为模板，以引物SN9f/r扩增的sigA作为管家基因，通过引物SN398f和SN398r对样品进行荧光染料法qRT-PCR，每组重复3次，使用LightCycler 480软件分析，采用Ct差值比较法，运用2^(-ΔΔCt)公式计算多抗组和阴性对照组中p/o rv3597c的富集度，比较富集度间的差异，以验证体内Rv0324和p/o rv3597c的结合。

实施例6Rv0324和p/o rv3597c的大沟小沟特异性结合实验

根据甲基绿和DNA大沟结合、放线菌素D与DNA小沟结合的特异性，将Cy5标记的p/orv3597c与Rv0324混合后，再分别与不同浓度的甲基绿或放线菌素D混合，进行EMSA。

EMSA反应体系(30μL)：

1μL 0.1mmol/L Rv0324，1μL 40ng/μL Cy5标记p/o rv3597c，3μL10×bindingbuffer，3μL 25mmol/L DTT，1.5μL 1mg/mL poly(dI-dC)，1.5μL 50％glycerol，1.5μL100mmol/L MgCl₂，以及终浓度分别为0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.25mmol/L、1.25mmol/L的甲基绿或放线菌素D，并用ddH₂O补足。

37℃下避光孵育30min，8％聚丙烯酰胺凝胶在200V下电泳3h，分离复合物，使用双色红外激光成像系统扫描成像，分析Rv0324结合在p/o rv3597c上的主要区域。

利用甲基绿和放线菌素D分别同DNA的大沟和小沟结合的特异性，将不同浓度甲基绿或放线菌素D与Rv0324以及Cy5标记的p/o rv3597c进行孵育，进行EMSA，结果显示，0.01mmol/L的甲基绿作用后，出现游离的p/o rv3597c条带，抑制了Rv0324和p/o rv3597c复合物的形成；而加入放线菌素D进行作用时，放线菌素浓度从0.01mmol/L升至1.25mmol/L，游离的p/o rv3597c片段未见变化(图5)。这表明甲基绿抑制了p/o rv3597c和Rv0324间的相互作用，Rv0324是与p/o rv3597c的大沟区域进行相互作用。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 申请人信息

<120> 结核分枝杆菌的重组蛋白、表达载体、重组工程菌及其应用

<130> 案号

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 90

<212> PRT

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 1

Glu Ala Gly Glu Val Thr Leu Val Asp Val Arg Pro His Glu Glu Tyr

1 5 10 15

Gln Ala Gly His Ile Pro Gly Ala Ile Asn Ile Pro Ile Ala Glu Leu

20 25 30

Ala Asp Arg Leu Ala Glu Leu Thr Gly Asp Arg Asp Ile Val Ala Tyr

35 40 45

Cys Arg Gly Ala Tyr Cys Val Met Ala Pro Asp Ala Val Arg Ile Ala

50 55 60

Arg Asp Ala Gly Arg Glu Val Lys Arg Leu Asp Asp Gly Met Leu Glu

65 70 75 80

Trp Arg Leu Ala Gly Leu Pro Val Asp Glu

85 90

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 2

atggctggac agtccgatcg taaggcggcg ttgttggacc aggtagcgcg cgtgggcaag 60

gcgctggcca atgggcggcg attgcaaatc ctggacttgc tcgcccaagg tgagcgcgcg 120

gtagaagcga tcgcgacggc gaccgggatg aacctgacca cggcatcggc gaatctgcag 180

gcgctgaaga gcggcgggct ggtcgaggct cgccgcgagg ggacccggca gtactaccgg 240

attgctgggg aagacgtggc aaggctgttc gcgctggtgc aagtggttgc cgacgagcat 300

ctggccgacg tggcggtcgc ggccgcagac gtgctcggtt cgccggagga tgcgatcacc 360

cgtgcggagc tgctgcggcg gcgcgaagcc ggcgaggtca ccctggtcga cgtgcgaccg 420

cacgaggaat accaggccgg ccatatcccg ggcgccatca atatcccgat agccgaactg 480

gccgaccggc tcgccgaact aactggcgac cgcgacattg tcgcctactg tcgtggtgcc 540

tactgcgtca tggcccccga tgccgtccgc atcgcgcgcg acgcggggcg ggaggtgaaa 600

cgcctcgacg acggaatgct cgaatggcga ttggccggac tgccggtcga cgagggtgca 660

ccggtcgggc atggggattg a 681

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggaattcca tatggctgga cagtccgatc 30

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgaga tccccatgcc cgac 24

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccag tcattcatcg actcatgcc 29

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatccat gcatagctat tctcttttgt taatttgc 38