阅读说明：本技术 结核分枝杆菌的蛋白片段、基因片段、检测试剂盒及制备方法与应用 (Protein fragment, gene fragment and detection kit of mycobacterium tuberculosis, and preparation method and application thereof ) 是由 吴利 黄灵 葛章文 陈泽慧 廖萍 李芙蓉 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本申请提供了结核分枝杆菌的蛋白片段、基因片段、检测试剂盒及制备方法与应用,属于医学及生物工程领域。本申请提供的结核分枝杆菌的蛋白片段,具有较好的特异性,通过原核表达的方式表达得到的蛋白片段,在保持蛋白片段的抗原特异性的基础上；能快速和大量的获得目的蛋白片段；方便进行检测和分析。结核分枝杆菌的蛋白片段与抗结核分枝杆菌的抗体进行反应,能检测抗体的灵敏度和特异性情况；具备较好的应用价值。(The application provides a protein fragment, a gene fragment, a detection kit and a preparation method and application of mycobacterium tuberculosis, belonging to the field of medical science and bioengineering. The protein fragment of mycobacterium tuberculosis provided by the application has better specificity, and the protein fragment obtained by expression in a prokaryotic expression mode is on the basis of keeping the antigen specificity of the protein fragment; the target protein fragment can be obtained rapidly and massively; convenient detection and analysis. The protein fragment of the mycobacterium tuberculosis reacts with the antibody of the mycobacterium tuberculosis, so that the sensitivity and specificity of the antibody can be detected; has better application value.)

结核分枝杆菌的蛋白片段、基因片段、检测试剂盒及制备方法 与应用

技术领域

本申请主要涉及医学及生物工程领域，具体而言，涉及结核分枝杆菌的蛋白片段、基因片段、检测试剂盒及制备方法与应用。

背景技术

目前临床上诊断结核性胸腔积液的结核分枝杆菌抗原主要有：结核抗体38KD、16KD，但其灵敏度和特异性均不能满足WHO提出的结核抗体诊断的灵敏度应该达到80％以上，特异度达到95％以上的要求。

申请内容

本申请的第一方面，公开了结核分枝杆菌的蛋白片段，蛋白片段包括Rv1419片段和Rv2041c片段；Rv1419片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Rv2041c片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

Rv1419片段和Rv2041c片段是结核分期杆菌HRV37株的标志性抗原片段，因此利用HRV37株Rv1419片段和Rv2041c片段能起到较好的检测和分析结核分期杆菌的目的。

本申请的第二方面，公开了结核分枝杆菌的基因片段，基因片段包括编码Rv1419蛋白的Rv1419基因片段，和编码Rv2041c蛋白的Rv2041c基因片段；Rv1419的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Rv2041c基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本申请的第三方面，公开了结核分枝杆菌的检测试剂盒，检测试剂盒还包括Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段。

在实施例中，通过在试剂盒中保留Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段，就能通过Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段快速实现样本的检测。

本申请第四方面，公开了核分枝杆菌的检测试剂盒的制备方法，制备方法包括以下步骤：

分别合成Rv1419基因片段和Rv2041c基因片段，并通过DNA连接酶分别将Rv1419基因片段和Rv2041c基因片段连接到表达质粒，得到重组表达质粒；

将重组表达质粒转化入宿主细胞，通过培养并诱导表达，得到Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段。

在实施例中，通过合成编码Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段的基因片段，并将基因片段连接到表达质粒中，通过诱导表达，就能获得大量的Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段，就可以应用于检测。

前述的第四方面的一些实施例中为表达质粒为pET-21b和pET28a。

通过表达质粒，就能通过诱导，快速准确的表达出目的蛋白，并通过纯化，得到Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段。

在前述的第四方面的一些实施例中，诱导表达的诱导剂为IPTG，所述诱导剂的终浓度为1mmol/L。

在实施例中，通过IPTG诱导质粒大量表达目的蛋白。乳糖类似物IPTG的主要功能是解除阻遏物对Lac或Tac启动子，诱导重组蛋白bFGF的产生，采用摇瓶实验测定了IPTG对E.coliJM103的生长的影响。IPTG对不含质粒的E.coliJM103的最大生长速率和最终细胞密度无明显影响，而对于含质粒的E.coliJM103-pUC18-bFGF的最大生长速率和最终细胞密度不论是否加入IPTG，其结果均比不含质粒的JM103低，说明含外源基因的细胞不论外源基因表达与否，都能影响宿主细胞的生长，只不过外源基因在表达后，其对宿主细胞的生长影响表现得更加明显。用IPTG诱导表达有活性的色氨酸酶，IPTG浓度对色氨酸酶的活性有较大的影响,而且低温有利于活性表达；但是，太低的温度会影响菌体的生长速度，延长发酵周期。

在前述的第四方面的一些实施例中，诱导表达的时间为450-500min。

在实施例中，通过450-500min的诱导，能保证菌体保持高效的表达蛋白。

在前述的第四方面的一些实施例中，宿主细胞为大肠杆菌，宿主细胞为大肠杆菌Arctic Express。

在实施例中，宿主细胞有很多选择，本申请中选择大肠杆菌作为宿主细胞，是因为大肠杆菌生长周期段，能快速获得大量的菌体，并进行大量的目的蛋白的表达。

大肠杆菌也有很多种菌株，不同的菌株使用的场景不同，本实施例中优选大肠杆菌为HB101型大肠杆菌菌株。

本申请的第五方面，公开了结核分枝杆菌的蛋白片段检测抗结核分枝杆菌的抗体中应用，包括使用Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段检测样本中是否含有抗结核分枝杆菌的抗体；抗体的靶向序列为Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段；Rv1419蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Rv2041c蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示

在前述第五方面的一些实施例中，使用Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段检测样本中是否含有抗结核分枝杆菌的抗体采用酶联免疫吸附的方法进行检测。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请提供的结核分枝杆菌的蛋白片段，具有较好的特异性，通过原核表达的方式表达得到的蛋白片段，在保持蛋白片段的抗原特异性的基础上；能快速和大量的获得目的蛋白片段；方便进行检测和分析。结核分枝杆菌的蛋白片段与抗结核分枝杆菌的抗体进行反应，能检测抗体的灵敏度和特异性情况；具备较好的应用价值。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例公开了一种结核分枝杆菌的蛋白片段，蛋白片段包括Rv1419片段和Rv2041c片段；Rv1419片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Rv2041c片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

Rv1419蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：AVFDVAVLNAGAASADGPVQLKSRLGDVCLDAPSGSWFSPLVINPCNGTDFQRWNLTDDRQVESVAFPGECVNIGNALWARLQPCVNWISQHWTVQPDGLVKSDLDACLTVLGGPDPGTWVSTRWCDPNAPDQQWDSVP。

Rv2041c蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MVNKPFERRSLLRGAGALTAASLAPWAAGCAADDDDALTFFFAANPDELRPRMRVVNEFQRRYPDIKVRALLSGPGVMQQLATFCAGGKCPDVLMAWELTYAELADRGVLLDLNTLLARDQAFAAELKSDSIGALYETFTFNGGQYAFPEQWSGNFLFYNKQLFDDAGVPPPPGSWERPWSFAEFLDAAQALTKQGRSGRDRQWGFVNAWVSFYAAGLFAMNNGVPWSVPRMNPTHLNFDHDGFLEAVQFYADLTNKHKVAPSAAEQQSMSTADLFSVGKAGIALAGHWRYQTFDRADGLDFDVAPLPIGPRGRAACSDIGVTGLAIAATSRRKDQAWEFVKFATGPVGQALIGESRLFVPVLRSAINSHGFANAHRRVGNLAVLSEGPAYSEGLPVTPAWEKIAALMDRYFGPVLRGSRPATSLTGLSQAVDEVLRNP。

本实施例还公开了结核分枝杆菌的基因片段，基因片段包括编码Rv1419蛋白的Rv1419基因片段，和编码Rv2041c蛋白的Rv2041c基因片段；Rv1419的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Rv2041c基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

当然编码Rv1419蛋白和编码Rv2041c蛋白的基因片段可以有实际需要进行密码子优化选择，本实施例中优选如SEQ ID NO.3所示和如SEQ ID NO.4所示的序列。

实施例2

本实施例公开了一种结核分枝杆菌的检测试剂盒及其制备方法，结核分枝杆菌的检测试剂盒包括Rv1419蛋白片段和Rv2041c蛋白片段。

通过基因合成的方式合成如SEQ ID NO.3所示和如SEQ ID NO.4所示的基因片段。

在合成的Rv1419基因片段和Rv2041c基因片段两端分别添加酶切位点，通过双酶切，然后用连接酶连接的方式，将Rv1419基因片段(带NdeI和XhoI酶切位点)连接到pET-21b质粒上，得到重组质粒pET-21b-Rv1419；将Rv2041c基因片段(带NdeI和XhoI酶切位点)连接到pET28a载体上，得到重组质粒pET28a-Rv2041c。将上述重组质粒pET-21b-Rv1419和pET28a-Rv2041c分别转化进TOP10克隆菌株中，进行培养提取重组质粒。

将提取的重组质粒进行双酶切，并进行电泳验证，重组质粒pET-21b-Rv1419的酶切结果如图1所示，泳道1表示酶切前的质粒，泳道2表示酶切后的质粒片段，泳道M表示Marker(各个条带分别为200,500,800,1200,2000,3000和4500bp)，电泳结果与实际一致。

重组质粒pET28a-Rv2041c的电泳图如图2所示，泳道1表示酶切前的质粒，泳道2表示酶切后的质粒片段，泳道M表示Marker(各个条带分别为1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,10000bp)，电泳结果与实际一致。

电泳验证正确的重组质粒，送样进行测序，测序结果与实际一致，没有序列突变的情况。

实施例3

本实施了对获得验证正确的质粒进行目的蛋白的诱导表达和分析

将获得的正确的重组质粒pET-21b-Rv1419和pET28a-Rv2041c分别转化进大肠杆菌Arctic Express进行诱导表达。

包括以下步骤：

1、将重组质粒1μL加入到100μL的大肠杆菌Arctic Express感受态细胞中，置于冰上20min；

2、在42℃热激90s，迅速置于冰中5min，加入600的LB培养基；

3、37℃条件下，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含终浓度为50μg/mL的Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜；

4、挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL的Amp的3mL的LB培养液的试管中，37℃条件下，220rpm振摇过夜；

5、按照1:100的比例接种于含50μg/mL的Amp的30mL的LB培养液，37℃条件下，220rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8；

6、向培养基中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃条件下，220rpm振摇过夜；

7、取出1mL培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

8、剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬；

9、进行12％SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。

重组质粒pET-21b-Rv1419和pET28a-Rv2041c进行诱导获得目的蛋白分别进行SDS-PAGE实验，Rv1419和Rv2041c蛋白片段SDS-PAGE实验结果如图3和图4所示。

图3中，M表示蛋白质分子质量标准，泳道1表示未诱导，泳道2表示诱导后，泳道3表示破碎后的上清液，泳道4表示破碎后的沉淀。可以看出目的片段出现在泳道4即破碎后的沉淀中。

图4中，M表示蛋白质分子质量标准，泳道1表示未诱导，泳道2表示诱导后，泳道3表示破碎后的上清液，泳道4表示破碎后的沉淀。可以看出目的片段出现在泳道4即破碎后的沉淀中。

综上可以发现，目的片段主要存在于破碎样品的沉淀中。

实施例4

本实施例主要对破碎样品的沉淀中目的片段进行提取、纯化和检测

包涵体样品的变复性

1.1将沉淀重悬于20mL裂解液(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF和bacteriaprotease inhibitor cocktail，pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)

1.2将超声破碎的细胞裂解液4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀；

1.3使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％TritonX-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；

1.4用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000r/mim离心15min；

1.5将上述溶液滴加20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，0.15MNaCl，pH8.0溶液中透析过夜；

再次进行Ni柱纯化

2.1利用低压层析系统，上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱；

2.2用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

2.3用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

2.4用Ni-IDA ELution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

2.5上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS进行透析过夜，进行12％SDS-PAGE分析。

Rv1419和Rv2041c蛋白样品进行纯化，然后进行SDS-PAGE分析；结果如图5和图6所示。

在图5和图6中，M表示蛋白质分子质量标准，泳道1表示破碎后处理的样品，泳道2表示流出液，泳道3表示洗脱液。从结果看通过纯化，都能获得较好的纯化样品，尤其是Rv2041c蛋白样品。

将获得蛋白样品分别进行Western Blot分析

Western Blot分析中的一抗使用的鼠抗His抗体，稀释比例1:1000；二抗为羊抗鼠，稀释比例1:5000。

实验结果如图7和图8所示，通过Western Blot检测分析，看出本实验制备的样品具有较好的特异性。

实施例5

本实验选择Rv2041c蛋白样品对待检样本中抗结核分枝杆菌抗体进行检测的ELISA实验

包括以下步骤：

1.1用PBS包被液将Rv2041c蛋白稀释成5μg/mL，混匀后加入板条中，每孔100μL，4℃冰箱过夜；

1.2包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃恒温箱1h,取出酶标板，弃去内液，洗板1次；

1.3阴性血清、阳性血清1:500稀释，加入孔中，空白孔为PBST，每孔100μL，分别做复孔，37℃恒温箱1h；

1.4取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μL稀释好的酶标二抗，酶标二抗：山羊抗人-HRP，1:40,000；37℃恒温箱1h；

1.5取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，10min；

1.6每孔加入100μL浓度为1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。

结果中通过间接ELISA检测阴阳性血清得出，4个阳性血清中最低OD平均值为0.3745，低于此值判定为阴性；4个阳性血清中最高OD平均值为0.8205，高于此值判定为强阳性；OD值在0.3745～0.8205之间判定为阳性。其中强阳性5个，阳性103个，阴性92个。

可以看出，通过本实验提供的Rv2041c蛋白能准确的检测样本中的抗体。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。