阅读说明：本技术 一种用于制备***疫苗的分子内佐剂及其应用和***疫苗 (Intramolecular adjuvant for preparing foot-and-mouth disease vaccine, application thereof and foot-and-mouth disease vaccine ) 是由 常惠芸 雷垚 邵军军 李扬帆 常艳燕 张永光 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于制备口蹄疫疫苗的分子内佐剂及其应用和口蹄疫疫苗,属于基因工程疫苗技术领域,所述分子内佐剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的分子内佐剂能够明显增强FMD的免疫应答,显著提高了多表位免疫原的抗原广谱性。(The invention provides an intramolecular adjuvant for preparing a foot-and-mouth disease vaccine, application thereof and the foot-and-mouth disease vaccine, belonging to the technical field of genetic engineering vaccines, wherein the amino acid sequence of the intramolecular adjuvant is shown as SEQ ID NO: 1 is shown. The intramolecular adjuvant provided by the invention can obviously enhance the immune response of FMD, and obviously improve the broad-spectrum antigen of multi-epitope immunogen.)

一种用于制备***疫苗的分子内佐剂及其应用和*** 疫苗

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗技术领域，尤其涉及一种用于制备***疫苗的分子内佐剂及其应用和***疫苗。

背景技术

***(Foot-and-mouth disease，FMD)是由***病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)感染猪、牛、羊等偶蹄动物引起的一种急性、热性和高传染性动物疫病。近年来，包括中国在内的许多国家发生了一系列A型和O型***疫情，造成了严重的经济损失。目前***灭活疫苗仍是预防和控制***的主要手段，但是鉴于灭活疫苗在生产中存在的安全隐患，研制新型安全有效的***亚单位疫苗刻不容缓。随着基因工程技术的不断发展，对于***新型疫苗的研发也已经取得了可喜的成就，主要包括合成肽疫苗，多表位疫苗，病毒样颗粒疫苗等。其中表位疫苗作为最具有发展前景的疫苗之一，相比于传统的疫苗具有很大的优势，其主要由病毒的多个抗原表位串联组合而成，可以随时根据流行毒株的不同来调整表位序列，同时可以加入不同亚型毒株的抗原表位来增强表位疫苗的广谱性。

抗原多肽作为小分子免疫原，其产生的免疫原性较弱，从而对病原体不会产生很强的免疫应答反应。一个设计合理的表位疫苗主要包括三种成分：表位肽，递呈系统，以及佐剂。对于多表位疫苗，传统的佐剂的免疫增强效果不是很理想。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于制备***疫苗的分子内佐剂及其应用和***疫苗。本发明提供的分子内佐剂能够明显增强FMD的免疫应答，显著提高了多表位免疫原的抗原广谱性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于制备***疫苗的分子内佐剂，所述分子内佐剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种编码上述方案所述分子内佐剂的氨基酸序列的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的分子内佐剂在制备疫苗中的应用。

本发明还提供了一种***疫苗，包括上述技术方案所述的分子内佐剂和***病毒多表位抗原。

优选地，所述***疫苗是分子内佐剂与***病毒的多表位抗原融合表达后，得到的重组蛋白。

优选的，所述***病毒多表位抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的***病毒多表位抗原的氨基酸序列的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，所述***病毒为***A型病毒和***O型病毒。

本发明的有益效果：本发明提供了一种用于制备***疫苗的分子内佐剂。本发明提供的分子内佐剂为结核分枝杆菌的肝素结合血凝素蛋白(heparin-bindinghemagglutinin,HBHA)，HBHA片段与***病毒的多表位抗原融合表达后，制备疫苗免疫动物，能够显著加强多表位抗原的免疫原性，产生高水平的保护性中和抗体以及细胞免疫应答；其能够显著促进树突状细胞的成熟与分化，特异性T淋巴细胞的增殖以及与细胞因子的表达。本发明提供的分子内佐剂能够明显增强多表位免疫原的体液以及细胞免疫应答，是一种很好的免疫刺激剂。

附图说明

图1为各免疫组血清样品A型FMDV特异性IgG的动态变化图；

图2为各免疫组血清样品O型FMDV特异性IgG的动态变化图；

图3为各免疫组血清样品FMDV中和抗体水平图；

图4为各免疫组淋巴细胞经灭活FMDV抗原刺激后增殖水平图；

图5为各免疫组血清中细胞因子水平图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于制备***疫苗的分子内佐剂，所述分子内佐剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：MAENPNIDDLPAPLLAALGAADLALATVNDLIANLRERAEETRAETRTRVEERRARLTKFQEDLPEQFIELRDKFTTEELRKAAEGYLEAATNRYNELVERGEAALQRLRSQTAFEDASARAEGYVDQAVELTQEALGTVASQTRAVGERAAKLVGIELPGKAEAAGKKAQKAIAKAPAKKASAKKAPAKKAPAKKAAAKKVTQK。

本发明还提供了一种编码上述方案所述分子内佐剂的氨基酸序列的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：ATGGCGGAAAACCCGAACATCGACGACTTGCCAGCCCCGCTGCTCGCGGCCCTGGGCGCGGCCGACCTGGCCCTGGCCACGGTCAACGACCTGATCGCCAACCTGCGCGAGCGGGCCGAGGAGACCCGCGCCGAGACCCGCACCCGGGTCGAGGAGCGCCGCGCCCGGCTGACCAAGTTCCAGGAGGACCTGCCCGAGCAGTTCATCGAGCTGCGCGACAAGTTCACCACCGAGGAGCTGCGCAAGGCGGCCGAGGGCTACCTGGAGGCGGCGACCAACCGGTACAACGAGCTGGTCGAGCGCGGCGAGGCGGCCCTGCAGCGGCTGCGCAGCCAGACCGCCTTCGAGGACGCCTCCGCGCGCGCCGAGGGCTACGTGGACCAGGCCGTCGAGCTGACCCAGGAGGCGCTGGGCACCGTCGCGTCGCAGACCCGCGCGGTCGGTGAGCGCGCCGCCAAGCTGGTGGGCATCGAGCTGCCGGGCAAGGCCGAGGCCGCCGGCAAGAAGGCCCAGAAGGCCATCGCCAAGGCCCCCGCCAAGAAGGCGTCGGCCAAGAAGGCCCCCGCCAAGAAGGCGCCGGCCAAGAAGGCCGCGGCCAAGAAGGTCACCCAGAAG。

在本发明中，所述SEQ ID NO：3序列是根据GenBank上HBHA的基因序列(登录号KC920678.1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成的。

本发明还提供了上述技术方案所述的分子内佐剂在制备疫苗中的应用。在本发明中，所述分子内佐剂制备疫苗时，优选包括将所述分子内佐剂和***病毒的多表位抗原混合后乳化制备而成；所述分子内佐剂和***病毒的多表位抗原的体积比为2:1。在本发明中，所述分子内佐剂制备疫苗时，更优选包括将所述的分子内佐剂与***病毒的多表位抗原融合表达后，得到的重组蛋白自身作为疫苗制剂。本发明提供的分子内佐剂能够显著加强多表位抗原的免疫原性。

本发明还提供了一种***疫苗，包括上述技术方案所述的分子内佐剂和***病毒多表位抗原。在本发明中，所述***疫苗是分子内佐剂与***病毒的多表位抗原融合表达后，得到的重组蛋白。在本发明中，所述***病毒多表位抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：MAENPNIDDLPAPLLAALGAADLALATVNDLIANLRERAEETRAETRTRVEERRARLTKFQEDLPEQFIELRDKFTTEELRKAAEGYLEAATNRYNELVERGEAALQRLRSQTAFEDASARAEGYVDQAVELTQEALGTVASQTRAVGERAAKLVGIELPGKAEAAGKKAQKAIAKAPAKKASAKKAPAKKAPAKKAAAKKVTQK。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的***病毒多表位抗原的氨基酸序列的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：GCGGCGATCGAGTTCTTTGAGGGTATGGTGCACGACAGCATTAAGGGTGGCAGCAGCGGTGGCAAATACAGCGCGCCGCAGAACCGTCGTGGTGATAGCGGTCCGCTGGCGGCGCGTCTGGCGGCGCAACTGCCGGCGAGCTTCGGTGGCAGCAGCGGTGGCAAGTATAGCGCGCCGGCGACCCGTCGTGGTGACCTGGGCACCTGGCGGCGCGCTTAGCTGCTCAATTACCGGCGAGCTTTGGTGGCAGCAGCGGTGGCAAATATAGCACCGGTAACGCGGGTCGTCGTGGTGATTTAGGCAGCCTGGCTGCGCGTGTTGCGGCGCAGTTACCTGCGAGCTTCGGTGGCAGCAGCGGTGGCCGTCACAAGCAGAAAATCATTGCGCCGGCGAAGCAACTGCTGGGTGGCAGCAGCGGTGGCAAATACGGCGAGAGCCCGGTGACCAACGTTCGTGGCGACCTGCAGGTTCTGGCGCAAAAAGCGGCGCGTACCCTGCCGGGTGGCAGCAGCGGTGGCAAATATGCGGGTGGCAGCCTGCCGAACGTGCGTGGTGATCTGCAGGTGCTGGCGCAGAAAGCGGCGCGTCCGTTACCGGGTGGCAGCAGCGGTGGCAGGCACAAGCAGAAAATCGTGGCGCCGGTTAAACAGTTACTGGGTGGCAGCAGCGGTGGCGCGGCGATTGAATTCTTTGAGGGCATGGTTCACGACAGCATTAAG。

在本发明中，所述***病毒为***A型病毒和/或***O型病毒。在本发明中，所述***病毒多表位抗原是根据GenBank现有的A型FMDV(登录号：KF450794.1)和O型FMDV(登录号：AJ318831.1)的基因序列，分别选取A型和O型FMDV VP1上的两个B细胞表，即VP1134-161位和200-213位氨基酸，且每个表位进行两个重复串联，通过linker序列GGSSGG连接起来形成的。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

***病毒多表位抗原(HAO)的制备

1、重组A型、O型***二价多表位抗原的设计与基因合成

根据GenBank现有的A型FMDV(登录号：KF450794.1)和O型FMDV(登录号：AJ318831.1)的基因序列，分别选取A型和O型FMDVVP1上的两个B细胞表，即VP1134-161位和200-213位氨基酸，且每个表位进行两个重复串联，通过linker序列GGSSGG连接起来，形成新的表位盒HAO,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示，并将该串联表位盒的基因序列送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，直接合成到pET-28a表达载体上，两端的酶切位点是BamH I和Hind III，获得质粒pET-28a-HAO，命名为pHAO。

2、重组抗原HAO的表达与纯化

将阳性质粒pHAO转化至BL21感受态细胞。挑取单克隆于5mL含卡那抗性的LB培养基中，37℃220rmp摇床培养过夜，将5mL菌液按1％的转接比例，转接到500mL的卡那LB培养基中，继续37℃220rmp摇床培养，等到菌液的OD600达到0.4-0.6时，加入IPTG进行诱导，使其终浓度0.5mM，接着37℃220rmp摇床培养8h，5000rmp离心收集菌体，收集的菌体用PBS洗一遍后，用binding buffer(0.5M NaCl,50mM Tris,5mM咪唑；pH 8.0)将菌体重悬，超声裂解菌体，12000rmp离心，分为包涵体和上清两部分，并将两部分分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示HAO表达形式为包涵体形式。重组蛋白HAO按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(GE)说明书纯化包涵体蛋白,纯化后的蛋白采用尿素梯度透析的方法复性包涵体蛋白。将纯化后的蛋白装入透析袋中，然后透析袋两端封闭好放入复性液中(0.5M NaCl,50mM Tris，0.5mMEDTA，6M Urea，10％甘油，2mM GSH,0.2mM GSSG，PH 7.3)，并每隔8h换一次透析液，且同时依次降低尿素的浓度(6M、4M、2M、0M),最后用PBS透析8h，获得复性后的重组蛋白。纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Westernblotting分析，重组蛋白HAO大小与预期相符，能与FMDV(A型以及O型)感染血清发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性，表达的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2

重组蛋白HBHA的制备

1、HBHA基因的合成

根据GenBank上HBHA的基因序列(登录号KC920678.1)，并将其基因序列送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，合成至克隆载体pUC57，两端酶切位点为Hind III和Xho I，该质粒命名为pUC57-HBHA。以合成的HBHA基因为模板，设计一对含有酶切位点BamH1(GGATCC)和XhoI(CTCGAG)的引物，对HBHA基因进行PCR扩增，引物为(SEQ ID NO：5：5’-CGGGATCCATGGCCGAAAACCCG-3’，SEQ ID NO：6：5’-ccgctcgagtttctgggtcactttttt-3’)从而得到在5’端含有BamH1酶切位点，3’端含有XhoI酶切位点的HBHA核酸产物。扩增产物通过PCR产物纯化试剂盒纯化之后，用BamH I和Xho I进行双酶切，同时使用该两种内切酶对质粒pET-28a也进行双酶切，并通过T4连接酶进行连接，从而构建出重组质粒pET-28a-HBHA，命名为pHBHA。

2、重组蛋白HBHA的表达与纯化

将重组质粒pHBHA按照实施例1中的蛋白表达程序进行表达，经SDS-PAGE验证，重组蛋白HBHA为可溶性表达，重组蛋白HBHA按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(GE)说明书纯化该可溶性蛋白,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，结果显示，蛋白HBHA不能与FMDV感染性血清发生免疫反应；且能与抗组氨酸单抗发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性，表达的重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例3

重组融合蛋白HAO-HBHA的制备

1、重组融合蛋白HAO-HBHA表达质粒的构建

用Hind III和Xho I分别将两种质粒pET-28a-HAO以及pUC57-HBHA进行双酶切，并通过T4连接酶进行连接，转化等。从而构建出重组质粒pET-28a-HAO-HBHA，命名为pHAO-HBHA。

2、重组融合蛋白HAO-HBHA的表达与纯化

将重组质粒pHAO-HBHA按照实施例1中的蛋白表达程序进行表达，经SDS-PAGE验证，重组蛋白HAO-HBHA为可溶性表达，重组蛋白HBHA按照Ni-NTA组氨酸纯化柱(GE)说明书纯化该可溶性蛋白,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析，结果显示，蛋白HAO-HBHA能与FMDV(A型以及O型)感染性血清发生免疫反应；且能与抗组氨酸单抗发生免疫反应，说明表达的重组蛋白具有生物活性。

实施例4

疫苗制备及免疫效力实验：

1、疫苗的制备

实施例3以及和实施例1制备得到的纯化后的重组抗原以及HBHA蛋白分别经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度。纯化的HAO蛋白片段分别与重组蛋白HBHA按1：2(V/V)配置，或与油佐剂ISA206(Seppic)等体积配置后，乳化成疫苗制剂。同时HAO-HBHA不添加任何免疫佐剂，重组蛋白本身作为疫苗制剂。

2、免疫效力试验

将56只6-8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠随机分为7组(8只/每组)，将制备好的免疫原按照下列表中的免疫分组以及免疫剂量，分别于第0、2和4周接种小鼠3次。主要分组如下：HAO免疫组，50μg/只；HAO+ISA206组，50μg/只；HAO+HBHA组，50μg+50μg/只；HAO-HBHA组，50μg/只；HBHA组，50μg/只；PBS+ISA206组，100μL/只；灭活疫苗组，免疫结果显示：除了HBHA组以及PBS组检测不到的FMDV特异性抗体之外，其他几个免疫组均能检测到A型以及O型FMDV特异性抗体，其中HAO-HBHA免疫组的抗体水平与灭活疫苗组并无明显差异，且相对于其他重组抗原免疫组最高，特别是在整个血清抗体检测过程中发现，当HBHA和HAO表位抗原融合形成融合蛋白进行免疫，比两者混合免疫或者单独的HAO通过206佐剂乳化后免疫的抗体应答水平明显要高。结果如图1和图2所示。

通过体外中和试验测定免疫小鼠血清FMDV A型和O型中和抗体滴度，结果显示，除了HBHA和PBS免疫组，其他5组能够诱导产生A/O型FMDV中和抗体反应，其中HAO+HBHA的联合免疫组以及HAO+206佐剂的免疫组的中和抗体滴度远低于HAO-HBHA免疫组和A/O型FMDV二价灭活疫苗。此外，HAO-HBHA诱导的中和抗体效价与灭活疫苗组并无明显差异。结果如图3所示。

首次免疫后42d分离小鼠的脾淋巴细胞，用灭活FMDV体外刺激小鼠脾淋巴细胞，用MTT淋巴细胞增殖试验检测淋巴细胞增殖反应。各实验组和商品化疫苗组淋巴细胞的增殖能力均明显高于HBHA组和PBS组。HBHA-HAO组淋巴细胞经A型或O型FMDV抗原刺激后增殖能力要高于HAO+206佐剂组和HAO免疫组，而HBHA-HAO组与商品化灭活疫苗组相比无显着性差异，结果如图4所示。检测首免后42d血清样品中Th1型，Th2型以及单核细胞分化相关的细胞因子水平，结果如图5所示。

而且，本发明免疫动物注射部位没有出现红肿、发热等现象，也没有出现接种不良反应，食欲正常，精神状态良好，可见本发明制备的HBHA蛋白不仅能起到FMDVA型和O型广谱多价表位疫苗免疫增强的功效，而且对免疫动物来说是安全的，无害的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种用于制备***疫苗的分子内佐剂及其应用和***疫苗

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Glu Asn Pro Asn Ile Asp Asp Leu Pro Ala Pro Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ala Ala Asp Leu Ala Leu Ala Thr Val Asn Asp Leu Ile

20 25 30

Ala Asn Leu Arg Glu Arg Ala Glu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Arg Thr

35 40 45

Arg Val Glu Glu Arg Arg Ala Arg Leu Thr Lys Phe Gln Glu Asp Leu

50 55 60

Pro Glu Gln Phe Ile Glu Leu Arg Asp Lys Phe Thr Thr Glu Glu Leu

65 70 75 80

Arg Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Ala Ala Thr Asn Arg Tyr Asn

85 90 95

Glu Leu Val Glu Arg Gly Glu Ala Ala Leu Gln Arg Leu Arg Ser Gln

100 105 110

Thr Ala Phe Glu Asp Ala Ser Ala Arg Ala Glu Gly Tyr Val Asp Gln

115 120 125

Ala Val Glu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Gly Thr Val Ala Ser Gln Thr

130 135 140

Arg Ala Val Gly Glu Arg Ala Ala Lys Leu Val Gly Ile Glu Leu Pro

145 150 155 160

Gly Lys Ala Glu Ala Ala Gly Lys Lys Ala Gln Lys Ala Ile Ala Lys

165 170 175

Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ser Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala

180 185 190

Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Val Thr Gln Lys

195 200 205

<210> 2

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Glu Asn Pro Asn Ile Asp Asp Leu Pro Ala Pro Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ala Ala Asp Leu Ala Leu Ala Thr Val Asn Asp Leu Ile

20 25 30

Ala Asn Leu Arg Glu Arg Ala Glu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Arg Thr

35 40 45

Arg Val Glu Glu Arg Arg Ala Arg Leu Thr Lys Phe Gln Glu Asp Leu

50 55 60

Pro Glu Gln Phe Ile Glu Leu Arg Asp Lys Phe Thr Thr Glu Glu Leu

65 70 75 80

Arg Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Ala Ala Thr Asn Arg Tyr Asn

85 90 95

Glu Leu Val Glu Arg Gly Glu Ala Ala Leu Gln Arg Leu Arg Ser Gln

100 105 110

Thr Ala Phe Glu Asp Ala Ser Ala Arg Ala Glu Gly Tyr Val Asp Gln

115 120 125

Ala Val Glu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Gly Thr Val Ala Ser Gln Thr

130 135 140

Arg Ala Val Gly Glu Arg Ala Ala Lys Leu Val Gly Ile Glu Leu Pro

145 150 155 160

Gly Lys Ala Glu Ala Ala Gly Lys Lys Ala Gln Lys Ala Ile Ala Lys

165 170 175

Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ser Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala

180 185 190

Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Val Thr Gln Lys

195 200 205

<210> 3

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcggaaa acccgaacat cgacgacttg ccagccccgc tgctcgcggc cctgggcgcg 60

gccgacctgg ccctggccac ggtcaacgac ctgatcgcca acctgcgcga gcgggccgag 120

gagacccgcg ccgagacccg cacccgggtc gaggagcgcc gcgcccggct gaccaagttc 180

caggaggacc tgcccgagca gttcatcgag ctgcgcgaca agttcaccac cgaggagctg 240

cgcaaggcgg ccgagggcta cctggaggcg gcgaccaacc ggtacaacga gctggtcgag 300

cgcggcgagg cggccctgca gcggctgcgc agccagaccg ccttcgagga cgcctccgcg 360

cgcgccgagg gctacgtgga ccaggccgtc gagctgaccc aggaggcgct gggcaccgtc 420

gcgtcgcaga cccgcgcggt cggtgagcgc gccgccaagc tggtgggcat cgagctgccg 480

ggcaaggccg aggccgccgg caagaaggcc cagaaggcca tcgccaaggc ccccgccaag 540

aaggcgtcgg ccaagaaggc ccccgccaag aaggcgccgg ccaagaaggc cgcggccaag 600

aaggtcaccc agaag 615

<210> 4

<211> 719

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggcgatcg agttctttga gggtatggtg cacgacagca ttaagggtgg cagcagcggt 60

ggcaaataca gcgcgccgca gaaccgtcgt ggtgatagcg gtccgctggc ggcgcgtctg 120

gcggcgcaac tgccggcgag cttcggtggc agcagcggtg gcaagtatag cgcgccggcg 180

acccgtcgtg gtgacctggg cacctggcgg cgcgcttagc tgctcaatta ccggcgagct 240

ttggtggcag cagcggtggc aaatatagca ccggtaacgc gggtcgtcgt ggtgatttag 300

gcagcctggc tgcgcgtgtt gcggcgcagt tacctgcgag cttcggtggc agcagcggtg 360

gccgtcacaa gcagaaaatc attgcgccgg cgaagcaact gctgggtggc agcagcggtg 420

gcaaatacgg cgagagcccg gtgaccaacg ttcgtggcga cctgcaggtt ctggcgcaaa 480

aagcggcgcg taccctgccg ggtggcagca gcggtggcaa atatgcgggt ggcagcctgc 540

cgaacgtgcg tggtgatctg caggtgctgg cgcagaaagc ggcgcgtccg ttaccgggtg 600

gcagcagcgg tggcaggcac aagcagaaaa tcgtggcgcc ggttaaacag ttactgggtg 660

gcagcagcgg tggcgcggcg attgaattct ttgagggcat ggttcacgac agcattaag 719

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccat ggccgaaaac ccg 23

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgagt ttctgggtca ctttttt 27