阅读说明：本技术 inhA来源的抗结核CTL表位肽及其应用 (InhA-derived antituberculous CTL epitope peptide and application thereof ) 是由 祁元明 吴亚红 高艳锋 冉令 董钰 时冉冉 李玉冰 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多肽,其氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。本发明还提供了含所述多肽的药物组合物、食品或保健品及多肽的对应用途。本发明筛选获得表位肽,通过体外ELISPOT和细胞杀伤实验等对表位肽进行鉴定,为后续研制基于耐药突变抗原的结核疫苗以及诊断制剂提供了理论基础,并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位疫苗提供更多的选择。(The invention discloses a polypeptide, the amino acid sequence of which is shown as SEQ ID No.1 or SEQ ID No. 2. The invention also provides a pharmaceutical composition, food or health care product containing the polypeptide and corresponding application of the polypeptide. The epitope peptide is obtained by screening, and is identified through in vitro ELISPOT, cell killing experiments and the like, so that a theoretical basis is provided for the subsequent development of tuberculosis vaccines and diagnostic preparations based on drug-resistant mutant antigens, and more choices are provided for designing tuberculosis multi-epitope vaccines based on mixed T cell epitopes.)

inhA来源的抗结核CTL表位肽及其应用

技术领域

本发明具体涉及抗结核CTL表位肽及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种严重危害人类健康的慢性传染性疾病。目前耐药型结核分枝杆菌(包括耐多药结核(MDR-TB)和广泛耐药结核(XDR-TB))的不断出现和传播使得结核病的控制面临很大的挑战。

对于结核病的治疗，目前WHO推荐使用的针对药物敏感性结核感染的疗法需要一线药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、(EMB)和(PZA)的联用。此疗法行之有效，但是治疗时间较长。对于MDR-TB而言WHO建议至少连续20个月的二线药物治疗。总之，多药物联合化疗治疗时间长，副作用明显，易复发的诸多问题还没有被解决，所以寻找新的耐药结合病的治疗策略便称为必然的趋势。

在结核疫苗方面，卡介苗BCG是预防结核病方面已有百年历史，且是目前唯一临床可用疫苗，但是仅在发生于儿童的结核病显示出一定的预防效果，对成年人的保护效果差异较大。随着基因工程测序技术的发展，对MTB全基因组测序以及新发现耐药突变结核菌株的测序更有利于开发相关的疫苗。

造成结核菌耐药的原因有固有耐药和获得性耐药两方面。前者和菌体富含分枝菌酸的细胞壁结构有关，这种结构使得MTB具有相对于抗生素和一些化疗药物较低的渗透性，从而引起了菌体耐药表型的产生。而获得性耐药主要是在药物存在的条件下由MTB外排泵蛋白的高表达和一些耐药aa突变所引起。本研究主要关注的是引起结核分枝杆菌耐药的MTB的药物靶点和关键酶中的aa发生突变。inhA(Rv1484)是MTB当中另外一个耐药相关抗原蛋白，其主要功能是催化与菌体细胞壁合成密切相关的分枝菌酸的合成，有报道显示S94A的这一发生于inhA的突变型能够增强菌株对异烟肼的抗性，且此种突变被证明是对菌体自身建立有利于inhA功能效应的pH范围有所助益。另外，能显著提高菌株对异烟肼抗性的还有突变型I21V，结果显示INH对发生此aa突变的菌株的最小抑菌浓度增加了16倍。

结核感染过程中，宿主体内的适应性免疫过程中CD8⁺T淋巴细胞免疫反应对病原菌的控制有着重要作用。而CD8⁺T淋巴细胞的激活有赖于抗原片段在抗原提呈细胞APC中被酶解为表位肽，并与MHC-I类分子形成肽/MHC分子复合物递呈到APC表面供CD8⁺T细胞所识别。活化的CD8⁺T淋巴细胞能够特异性的识别感染的细胞并将其杀伤。鉴定出MHC-I限制性结核耐药相关突变抗原来源的CTL表位肽能够帮助我们更好的理解结核的感染免疫机制和开发新型的结核疫苗。

发明内容

第一方面，本发明提供一种结核耐药突变抗原inhA(Rv1484)来源的抗结核CTL表位肽，其氨基酸序列为SXAFHIARV，X为I或V，如为结核耐药突变抗原inhA(Rv1484)来源的限制性表位肽Rv1484-p20^I21V(所述候选肽的氨基酸序列为SVAFHIARV)或Rv1484-p20^WT(氨基酸序列为SIAFHIARV)

所述表位肽可通过固相合成制得，如采用标准Fmoc方案制备。

第二方面，本发明提供了含所述表位肽的食品、保健品或药物组合物，药物组合物可包括多肽及其药学上可接受的载体或赋形剂，其形式可为疫苗。

第三方面，本发明提供了所述表位肽在制备所述食品、保健品或药物组合物中的用途，或用于结核病诊断分子标志物。

第四方面，本发明提供编码所述表位肽的DNA分子，或由含有编码所述表位肽的DNA分子编码的重组蛋白。

本发明的优点在于，本发明筛选获得表位肽，通过体外ELISPOT和细胞杀伤实验等对表位肽进行鉴定，为后续研制基于耐药突变抗原的结核疫苗以及诊断制剂提供了理论基础，并为设计基于混合T细胞表位的结核多表位疫苗提供更多的选择。

附图说明

图1为本发明表位肽Rv1484-p20^I21V和Rv1484-p20^WT诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力的ELISPOT实验结果图；

图2为本发明表位肽Rv1484-p20^I21V和Rv1484-p20^WT诱导的特异性CTL在PPD⁺PPD^-志愿者中的胞内因子染色反应实验结果图。

图3为本发明表位肽Rv1484-p20^I21V诱导的特异性CTL体外杀伤靶细胞及交叉反应实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步介绍说明，如无特别说明，本发明中所涉及实验试剂、实验设备、实验材料均为本领域常用或市售产品，所涉名词、缩写均为本领域常规含义，如PBS(磷酸盐缓冲液)。

本发明的结核耐药突变抗原inhA(Rv1484)来源抗结核CTL表位肽(下文有时称候选肽)，其氨基酸序列分别为：

Rv1484-p20^WT：SIAFHIARV(SEQ ID No.2)

Rv1484-p20^I21V：Ser-Val-Ala-Phe-His-Ile-Ala-Arg-Val(SVAFHIARV，SEQ IDNo.1)。本发明所述CTL表位肽利用标准的Fmoc固相合成技术合成，质谱分析并证实其分子量符合理论值。

实施例1结合力及稳定性实验

结合力实验方案如下：

(1)将所制备的候选肽溶解于灭过菌的PBS(pH 7.2)中，配制成1mg/mL分装备用；

(2)获取生长状态良好的T2A2细胞，4℃2000rpm离心5min，用无血清IMDM培养基洗涤2次。调密度至1×10⁶个/mL，铺于24孔板中，500μL/孔。

(3)提前拿出溶解分装好的肽放入4℃冰箱。细胞铺好板后，先加入人β₂微球蛋白(β₂-M)(0.5μg/mL)，再加入溶解好的抗原肽(50μg/mL)。根据实验安排，设置：实验组(表位肽)、阴性对照组(PBS)、阳性对照组(COX-2_321-329)和背景组(T2A2细胞)。扣板混匀细胞悬液，放于37℃细胞培养箱，孵育18h。

(4)收集孵育18h后的细胞于1.5mL EP管内，4℃离心机，2000rpm离心5min，加入预冷后的PBA缓冲液(含2％小牛血清和适量NaN₃)洗涤两次，离心设置不变。

(5)弃上清后，吹洗混匀，4℃避光孵育HLA-A2抗体，30min。

(6)避光孵育后，直接加入1mL PBA缓冲液洗涤两次，4℃离心，2000rpm，5min。弃去上清，补加300μL预冷的PBA缓冲液上流式机检测。

(7)荧光指数FI计算公式如下：FI＝(实验组MFI-背景组MFI)/背景组MFI。FI的值表示了表位肽与HLA-A2分子的结合能力。

稳定性实验方案如下：

(1)收集T2A2细胞：2000rpm，5min，4℃，弃上清。用无血清的IMDM洗2遍，调整细胞浓度1×10⁶个/mL，铺板500μL/孔。

荷肽：实验组：50μg/mL的表位肽。

阳性组：50μg/mL的COX-2_321-329。

阴性组：PBS。

背景组：T2A2细胞。

与培养箱(37℃，5％CO₂)中共孵育18h。

2、孵育过程中，按照时间点，用无血清IMDM洗1遍，随后加BFA(BrefeldinA)1.5μL(10μg/mL)，37℃孵育1h。孵育结束后用无血清IMDM再洗1遍。

3、以0h、2h、4h、6h时间点37℃培养箱孵育。

4、孵育结束后，预冷的buffer洗2遍，用0.3μL BB7.2抗体4度孵育30min。

5、预冷的buffer洗2遍，加300μL，上机。

结果如表1所示：

表1

a突变位点.

b FI＝[肽组平均荧光指数-背景对照组平均荧光指数]/[背景对照组平均荧光指数].

c DC₅₀代表肽/HLA-A*0201复合物半量降解的时间.

e阳性对照

实施例2人外周血单个核细胞(PBMCs)的分离及诱导

首先招募的志愿者进行外周血HLA型别测定，部分HLA-A2+志愿者进行了结核菌素(PPD)皮内试验，筛选合适的志愿者。

(1)按30U肝素钠/mL外周血的量，将一定量的肝素钠加入40mL离心管中备用。每个志愿者抽取外周血40mL。注射器中的血液在转移入50mL离心管中时应贴壁注入，之后缓缓摇动几次，置于冰上。

(2)抗凝外周血与pH7.2的PBS按1:1的比例进行稀释，轻轻吹打混匀。按照外周血：PBS：分离液＝1:1:1的比例于超净工作台中缓慢加入离心管中。随后轻轻将盛有分离体系的离心管转移至外周血分离专用离心机(缓慢升降速，无制动)，2000rpm，30min。

(3)准备加有一定体积PBS(pH 7.2)的离心管若干。离心后的整个体系自上而下分为四层：血浆层，淋巴细胞层，分离液层，红细胞层。用灭菌的尖嘴弯玻璃管小心吸取“云雾层”单个核细胞于盛有PBS(pH 7.2)的离心管中。水平离心机离心洗涤一次：2000rpm，20min。

(4)PBMCs培养和CTL诱导：弃去离心后的上清，10％FBS的IMDM培养基重悬细胞后调整密度为1～1.5×10⁶个/mL。按照1mL/孔的量铺入24孔板。放于37℃，5％CO₂细胞培养箱。第二天进行荷肽操作，加入表位肽：50μg/mL；人β₂-M：3μg/mL。第三天加入人IL-2，50U/mL。其后隔天加入IL-2进行刺激，到第7天结束为一轮刺激周期。第8天开始第二轮诱导刺激，当天加入表位肽，人β₂-M，人IL-2，加入的量与首轮相同。第15天开始进行第三轮诱导刺激。操作同前两轮。诱导刺激共持续21天。其间观察细胞的状态，培养基的颜色进行必要的半量换液。诱导获得的T淋巴细胞进行后续的ELISPOT、胞内因子染色实验以及细胞毒性实验。

实施例3 ELISPOT实验(酶联免疫斑点实验)

第21d，收集各实验组诱导获得的T淋巴细胞，ELISPOT实验采用人IFN-γ预包被试剂盒进行。

(1)靶细胞的收集：取培养中的T2A2细胞于倒置光学显微镜下观察，选择状态较好的细胞。电动移液器轻轻贴壁吹吸培养瓶中的培养基使成均一的细胞悬液。转移至15mL离心管中，水平离心机离心：1000rpm，8min。弃去上清后加入无血清IMDM培养基洗涤一次。调整细胞密度为2×10⁶个/mL，铺入24孔板，1mL/孔。设置表位肽组，PBS组，空白组。

(2)靶细胞荷肽：按照50μg/mL的量向每孔细胞悬液加入表位肽/PBS(pH 7.2)，按照3μg/mL的量加入人β₂-M。移液器轻轻吹匀孔板中的细胞，放于细胞培养箱孵育4h。完成表位肽的荷载。

(3)效应细胞的准备：取第二轮诱导中的淋巴细胞，移液器收入15mL离心管中，4℃离心机离心：1800rpm，5min。调整细胞密度为：2×10⁶个/mL。

(4)预包被板的活化：根据实验需要取可拆卸的Elispot板条固定，向孔中加入200μL 10％FBS的RPMI 1640培养基。室温静置10min后弃去并在灭菌的吸水纸上拍干。

(5)铺板：将靶细胞T2和效应淋巴细胞按照1:1各50μL的量加入到Elispot 96孔板中，孔板设置如下：

实验孔：荷载表位肽的T2A2悬液50μL+效应细胞悬液50μL

阴性对照孔：荷载PBS的T2A2悬液50μL+效应细胞悬液50μL

自发对照孔：效应细胞悬液50μL+无血清IMDM培养基50μL

阳性对照孔：效应细胞悬液50μL+40μL无血清IMDM培养基+10μL PHA

空白对照孔：100μL无血清IMDM培养基

每组设置三个复孔，铺板完成后，放入无菌锡纸袋内置于培养箱内孵育18h。

(6)裂解细胞：18h后取出孔板，弃去孔板内的培养基，将冰冷的去离子水加入孔板中，200μL/孔。置于4℃冰箱低渗裂解细胞约10min。

(7)洗涤：倒出孔板内液体，加入1×Washing buffer(去离子水1:50稀释的50×Washing buffer)，200μL/孔。停留约1min。用力甩出。以相同的操作再重复洗涤5次。最后一次洗涤后在吸水纸上用力拍干。

(8)孵育检测抗体：将Biotinylated antibody(以1×Dilution buffer 1:100稀释)加入到各孔，100μL/孔。置于37℃孵育1h。

(9)洗涤：倒出孔板内液体，加入1×Washing buffer(去离子水1:50稀释的50×Washing buffer)，200μL/孔。停留约1min。用力甩出。以相同的操作再重复洗涤4次。最后一次洗涤后用力在吸水纸上拍干。

(10)孵育酶联亲和素：将以1×Dilution buffer 1:100稀释好的Streptavidin-HRP加入到各孔，100μL/孔。置于37℃下孵育1h。

(11)洗涤：倒出孔板内液体，加入1×Washing buffer(去离子水1:50稀释的50×Washing buffer)，200μL/孔。停留约1min。用力甩出。以相同的操作再重复洗涤4次。最后一次洗涤后用力在吸水纸上拍干。

(12)显色：将按照说明书稀释好的AEC显色工作液加入到各孔，100μL/孔。室温条件下避光静置约30min。为避免背景色加重影响斑点计数，在避光显色前应当将底板取下。然后放入遮光袋中显色。

(13)显色终止：倒出孔板中液体，并用自来水/去离子水反复冲洗孔板正反面及底座3～5遍，终止显色。将孔板置于阴凉干燥处，等自然晾干之后装上底板。

(14)斑点计数：采用达科为的自动读板仪对孔中的斑点数进行统计处理。

图1结果显示Rv1484-p20^WT和Rv1484-p20^I21V表位肽诱导产生的T淋巴细胞均具有分泌IFN-γ的能力。

实施例4胞内因子染色实验

第21d，收集各实验组诱导获得的T淋巴细胞，进行胞内因子染色实验。

(1)靶细胞准备：收集靶细胞T2A2细胞密度调整为2×10⁶个/mL，铺入24孔板。以3μg/mL加入β₂-M，以50μg/mL加入抗原肽，37℃5％CO₂的条件下孵育4h。

(2)共孵育：分别将500μL的荷肽T2A2与CTL加入到同一1.5mL EP管中，37℃5％CO₂的条件下共孵育7h。设置以下对照组，PBS组：荷载PBS的T2A2+PBS诱导的CTL。CD3单阳组；CD8单阳组；同型对照组；阳性对照PHA组和各肽实验组

(3)阻断：在共孵育4h后加入阻断剂BFA抑制CTLs胞内因子向外分泌。继续孵育3h。

(4)孵育表面分子抗体：1500rpm 3min离心收集细胞，FACS buffer重复离心洗涤两次。之后分别加入CD3和CD8抗体，混匀后于4℃避光孵育30min。

(5)固定：1500rpm 3min离心。之后加入FACS buffer重复离心洗涤两次。加入200μL fixation buffer重悬细胞，室温避光静置30min。

(6)破膜：1500rpm，3min。加入200μL 1×破膜剂。1500rpm 3min。之后重复操作一次。

(7)孵育胞内因子抗体：加入100μL 1×破膜剂重悬细胞和适量的PE Mouse Anti-Human IFN-γ抗体。4℃避光孵育30min。

(8)上机检测：抗体孵育结束后加入FACS buffer 1500rpm 3min洗涤一次，之后再加入FACS buffer重悬细胞，流式细胞仪检测。

图2胞内因子染色结果显示与Rv1484-p20^WT相比，Rv1484-p20^I21V肽更能诱导PPD⁺志愿者来源的PBMCs产生更多的分泌IFN-γ的CD8⁺T淋巴细胞。

实施例5 LDH法(乳酸盐脱氢酶法)细胞毒性实验

(1)靶细胞的准备：选取状态较好的T2A2细胞收集于离心管中，水平离心机离心，1000rpm，6min。无血清IMDM培养基相同条件离心洗涤一次。调整细胞密度为1×10⁵个/mL。铺入24孔板。荷载表位肽，50μg/mL，同时加入人β₂-M 3μg/mL。置于37℃培养箱孵育4h。

(2)效应细胞的准备：移液器轻轻将孔板中的效应CTL吹吸均匀，转移至离心管中，4℃离心机离心，1800rpm，5min。弃上清，加入无血清培养基，相同条件洗涤一次。调整密度至5×10⁶个/mL。

(3)铺板：

实验孔：12.5:1效靶比(E/T ratio)组，12.5μL CTL+50μL荷载表位肽的T2A2细胞+37.5μL无血清IMDM培养基。25:1效靶比组，25μL CTL+50μL荷载表位肽的T2A2细胞+25μL无血清IMDM培养基。50:1效靶比组，50μL CTL+50μL荷载表位肽的T2A2细胞。

效应自发孔：12.5:1效靶比组，12.5μL CTL+87.5μL无血清IMDM培养基。25:1效靶比组，25μL CTL+75μL无血清IMDM培养基。50:1效靶比组，50μL CTL+50μL无血清IMDM培养基。

靶细胞自发释放孔：50μL荷载表位肽的T2A2细胞+50μL无血清IMDM培养基。

靶细胞最大释放孔：50μL荷载表位肽的T2A2细胞+50μL无血清IMDM培养基+10μL裂解液。

体积校正孔：100μL无血清IMDM培养基+10μL裂解液。

空白对照孔：100μL无血清IMDM培养基。

交叉识别实验孔：以表位肽Rv1484-p20^WT和其突变体Rv1484-p20^I21V为例，交叉识别组设置为Rv1484-p20^WT(CTL)+荷载Rv1484-p20^I21V的T2A2细胞，Rv1484-p20^I21V(CTL)+荷载Rv1484-p20^WT的T2A2细胞。

以上每组设置3个复孔，铺板完成后放于37℃孵育4h。

(4)加裂解液：孵育结束前的45min向各个孔板中的靶细胞最大释放孔和体积校正孔中加入10μL裂解液。继续孵育至结束。

(5)加底物：孵育阶段结束后，将孔板用封口膜封口，4℃离心机离心，1800rpm，5min。将孔板中上清小心转移至另一孔板的对应位置。按照50μL/孔的量加入底物混合液。底物混合液使用间歇应避光保存以免失效。添加完后标明时间，避光静置30min。

(6)加终止液：底物添加30min后，取4℃保存的终止液，按照50μL/孔的量加入各孔中。1mL注射器针头除去孔中气泡。

(7)测量OD：终止液添加后1h内进行OD测定。

计算各实验组的杀伤率。

图3胞内因子染色结果显示与Rv1484-p20^WT相比，Rv1484-p20^I21V肽诱导PPD⁺志愿者来源的PBMCs获得的T淋巴细胞能够特异性的杀伤荷载相应表位肽的靶细胞。

序列表

<110> 郑州大学

<120> inhA来源的抗结核CTL表位肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Ile Ala Phe His Ile Ala Arg Val

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Val Ala Phe His Ile Ala Arg Val

1 5