含at结合序列和连续2-o-葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 含at结合序列和连续2-o-葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用 (Heparin molecule containing AT binding sequence and continuous 2-O-glucuronic acid residue, and preparation method and application thereof ) 是由 刘纯慧 马亚卿 张桂姣 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用,包含AT结合序列和连续2-O-硫酸化葡糖醛酸(GlcA2S)残基,结构式如式Ⅱ所示,本发明所述结构确定的新型肝素分子具有强效特异抗FXa活性、无显明抗IIa活性,且其活性可被鱼精蛋白逆转,适合制备更加安全、优质的抗凝血抗血栓药物,具有非常好的工业应用前景。(The invention relates to a heparin molecule containing AT binding sequence and continuous 2-O-glucuronic acid residue, and a preparation method and application thereof, wherein the heparin molecule contains AT binding sequence and continuous 2-O-sulfated glucuronic acid (GlcA2S) residue, and the structural formula is shown as formula II.)
技术领域
本发明涉及含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
肝素是一种古老的天然多糖类抗凝剂，属于高度硫酸化的糖胺聚糖家族，由α-L-艾杜糖醛酸(IdoA，≥80％)或β-D-葡糖醛酸与α-D-葡糖胺(GlcN)以1,4-糖苷键连接的双糖单元交替聚合而成，其中IdoA残基通常为2-O-硫酸化(IdoA2S，≥85％)，而GlcA则极少发生2-O-硫酸化GlcA(GlcA2S，<5％)；GlcN残基超过80％发生N-硫酸化(GlcNS)，少量为N-乙酰化(GlcNAc)或N-非取代(GlcNH3 +)，并普遍发生6-O-硫酸化(GlcNS6S、GlcNAc6S)和(或)少量3-O-硫酸化(GlcNS6S3S)，从而使其结构呈高度不均一。
肝素应用于临床已经超过80年，至今仍广泛用于体外循环(如肾透析)和外科手术中的抗凝、血栓栓塞性疾病的治疗和预防等，全球市场规模近百亿美元且需求持续增长。当前，市售肝素产品主要包括从猪肠或牛肺中直接分离得到的未分级肝素(UFH，重均分子量～14kDa)和化学或酶法部分解聚得到的不同低分子量肝素(LMWHs，重均分子量3.5kDa～6kDa)，然而疯牛病、非洲猪瘟造成肝素原料的供应链极其脆弱，2008年的发生的“肝素污染事件”更引发了人们对动物源肝素可靠性和安全性的担忧。
化学法合成的肝素戊糖——磺达肝癸钠(商品名分子量1728Da)于2001年成功上市，证实采用合成技术制备结构确定的肝素分子有望作为更加安全有效的抗凝血药物替代现有动物源多组分肝素产品。2011年Jian Liu教授课题组模拟体内生物合成途径建立的化学酶法路线，具有合成步骤少、产率的优点，被公认是一种比化学法合成更具成本效益的制备合成肝素的新策略(Science,2011，334:498–501)。
大量研究证实，天然肝素的抗凝活性主要依赖肝素链中约占30％的独特戊糖序列(GlcNAc/NS6S-GlcA-GlcNS6S3S-IdoA2S-GlcNS6S)，该序列能够特异性地与抗凝血酶(AT)相互作用而表现出强效Xa因子抑制活性；同时，AT结合戊糖序列与位于其非还原端的、以三硫酸双糖(IdoA2S-GlcNS6S)重复单元为主的片段共同形成的长链(≥18糖)，能够与AT、IIa形成三元复合物灭活IIa因子。此外，不同链长和修饰模式的肝素片段通过与不同靶蛋白相互作用，可赋予肝素不同的特性，这对设计不同的肝素类药物具有重要的指导意义。例如，未分级肝素UFH具有的一个突出的优点是其抗凝血活性可被鱼精蛋白完全中和，可在抗凝治疗结束或出现出血等不良反应时将其快速除去；相比之下，低分子肝素LMWHs只能被鱼精蛋白部分中和，而戊糖磺达肝癸钠则完全不能被中和，事实证实鱼精蛋白逆转肝素抗凝血的能力取决于AT戊糖序列之外的糖链长度及修饰模式。Jian Liu教授采用化学酶法高效制备了含AT结合戊糖序列与额外3个连续的IdoA2S-GlcNS6S双糖的肝素十二糖，证实其具有特异抑制Xa因子的抗凝血抗血栓作用；该化合物还具有与未分级肝素UFH类似的、可被鱼精蛋白中和的抗凝活性，证实是由额外的IdoA2S-GlcNS6S双糖重复序列赋予的(US9951149；Nat Chem Biol,2014,10:248-50；Sci Transl Med,2017,9(406))。然而，由于IdoA独特的弹性构象，富含IdoA2S-GlcNS6S的聚阴离子糖链容易与不同的蛋白质产生特异或非特异性结合，可能会导致化合物皮下注射药代动力学不佳、肝素治疗相关的潜在副作用(如血小板减少症、非特异性出血)等。
根据文献报道(US9951149；J Biol Chem,2014,289:13407-18)，肝素2-O-硫酸基转移酶(2OST)能够识别糖链特定的IdoA或GlcA残基并进行2-O-硫酸化修饰，目前基于酶的底物特异性已经能够高效制备含多个2-O-硫酸化IdoA(IdoA2S)残基的肝素分子；然而，2OST酶对GlcA残基的催化修饰效率大大低于IdoA残基，故利用现有化学酶法策略高效制备含不同数量、连续GlcA2S残基的肝素分子是不现实的。而关于不含连续IdoA2S残基的“稀有”肝素序列能否表现出可被鱼精蛋白逆转的抗凝血活性，目前尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子及其制备方法与应用。
本发明第一个目的是提供一种含不同数量GlcA2S残基的稀有肝素分子。
第二个目的是提供采用化学酶法高效制备含不同数量且连续GlcA2S残基的稀有肝素分子的方法。
第三个目的是提供含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子。
第四个目的是提供含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子的制备方法。
第五个目的是提供含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子的应用，具有强效Xa抑制活性且可被鱼精蛋白中和，用于制备更加安全、强效的抗凝血抗血栓药物。
术语说明：
AT：抗凝血酶
GlcA-PNP：对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷
UDP-GlcNTFA：尿苷二磷酸-N-三氟乙酰葡糖胺
UDP-GlcNAc：尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺
UDP-GlcA：尿苷二磷酸-葡糖醛酸
PAPS：3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸
KfiA：大肠杆菌K5 N-乙酰氨基葡糖基转移酶
PmHS2：多杀巴斯德菌Heparosan合酶2
NST：N-硫酸基转移酶
C5-epi：C5-异构化酶
2OST：2-O-硫酸基转移酶
6OST：6-O-硫酸基转移酶
3OST：3-O-硫酸基转移酶
本发明的技术方案如下：
一种含不同数量连续GlcA2S残基的稀有肝素分子，结构式如下式Ⅰ所示：
其中，n为大于等于1的整数。
经过反复试验，本发明首次证明2OST对不同修饰模式肝素链中GlcA的修饰效率存在显著差别，当糖链非还原末端存在序列GlcA-(GlcNS-GlcA)1～3-时，2OST能够地将序列中的1～3个GlcA残基高效转化为GlcA2S，即该序列为2OST将GlcA高效转化为GlcA2S的“偏好序列”。
本发明基于2OST对GlcA独特的催化修饰模式，采用化学酶法高效制备含不同数量且连续GlcA2S残基的稀有肝素分子。
上述含不同数量连续GlcA2S残基的稀有肝素分子的制备方法，采用化学酶法进行，包括步骤如下：
(1)对硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP)于缓冲液中与N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)、糖基供体尿苷二磷酸(UDP)-N-三氟乙酰葡糖胺(UDP-GlcNTFA)混合进行糖链延长反应，得到二糖骨架，二糖骨架于缓冲液中与Heparosan合酶2(PmHS2)、糖基供体UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)混合进行糖链延长反应，得三糖骨架，三糖骨架与KfiA、PmHS2酶促糖链延长反应得到五糖骨架，重复上述酶促延长反应，直至得到七糖骨架；
(2)将五糖骨架或七糖骨架溶于LiOH溶液中，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，调节pH至中性，然后于缓冲液中与肝素N-硫酸基转移酶(NST)、硫酸基供体3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸(PAPS)混合，以使糖链中的N-非取代葡糖胺(GlcNH3 +)残基发生N-硫酸化(GlcNS)，得到N-硫酸化五糖或N-硫酸化七糖；
(3)步骤(2)得到的N-硫酸化五糖或N-硫酸化七糖置于缓冲液中，与2OST酶、硫酸基供体PAPS混合反应，使偏好序列GlcA-(GlcNS-GlcA) 2 -或GlcA-(GlcNS-GlcA) 3 -中特定的GlcA残基转化为GlcA2S残基，得到含两个GlcA2S残基的稀有肝素五糖或三个GlcA2S残基的稀有肝素七糖；
(4)以步骤(3)的稀有肝素五糖为起始原料，按照步骤(1)依次进行KfiA、PmHS2酶促糖链延长得到含一个GlcNTFA残基的七糖中间体，继续重复进行糖链延长得含两个GlcNTFA残基的九糖中间体；或直接以步骤(3)的稀有肝素七糖为起始原料，酶法延长糖链得含一个GlcNTFA残基的九糖中间体；
(5)按照步骤(2)的方法使步骤(4)七糖中间体或两种九糖中间体的GlcNTFA残基脱除三氟乙酰基并转化为GlcNS，分别得非还原端含GlcA-GlcNS-GlcA-的七糖中间体或含GlcA-(GlcNS-GlcA) 1～2-的九糖中间体；
(6)步骤(5)得到的七糖中间体或九糖中间体在2OST酶的催化下，以PAPS为硫酸基供体，非还原末端新引入的偏好序列GlcA-(GlcNS-GlcA) 1～2-的特定GlcA残基转化为GlcA2S，得到与步骤(3)相同的、含3个GlcA2S残基的稀有肝素七糖或含4个GlcA2S残基的稀有肝素九糖。
根据本发明优选的，步骤(1)、步骤(4)中所述酶KfiA、PmHS2以大肠杆菌重组表达，糖链延长反应所用缓冲液为50mmol/LTris-HCl，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃，各反应液均以C18柱层析纯化。
进一步优选的，N-乙酰氨基葡糖基转移酶(KfiA)来源于大肠杆菌K5，Heparosan合酶2(PmHS2)来源于多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)。
根据本发明优选的，步骤(2)、步骤(5)中，所述LiOH溶液的浓度<0.5mol/L，优选的，LiOH溶液的浓度为0.05mol/L～0.2mol/L；NST为哺乳动物细胞来源肝素N-脱乙酰基酶/N-硫酸基转移酶(NSDT)的N-硫酸基转移酶活性片段的重组表达产物；NST酶促反应的缓冲液为50mmol/L的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)，pH＝7.0-7.4，硫酸基供体PAPS的加入量为被修饰GlcNH3 +残基摩尔质量的1.1倍-5倍，反应液以强阴离子交换柱层析纯化。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述2OST为哺乳动物细胞来源的并利用重组表达技术制备的重组酶，表达载体为大肠杆菌、酵母或者昆虫细胞；2OST酶促反应的缓冲溶液为含2mM CaCl2的50mmol/L MES，pH7.0～7.4，硫酸基供体PAPS的加入量为被修饰GlcA残基摩尔质量的1.1倍-5倍，反应液经强阴离子交换柱层析纯化得含2个GlcA2S残基的肝素五糖或3个GlcA2S残基的七糖。
步骤(4)所述KfiA、PmHS2酶及延长反应条件与步骤(1)相同，但反应液以强阴离子交换柱层析纯化；步骤(5)GlcNTFA残基脱除三氟乙酰基并转化为GlcNS的反应条件与纯化方法与步骤(2)相同。
根据本发明优选的，步骤(6)所述2OST酶促反应条件与步骤(3)相同，反应液经强阴离子交换柱层析纯化得含3个GlcA2S残基的稀有肝素七糖或4个GlcA2S残基的肝素九糖。
实际上，以含连续GlcA2S残基上述肝素分子为原料，参照上述步骤进行糖链延长、N-硫酸化修饰引入2OST修饰GlcA的偏好识别序列GlcA-[GlcNS-GlcA]1～3-，然后经2OST催化修饰，可制备含更多GlcA2S残基的长链新肝素分子，突破了传统的化学酶法只能高效合成含连续IdoA2S残基肝素分子的限制。
含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子，包含AT结合序列和连续2-O-硫酸化葡糖醛酸(GlcA2S)残基，结构式如式Ⅱ所示：
其中，R1为硫酸基(-SO3H)或乙酰基(-COCH3)；n为大于等于2的整数。
根据本发明优选的，还原末端的对硝基苯基(PNP)可以是其他具特征紫外吸收的基团。
其他具特征紫外吸收的基团，包括但不限于如下基团：
含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子的制备方法，以上述制备的含连续GlcA2S残基的稀有新肝素分子为起始原料，采用化学酶法制备，步骤如下：
1)以含连续GlcA2S的稀有肝素分子为起始原料，于缓冲液中与KfiA、糖基供体UDP-GlcNTFA混合进行糖链延长反应，所得产物于缓冲液中与PmHS2、糖基供体UDP-GlcA混合进行糖链延长反应，得中间产物a；
2)将中间产物a溶于LiOH溶液中，于冰上静置至完全脱除GlcNTFA残基的三氟乙酰基，调节pH至中性，然后于缓冲液中与肝素N-硫酸基转移酶(NST)、硫酸基供体PAPS混合，以使糖链中的N-非取代葡糖胺(GlcNH3 +)残基发生N-硫酸化(GlcNS)，得到N-硫酸化产物；
3)在KfiA催化下，以UDP-GlcNTFA(或UDP-GlcNAc)为糖基供体，使N-硫酸化产物进行糖链延长得中间产物b；
4)中间产物b于缓冲液中与肝素C-5差向异构化酶(C5-epi)、2OST及硫酸基供体PAPS混合，以使GlcNS残基之间的GlcA残基直接转化为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，得含单一IdoA2S残基的中间产物；然后经LiOH处理、NST酶法修饰将GlcNTFA残基转化为GlcNS得中间产物c；
5)中间产物c于缓冲液中与肝素6-O-硫酸基转移酶(6OST1/3)、硫酸基供体PAPS混合，使GlcNS或GlcNAc残基全部发生6-O-硫酸化(GlcNS6S或GlcNAc6S)，得到中间产物d；
6)中间产物d缓冲液中与肝素3-O-硫酸基转移酶(3OST)、硫酸基供体PAPS混合，以使特定GlcNS6S残基发生3-O-硫酸化(GlcNS6S3S)，得到的肝素分子，即为同时含AT结合五糖序列和连续GlcA2S的新型肝素分子。
得到的肝素分子与通式Ⅱ相符。
根据本发明优选的，步骤1)、3)中所述KfiA、PmHS2酶催反应的缓冲液为50mmol/LTris-HCl中，pH＝7.0～7.5，反应温度为20℃～37℃；反应液以强阴离子交换柱层析纯化。
根据本发明优选的，步骤2)、4)所述LiOH浓度为0.05mol/L～0.2mol/L；NST催化的修饰反应所用缓冲液为50mmol/L、pH＝7.0～7.4MES，硫酸基供体PAPS的加入量为被修饰GlcNH3 +残基摩尔质量的1.1倍-5倍；反应液以强阴离子交换柱层析纯化。
根据本发明优选的，步骤4)中C5-epi和2OST双酶催化修饰的具体方法为：将中间产物b与C5-epi先于缓冲溶液中进行异构化反应0.5h及以上，再加入2OST酶和硫酸基供体PAPS，继续进行异构化和硫酸化修饰，反应液经强阴离子柱层析纯化。
进一步优选的，所述肝素异构化酶C5-epi为哺乳动物来源的，利用大肠杆菌(或者酵母、昆虫细胞)可溶性表达得到的；所述缓冲溶液为含2mM CaCl2的50mmol/L MES，pH7.0～7.4；所述异构化反应的条件为，20℃～37℃下反应进行0.5h～1.5h；
进一步优选的，所述C5-epi与2OST共同修饰反应温度为20℃～37℃，硫酸基供体PAPS的加入量为底物摩尔质量的1.1倍-5倍。
根据本发明优选的，步骤5)所述6OST1和6OST3均为哺乳动物来源的并利用大肠杆菌(或者酵母、昆虫细胞)可溶性表达得到的，催化缓冲溶液为50mmol/L的MES、pH7.0～7.4，所述硫酸基供体PAPS的加入量为底物被修饰GlcNS和GlcNAc总摩尔质量的1.1倍及以上，所述修饰的反应温度为20℃～37℃，反应液经强阴离子柱层析纯化。
根据本发明优选的，步骤6)中所述3OST酶为哺乳动物来源的并利用大肠杆菌(或者酵母、昆虫细胞)可溶性表达得到的，缓冲溶液为50mmol/L的MES、pH7.0～7.4，所述硫酸基供体PAPS的加入量为底物摩尔质量的1.1倍-5倍，修饰反应温度为20℃～37℃，反应液经强阴离子柱层析纯化，得到同时含AT结合序列和连续GlcA2S的新型肝素分子。
根据本发明优选的，新型肝素分子所含GlcA2S的数量≥3。
采用生色底物法测定上述制备的含AT结合序列和连续GlcA2S的新型肝素分子的体外抗FXa和抗FIIa活性；并测定鱼精蛋白对肝素分子抗凝活性的影响。
本发明制备的新型肝素分子具特异强效抗FXa活性，无明显抗IIa活性，且其抗凝活性可被鱼精蛋白中和，可用于制备更加安全强效的抗凝血抗血栓药物。
含AT结合序列和连续2-O-葡糖醛酸残基的肝素分子的应用，用于制备抗凝血、抗血栓药物。
本发明涉及的含GlcA2S残基的稀有肝素分子的制备方法，可进一步与现有化学酶法合成技术合理组合，以用于制备修饰模式更加多样的新型肝素类化合物。
有益效果：
本发明提供了一种包含AT结合戊糖序列和稀有的连续GlcA2S残基的新型肝素分子及其化学酶法合成的新方法。本发明提供的新型肝素分子制备的关键是，利用首次发现的2OST将GlcA高效转化为GlcA2S的“偏好序列”，建立了化学酶法高效制备含数量不等的、连续GlcA2S残基的稀有新型肝素分子，然后采用化学酶法合成技术制备得到同时含AT结合戊糖序列和连续GlcA2S残基的新型肝素分子。所得新肝素分子具强效特异抗FXa活性、无显明抗IIa活性，且其抗凝活性可被鱼精蛋白中和；同时新肝素分子不易导致多IdoA2S残基依赖的不良反应与药代动力学缺陷，适合制备更加安全、优质的新型抗凝血抗血栓药物，具有非常好的工业应用前景。
附图说明
图1是实施例5制备的新型肝素十二糖的高效液相色谱图(A)和质谱图(B)；
图2是实施例5制备的新型肝素十二糖的体外抗Xa因子(A)和抗IIa活性(B)；
图3是鱼精蛋白体外对实施例5的新型肝素十二糖抗凝活性的中和作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1：含2个连续GlcA2S的稀有肝素五糖5的制备
称取500mg硝基苯基-β-D-葡糖醛酸苷(GlcA-PNP，1)溶于～200mL 50mmol/LTris-HCl缓冲液(含6mmol/L MnCl2，pH＝7.5)，同时加入底物1.2倍当量的UDP-GlcNTFA及5mL KfiA酶，室温搅拌过夜，反应用PAMN-HPLC检测，色谱条件为在45min内以0→100％KH2PO4梯度洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为310nm。待产率≥95％，用三氟乙酸(TFA)调pH至2-3中止反应，反应液用C18层析柱(3.0×50cm)进行纯化，以含0.1％TFA的甲醇-水洗脱，收到目标组分。将得到的二糖骨架置于与200mL上述相同缓冲液，同时加入1.2倍当量的UDP-GlcA、5mL PmHS2酶，室温搅拌过夜。PAMN-HPLC检测反应至产率≥97％，以C18层析柱纯化得三糖骨架2。以2为底物，重复上述KfiA、PmHS2反应，得到五糖骨架3，PAMN-HPLC测得其纯度>95％，ESI-MS测得其分量1181.85Da。
取200mg五糖3溶于100mL去离子水，置于冰上，逐滴加入0.5mol/L LiOH溶液至pH＝12，继续置于冰浴中2h，PAMN-HPLC检测反应进程；反应结束后，以冰醋酸调节pH至中性，加入适量1mol/L MES溶液(pH＝7.5)使其终浓度为50mmol/L，同时加入3倍当量的PAPS、～3mL NST酶，室温搅拌过夜，利用PAMN-HPLC检测反应；反应产率>95％时醋酸调pH至4-5终止反应，用Q Sepharose层析柱(30×1.6cm)纯化，流速为3mL/min，以0→100％含1mol/LNaCl、50mmol/LNaAc缓冲液(pH＝5)梯度洗脱，检测波长为260nm和310nm，收集目标组分、脱盐、干燥得N-硫酸化的肝素五糖4。PAMN-HPLC测得其纯度>99％，ESI-MS测得其分量1149.17Da。由五糖4的1H-NMR(400MHz,D2O)谱图得相关重要数据为：δ5.58(d,J＝3.8Hz,1H)、δ5.55(d,J＝3.8Hz,1H)、δ5.22(d,J＝7.9Hz,1H)、δ4.46(d,J＝9.2Hz,1H)、δ4.44(d,J＝7.8Hz,1H)。
将上一步得到的五糖4溶于终浓度50mmol/L、pH＝7.5的MES缓冲液(含2mmol/LCaCl2)，同时加入3倍当量的PAPS、3mL 2OST酶，室温反应过夜，PAMN-HPLC检测反应效果，待反应产率>95％时，用醋酸调pH至4-5终止反应，同前法用Q Sepharose层析柱(30×1.6cm)纯化，收集目标组分、脱盐、干燥得产物5，PAMN-HPLC测得其纯度>99％。ESI-MS测得其分量1310.2Da，与底物4与比增加2个硫酸基团。根据5的1H-NMR(600MHz,D2O)谱图得重要相关数据为：δ5.53(d,J＝3.7Hz,1H)、δ5.44(d,J＝3.7Hz,1H)、δ5.33(d,J＝7.7Hz,1H)、δ4.60(d,J＝7.8Hz,1H)、δ4.39(d,J＝7.9Hz,1H)，因此化合物5为含2个GlcA2S残基的稀有新型肝素五糖。
含连续GlcA2S残基的稀有肝素五糖(A)合成路线见式Ⅲ所示，
实施例2：含3个连续GlcA2S的稀有肝素七糖7的制备
取～200mg五糖骨架3，参考实施例1依次进行KfiA、PmHS2酶促糖链延长，得七糖骨架6，ESI-MS测得其分子量与理论值相符；然后LiOH处理脱三氟乙酰基、NST催化进行N-硫酸化修饰得肝素七糖7，PAMN-HPLC测得其纯度>99％，ESI-MS测得其分子量1566.32Da。
得到的七糖7参照实施例1进行2OST酶法修饰，PAPS加入量改为4倍量，反应液纯化得产物8，PAMN-HPLC测得其纯度>99％。ESI-MS测得其分量1805.92Da，与底物7相比增加3个硫酸基团。由7的1H-NMR(600MHz,D2O)谱图得重要相关数据为：δ5.50(d,J＝3.6Hz,1H)、δ5.41(d,J＝3.5Hz,1H)、δ5.38(d,J＝3.8Hz,1H)、δ5.30(d,J＝7.6Hz,1H)、δ4.58(d,J＝6.4Hz,1H)、δ4.55(d,J＝7.9Hz,1H)、δ4.35(d,J＝7.8Hz,1H)，因此化合物7为含3个GlcA2S的稀有新型肝素七糖。
含连续GlcA2S残基的稀有肝素七糖(B)的合成路线见式Ⅳ所示，
实施例3：含4个连续GlcA2S的稀有肝素九糖13的制备
取100mg含2个GlcA2S残基的稀有肝素五糖5，参照实施例1进行KfiA、PmHS2酶促糖链延长至形成肝素九糖11，Q Sepharose层析柱(30×1.6cm)纯化，ESI-MS测得其分子量与理论值相符；然后LiOH处理脱三氟乙酰基、NST催化进行N-硫酸化修饰得肝素九糖12，PAMN-HPLC测得其纯度>99％，ESI-MS测得其分子量与理论值相符。
得到的肝素九糖12参照实施例1进行2OST酶法修饰，反应液Q Sepharose层析柱(30×1.6cm)纯化得产物13，ESI-MS测得其分量2303.2Da，表明其含4个硫酸基团。由13的1H-NMR(600MHz,D2O)谱图得重要相关数据为：δ5.61(d,J＝3.7Hz,1H)、5.52(d,J＝3.8Hz,1H)、5.49(d,J＝3.7Hz,2H)、5.41(d,J＝7.6Hz,1H)、4.66(m,3H)、4.48(d,J＝7.9Hz,1H)，因此化合物13为含4个GlcA2S的稀有新型肝素九糖。
含连续GlcA2S残基的稀有肝素九糖的合成路线见式Ⅴ所示，
实施例4：肝素十二糖中间体19的制备
取～40mg含4个GlcA2S的稀有肝素九糖13，依次经KfiA、PmHS2酶促催化延长糖链得肝素十一糖16，ESI-MS测得其分子量为2736.12Da，用LiOH处理脱三氟乙酰基、NST酶法N-硫酸化修饰得肝素十一糖17，然后经KfiA酶法延长糖链得肝素十二糖18，ESI-MS测得其分子量正确。上述反应液纯化均用Q Sepharose层析柱(10×1.0cm)进行，以0→100％洗脱液(含1mol/L NaCl、50mmol/L NaAc缓冲液，pH＝5)梯度洗脱得到产物，
肝素十二糖18溶于适量50mmol/L、pH＝7.5的MES缓冲液(含2mmol/L CaCl2)，加入1.0mL异构化酶C5-epi，于37℃反应2h；然后加入1.5倍当量的PAPS、1.0mL 2OST，室温反应过液，PAMN-HPLC检测反应进程，待反应率>99％，用Q Sepharose层析柱(10×1.0cm)纯化；得到的产物用LiOH处理脱三氟乙酰基、NST酶法N-硫酸化修饰得肝素十二糖中间体19，PAMN-HPLC测得其纯度>95％，ESI-MS测得其分子量为3041.2Da。
实施例5：新型肝素十二糖21的化学酶法制备
上步反应得到的肝素十二糖中间体19溶于适量50mmol/L、pH＝7.5的MES缓冲液，加入10倍当量的PAPS、6OST1和6OST3各2mL，室温反应过夜，利用SAX-HPLC检测反应进程，色谱条件为：流速为1mL/min，以0→100％洗脱液B(50mmol/L NaAc+2mol/L NaCl，pH＝5)梯度洗脱为，检测波长为260nm和310nm。待十二糖中间体19完全消失，反应液调pH＝5，用QSepharose层析柱(10×1.0cm)进行纯化，于150min内以0→100％洗脱液B(50mmol/L NaAc+2mol/L NaCl，pH＝5)梯度洗脱，收集洗脱峰组分、脱盐得6-O-硫酸化的肝素十二糖中间体20。SAX-HPLC测得其纯度>95％，ESI-MS测得其分子量为3520.61Da。
将得到的十二糖中间体20溶于50mmol/L、、pH＝7.5的MES溶液中，加入1.5倍当量的PAPS和1mL的3OST1酶，室温过夜反应，SAX-HPLC检测反应进程。反应液用Q Sepharose层析柱(10×1.0cm)纯化、脱盐并干燥得产物。SAX-HPLC测得产物的纯度>95％，ESI-MS测得其分子量为3600.65Da，表明所得产物即为新型肝素十二糖21，其结构与通式I相符。
新型肝素十二糖的合成路线见式Ⅵ所示，
实验例1：新型肝素十二糖21的体外抗凝活性测定
利用商品化的试剂盒采用生色底物法测得本发明制备得到的新型肝素十二糖21抗FⅩa活性的IC50值为32.36ng/mL(7.9nmol/L)，同样条件下测得未分级肝素(UFH)、低分子量肝素依诺肝素(LMWH)和磺达肝癸钠(Arixtra)的IC50值分别为379.9ng/mL、92.7ng/mL、14.41ng/mL(8.4nmol/L)，以摩尔浓度计新型肝素十二糖21抗FⅩa活性的IC50值与磺达肝癸钠相当。经生色底物法测定，测试结果见图2所示，本发明制备得到的新型肝素十二糖21无显著的抗IIa因子活性。因此，本发明制备得到的新型肝素十二糖21为Xa因子的特异抑制剂。
实验例2：鱼精蛋白对新型肝素十二糖21抗凝活性的中和作用测定
采用生色底物法，加入不同浓度的鱼精蛋白对新型肝素十二糖21抗FⅩa活性的影响，由测定结果可知，与UFH类似，新型肝素十二糖21的体外抗FⅩa活性可以完全被鱼精蛋白逆转，相比之下，依诺肝素钠的抗FⅩa活性只能部分被鱼精蛋白中和，而磺达肝癸钠的抗Ⅹa活性完全不能被逆转，测试结果见图3所示，因此，本发明制备得到的肝素十二糖21为抗凝活性可被鱼精蛋白中和的新型肝素分子。