一种促进神经干细胞分化的方法
阅读说明：本技术 一种促进神经干细胞分化的方法 (Method for promoting differentiation of neural stem cells ) 是由 胥传来 瞿爱华 匡华 孙茂忠 徐丽广 郝昌龙 刘丽强 宋珊珊 胡拥明 高巍 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种促进神经干细胞分化的方法,属于材料化学技术领域。本发明以天冬氨酸、组氨酸或者谷胱甘肽作为手性配体,镍盐、铜盐、钴盐作为原料,在弱碱性条件,制备得到具有手性的金属氢氧化物纳米簇,在近红外光作用下,可促进神经干细胞分化。本发明方法提出了一种具有手性的金属氢氧化物纳米簇在近红外光照下调控神经干细胞的分化,对于光驱动手性纳米材料与细胞的相互调节生物学行为具有重要的意义。(The invention provides a method for promoting differentiation of neural stem cells, and belongs to the technical field of material chemistry. According to the invention, aspartic acid, histidine or glutathione is used as a chiral ligand, nickel salt, copper salt and cobalt salt are used as raw materials, and the chiral metal hydroxide nanocluster is prepared under the alkalescent condition, so that the differentiation of neural stem cells can be promoted under the action of near infrared light. The method provided by the invention has the advantages that the chiral metal hydroxide nanoclusters regulate the differentiation of the neural stem cells under the near-infrared light irradiation, and the method has important significance for mutually regulating biological behaviors of the photo-driven chiral nano material and the cells.)
技术领域
本发明属于材料化学技术领域，尤其是涉及一种促进神经干细胞分化的方法。
背景技术
神经元是神经系统最基本的结构和功能单位。大脑内的大部分神经细胞不具备自我更新能力或者分化能力有限，一旦受损、死亡都无法再生。受损的神经元会导致神经退行性疾病的出现，如阿尔兹海默症、帕金森等，会使大脑产生持续性的记忆和认知障碍。而神经干细胞是一种具有多种分化潜能的干细胞，它能够被诱导分化产生大量脑细胞组织，从而补充受损的神经细胞。因此神经干细胞被认为是治疗神经系统疾病最有效的手段。然而，如何高效诱导神经干细胞的定向分化决定了其最终在脑中的成活率，同时也是限制这一技术发展的主要瓶颈。
现有技术中构建了一种多级次手性纳米组装结构(申请号：CN202010325740.8)，利用这种手性组装体能够在圆偏振光(532nm)作用下对细胞骨架产生的机械力，从而高效诱导神经干细胞的分化，存在光照穿透深度浅的问题，以及在较强功率的光照过程中吸热严重，影响细胞活性，因此在促进神经干细胞分化中急需一种穿透性强，光照过程吸热较弱的材料。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种促进神经干细胞分化的方法。
一种促进神经干细胞分化的方法，将手性配体与金属盐作为原料，在碱性条件下反应制备得到具有手性的金属氢氧化物纳米簇，将所得金属氢氧化物纳米簇加入神经干细胞分化培养体系中，与神经干细胞共同孵育，在近红外光作用下促进神经干细胞的分化。
在本发明的一个实施例中所述金属盐选自六水合氯化镍、硝酸镍、氯化钴、氯化铜、硝酸钴、硝酸铜。
在本发明的一个实施例中，所述手性配体选自组氨酸、天冬氨酸和谷胱甘肽中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述天冬氨酸选自D型或者L型天冬氨酸，所述组氨酸选自D型或者L组氨酸，所述谷胱甘肽选自D型或者L谷胱甘肽。
在本发明的一个实施例中，所述近红外光的波长范围为950-1200nm。
在本发明的一个实施例中，所述碱性条件为溶液的pH值为8-9。
在本发明的一个实施例中，所述金属氢氧化物纳米簇中的金属氢氧化物为氢氧化镍、氢氧化钴、氢氧化铜。
在本发明的一个实施例中，所述手性配体和金属盐的质量比为6-8：2-3。
在本发明的一个实施例中，所述神经肝细胞的分化步骤为：
S1：将神经干细胞贴壁培养后加入siRNA，孵育培养得到神经干细胞分化培养体系；
S2：向神经干细胞分化培养体系中加入所述金属氢氧化物纳米簇的水溶液并进行共孵育，共孵育12h-16h，后采用红外光照射5-10min；
S3：重复步骤S2中操作3-5次。
所述siRNA用来抑制神经干细胞向星形角质细胞方向分化。
在本发明的一个实施例中，所述金属氢氧化物纳米簇的水溶液的浓度为400-500μg/mL。
在本发明的一个实施例中，所述近红外光的光能量为100-250mW/cm2。
在本发明的一个实施例中，所述siRNA浓度为2-4μg/mL。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提出了一种具有近红外手性的金属氢氧化物纳米簇在950nm-1200nm光照下促进神经干细胞分化的方法，对于近红外光驱动手性纳米材料与细胞的相互作用，调节生物学行为具有重要的意义。
1、本发明所述金属氢氧化物纳米簇的吸收波长在近红外区，利用近红外光照射可以提高光的穿透深度，未来有希望应用于活体中。
2、本发明所述金属氢氧化物纳米簇区别于贵金属等离子体材料，对光的吸收比较温和，在光照下不会产生热量，避免细胞损伤。
3、本发明所述金属氢氧化物纳米簇粒径比较小，在与细胞相互作用时，更容易与神经元相关蛋白结合，分化效率比较好。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例1中天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇的圆二色光谱。
图2是本发明实施例1中天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇的吸收光谱图。
图3是本发明实施例1中天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇的透射电镜TEM图。
图4是本发明实施例2组氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇的圆二色光谱。
图5是本发明实施例2组氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇的吸收光谱图。
图6是本发明实施例3谷胱甘肽修饰的氢氧化铜纳米簇的圆二色光谱。
图7是本发明实施例3谷胱甘肽修饰的氢氧化铜纳米簇的吸收光谱图。
图8是本发明实施例4天冬氨酸修饰的氢氧化钴纳米簇的圆二色光谱。
图9是本发明实施例4天冬氨酸修饰的氢氧化钴纳米簇的吸收光谱图。
图10是本发明实施例1-4中所述神经干细胞分化轴突长度统计图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1、金属氢氧化物纳米材料的制备
(1)近红外手性信号的氢氧化镍纳米簇(天冬氨酸为配基)合成和纯化路线如下：
在室温条件下，取D型和L型天冬氨酸(654mg)与六水合氯化镍(238mg)，分别加入含有60mL水的三口烧瓶中，搅拌混匀2分钟后，加入4.6mL 1M的氢氧化钠调节pH为弱碱性(8.4)；再继续混合搅拌12h，形成天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇。将得到的样品用异丙醇洗涤，超纯水重悬，用于后续表征。
合成得到的具有近红外手性信号的氢氧化镍纳米簇的圆二色光谱图如图1所示：在1000-1200nm之间有明显的圆二色信号，其特征峰位于1100nm左右，并且D型天冬氨酸和L型天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇展示了对称的手性信号；对应的吸收光谱图如图2所示，在1000-1200nm之间有一定的吸收；透射电镜(TEM)图如图3所示，合成的氢氧化镍纳米簇平均粒径在3nm左右。
2、氢氧化镍纳米簇在980nm光照作用下，促进神经干细胞分化的方法如下：
将神经干细胞培养在包有多聚赖氨酸的平板上，使其贴壁生长；12h后，加入siRNA(siSOX9，2.6μg/mL)，共孵育14h后，在培养基中添加D型或者L型氢氧化镍纳米簇，共孵育12h后，用980nm激光(200mW/cm2)照射10分钟，重复以上添加D型或者L型氢氧化镍纳米簇和激光照射的操作五次，观察神经元分化效果，发现神经元轴突增长，并且D型纳米簇促分化效果比L型好。
氢氧化镍纳米簇在980nm光照作用下对神经干细胞的分化效果如图10所示，天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇在980nm光照作用下促进神经干细胞的分化，与对照组相比(空白组中不添加氢氧化镍纳米簇或siRNA，siRNA组只添加siRNA)，其轴突长度增长；本发明还发现在D型天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇和980nm光照作用下，轴突的长度增长到110-140μm，而L型天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇只有70-90μm。
实施例2
1、近红外手性信号的氢氧化镍纳米簇(组氨酸为配基)合成和纯化路线如下：
在室温条件下，取D型或者L型组氨酸(754mg)和硝酸镍(386mg)加入含有60mL水的三口烧瓶中，搅拌混匀2分钟后，加入4.2mL 1M的氢氧化钠调节pH为弱碱性(8.4)；再继续混合搅拌12h，形成组氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇。将得到的样品用异丙醇洗涤，超纯水重悬，用于后续表征。
合成得到的具有近红外手性信号的氢氧化镍纳米簇的圆二色光谱图如图4所示：在可见光区(430nm)有很强的CD信号，近红外区的特征峰位于1100nm左右，并且D型组氨酸和L型组氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇展示了对称的手性信号；对应的吸收光谱图如图5所示，在1000-1200nm之间有一定的吸收。
2、氢氧化镍纳米簇在980nm光照作用下，促进神经干细胞分化的方法如下：
将神经干细胞培养在包有多聚赖氨酸的平板上，使其贴壁生长；12h后，加入siRNA(siSOX9，2.6μg/mL)，共孵育14h后，在培养基中添加D型或者L型氢氧化镍纳米簇，共孵育12h后，用980nm激光(200mW/cm2)照射10分钟，重复以上添加D型或者L型氢氧化镍纳米簇和激光照射的操作五次，观察神经元分化效果，实验结果见图10。D型组氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇轴突的长度增长到95-120μm，而L型天组氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇只有70-85μm。
实施例3
1、近红外手性信号的氢氧化铜纳米簇(谷胱甘肽为配基)合成和纯化路线如下：
在室温条件下，取D型或者L型谷胱甘肽(625mg)和氯化铜(265mg)加入含有60mL水的三口烧瓶中，搅拌混匀2分钟后，加入4.2mL 1M的氢氧化钠调节pH为弱碱性(8.4)；再继续混合搅拌12h，形成谷胱甘肽修饰的氢氧化铜纳米簇。将得到的样品用异丙醇洗涤，超纯水重悬，用于后续表征。
合成得到的氢氧化铜纳米簇的圆二色光谱图如图6所示：分别在600nm和800nm处有CD信号，近红外区的特征峰比较弱，并且D型谷胱甘肽和L型谷胱甘肽修饰的氢氧化铜纳米簇展示了对称的手性信号；对应的吸收光谱图如图7所示，在600nm处的吸收比较强。
2、氢氧化铜纳米簇在980nm光照作用下，促进神经干细胞分化的方法如下：
将神经干细胞培养在包有多聚赖氨酸的平板上，使其贴壁生长；12h后，加入siRNA(siSOX9，2.6μg/mL)；共孵育14h后，在培养基中添加D型或者L型氢氧化铜纳米簇，共孵育12h后，用980nm激光(200mW/cm2)照射10分钟，重复以上添加D型或者L型氢氧化铜纳米簇和激光照射的操作五次，观察神经元分化效果，实验结果见图10。D型谷胱甘肽修饰的氢氧化铜纳米簇轴突的长度增长到85-100μm，而L型谷胱甘肽修饰的氢氧化铜纳米簇只有65-75μm。
实施例4
1、近红外手性信号的氢氧化钴纳米簇(天冬氨酸为配基)合成和纯化路线如下：
在室温条件下，取D型或者L型天冬氨酸(758mg)和氯化钴(347mg)加入含有60mL水的三口烧瓶中，搅拌混匀2分钟后，加入4.5mL 1M的氢氧化钠调节pH为弱碱性(8.4)；再继续混合搅拌12h，形成天冬氨酸修饰的氢氧化钴纳米簇。将得到的样品用异丙醇洗涤，超纯水重悬，用于后续表征。
合成得到的氢氧化钴纳米簇的圆二色光谱图如图8所示：分别在520nm和1200nm处有较强的CD信号，并且D型谷胱甘肽和L型谷胱甘肽修饰的氢氧化铜纳米簇展示了对称的手性信号；对应的吸收光谱图如图9所示，520nm和1200nm处的吸收比较强，但是在980nm处的吸收比较弱。
2、氢氧化钴纳米簇在980nm光照作用下，促进神经干细胞分化的方法如下
将神经干细胞培养在包有多聚赖氨酸的平板上，使其贴壁生长；12h后，加入siRNA(siSOX9，2.6μg/mL)，共孵育14h后，在培养基中添加D型或者L型氢氧化钴纳米簇，孵育12h后，用980nm激光(250mW/cm2)照射10分钟，重复以上添加D型或者L型氢氧化钴纳米簇和激光照射的操作五次，观察神经元分化效果，实验结果见图10，发现神经元轴突增长。D型天冬氨酸修饰的氢氧化钴纳米簇轴突的长度增长到85-100μm，而L型天冬氨酸修饰的氢氧化钴纳米簇只有65-75μm。
由图10可知，与对照组相比(空白组中不添加氢氧化镍纳米簇或siRNA，siRNA组只添加siRNA)，所有实验组神经元轴突增长；其中实施例1中天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇在980nm光照作用下促进神经干细胞的分化效果比实施例2中组氨酸修饰的氢氧化镍、实施例3中谷胱甘肽修饰的氢氧化铜、实施例4中天冬氨酸修饰的氢氧化钴促分化效果好，其轴突长度最长，这可能与天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇在980nm处的吸收强度有关。同时，本发明还发现在实施例1中所得D型天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇和980nm光照作用下，轴突的长度增长到110-140μm，而L型天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇只有70-90μm。
实施例5
1、近红外手性信号的氢氧化镍纳米簇(天冬氨酸为配基)合成和纯化路线如下：
在室温条件下，取D型天冬氨酸(654mg)与硝酸镍(238mg)，分别加入含有60mL水的三口烧瓶中，搅拌混匀2分钟后，加入4.6mL 1M的氢氧化钠调节pH为弱碱性(8)；再继续混合搅拌18h，形成天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇。将得到的样品用异丙醇洗涤，超纯水重悬，用于后续表征。
2、氢氧化镍纳米簇在980nm光照作用下，促进神经干细胞分化的方法如下：
将神经干细胞培养在包有多聚赖氨酸的平板上，使其贴壁生长；12h后，加入siRNA(siSOX9，4μg/mL)；孵育12h后，在培养基中添加D型天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇，孵育16h后，用980nm激光(250mW/cm2)照射5分钟，重复以上添加D型或者L型氢氧化镍纳米簇和激光照射的操作3次，观察神经元分化效果，发现神经元轴突增长。
实施例6
1、近红外手性信号的氢氧化镍纳米簇(天冬氨酸为配基)合成和纯化路线如下：
在室温条件下，取L型天冬氨酸(654mg)与硝酸镍(238mg)，分别加入含有60mL水的三口烧瓶中，搅拌混匀2分钟后，加入4.6mL 1M的氢氧化钠调节pH为弱碱性(8)；再继续混合搅拌18h，形成天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇。将得到的样品用异丙醇洗涤，超纯水重悬，用于后续表征。
2、氢氧化镍纳米簇在980nm光照作用下，促进神经干细胞分化的方法如下：
将神经干细胞培养在包有多聚赖氨酸的平板上，使其贴壁生长；12h后，加入siRNA(siSOX9，2μg/mL)，共孵育16h后，在培养基中添加L型天冬氨酸修饰的氢氧化镍纳米簇，共孵育16h，并用980nm激光(250mW/cm2)照射8分钟，重复以上添加D型或者L型氢氧化镍纳米簇和激光照射的操作4次，观察神经元分化效果，发现神经元轴突增长。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。