一种hsv减毒株及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种hsv减毒株及其制备方法与应用 (HSV attenuated strain and preparation method and application thereof ) 是由 李艳梅 李一濛 徐沐 陈姝妮 于丽 易庭 郑丽春 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种HSV减毒株及其制备方法与应用,属于生物技术领域,本发明针对HSV1和HSV2两种病毒中均具有的、能特异性抑制天然免疫反应/获得性免疫反应/细胞应激保护性反应的不同产物,以及能够进入机体神经系统导致潜伏性感染的能力,设计了一种能够基于缺失修饰病毒不同基因而改变病毒在长期进化过程中形成的、特异性针对宿主细胞应激反应和天然免疫反应的不同信号传导途径和不同效应靶点的作用特性的技术策略,从而得到了一个特定的HSV1基因缺陷减毒毒株；本发明所得HSVI基因缺陷减毒毒株作为治疗及预防疱疹病毒HSV1的疫苗使用,能有效治疗或预防疱疹病毒HSV1的感染所引起的疾病。(The invention relates to an HSV attenuated strain and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of biology, aiming at different products which are contained in two viruses, namely HSV1 and HSV2 and can specifically inhibit natural immunoreaction/acquired immunoreaction/cell stress protective reaction, and the capability of entering a nervous system of an organism to cause latent infection, the invention designs a technical strategy which can change the action characteristics of different signal transduction paths and different effect targets which are formed in the long-term evolution process of the viruses and specifically aim at the host cell stress reaction and the natural immunoreaction based on deletion modification of different genes of the viruses, thereby obtaining a specific HSV1 gene defect attenuated strain; the HSVI gene defect attenuated strain obtained by the invention can be used as a vaccine for treating and preventing the herpes virus HSV1, and can effectively treat or prevent diseases caused by infection of the herpes virus HSV 1.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种HSV减毒株及其制备方法与应用。
背景技术
人类单纯疱疹病毒包括两个型别，HSV1和HSV2(Herpes simplex virus 1,2)。二者均 属于人类疱疹病毒家族α亚组成员。两种病毒均可引起人类各个年龄段的疱疹性疾病，包括 口腔疱疹、生殖器疱疹、疱疹性脑炎及其它疱疹性神经系统的感染。其中，HSV1多见于口腔 疱疹，而HSV2多见于生殖器疱疹。但二者的感染模式均有相互转化的趋势。HSV1和HSV2两 种病毒均在全球有很高的感染率和发病率。不同的统计表明，HSV1在感染人群中的感染率约 在25-47％，而HSV2在15-49岁人群中的感染率约在11-15％。其中，二者因生殖器感染而导 致的新生婴幼儿疱疹性脑炎感染率约为0.1％，其可导致较高的死亡率。至今为止，尚无针对 这两种病毒的有效治疗性药物和疫苗的问世。因此，针对该病毒的疫苗相关的基础及技术研 究具有重要的意义。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种HSV减毒株及其制备方法与应用， 利用基因编辑技术对HSV1的修饰重编，使之成为一种具备免疫有效性和安全性前景的疫苗候 选株。为此，本发明的目的之一在于提供一种HSV减毒株；本发明的目的之二在于提供一种 HSV减毒株的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种含有HSV减毒株的疫苗，本发明 的目的之四在于提供HSV减毒株在作为疫苗的应用。
本发明的第一目的是通过以下技术方案实现的：
所述HSV减毒株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物体分类 命名为：人单纯疱疹病毒1形(Herpse simplex virus 1)，保藏编号为CGMCCNo.21598，保 藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年07月13日。
本发明的第二目的是通过如下技术方案实现的：
所述的HSV减毒株的制备方法，通过对HSV1的修饰重编实现，具体包括：剪切HSV病毒的Us5基因第185到329位核苷酸的片段；剪切UL41基因从249到435位编码区的基 因；剪切Us11基因编码区从91到289位的核苷酸基因片段；剪切RL1基因序列中编码从207 到453位氨基酸序列的基因片段。
进一步的，包括如下步骤：
(1)设计引物A，在Cas9酶存在下，剪切HSV病毒的Us5基因第185到329位核苷酸 的基因片段，并经过克隆纯化筛选，得到Us5基因部分剪切病毒株，命名为WR-1；
(2)在WR-1的基础上，设计引物B，在Cas9酶存在下，剪切UL41基因从249到435 位编码区的基因片段，并经过克隆纯化筛选，得到UL41基因部分删除的毒株，命名为WR-2；
(3)在WR-2的基础上，设计引物C，在Cas9酶存在下，剪切Us11基因编码区从91 到289位的核苷酸基因片段，并经过克隆纯化筛选，产生WR-3毒株；
(4)在WR-3的基础上，设计引物D，在Cas9酶存在下，去除RL1基因编码区从207 到453位核苷酸基因片段，并经过克隆纯化筛选，获得HSV1减毒株。
进一步的，
剪切Us5基因所使用的引物A的核苷酸序列为US5-F1:CACCGGGCTTTTGGGAAGCCTCGT； US5-R1:AAAC ACGAGGCTTC CCAAAAGCCC；US5-F2:CACCGGGCTGTGCGCCGTAGTCCT；US5-R2: AAAC AGGACTACGG CGCACAGCCC。
剪切后的Us5基因基因序列如SEQ ID NO:1所示。
剪切UL41基因所使用的引物B的核苷酸序列表为UL41-F1:CACCCATCTTCGTTACCGATCGCG； UL41-R1:AAAC CGCGATCGGT AACGAAGATG；UL41-F2:CACCCGCGGCACCTCTCTGG CCTC； UL41-R2:AAAC GAGGCCAGAG AGGTGCCGCG。
剪切后的UL41基因序列如SEQ ID NO:2所示。
剪切Us11基因所使用的引物C的核苷酸序列表为US11-F1:CACC TCCGCCGGCATGCACCC CAG；US11-R1:AAAC CTGGGGTGCA TGCCGGCGGA；US11-F2:CACC GCGAGCTCCCAGAGACCCCA； US11-R2:AAAC TGGGGTCTCT GGGAGCTCGC。
剪切后的Us11基因序列如SEQ ID NO:3所示。
剪切RL1基因所使用的引物D的核苷酸序列表为RL1-F1:CACC GAGTCCGCGTCCGACGACGA； RL1-R1:AAAC TCGTCGTCGG ACGCGGACTC；RL1-F2:CACC CGCCTGCG CCTGCGACGCGC； RL1-R2:AAAC GCGCGTCGCA GGCGCAGGCG。
剪切后的RL1基因序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，步骤(1)-(4)中，克隆纯化筛选方法为：
Vero细胞铺种于6孔板中至细胞贴壁完全后，弃去原有培养基，PBS清洗，突变病毒用 无血清MEM培养基做10倍稀释(1:1-1:106)后取不同稀释度的病毒液以1ml/每孔的体积加 入各个细胞孔中，并设置1个阴性对照孔。置于5％CO2 37℃培养箱中吸附2-3h。随后，弃去 细胞培养板中的病毒液后缓慢沿板壁按2.5-3ml/孔的体积将已高压并使其温度降至42℃左右 的琼脂糖培养基混合物加入细胞孔中。待其冷后置于5％CO237℃倒置培养，观察3-4天直到 蚀斑出现；
至出现肉眼可见蚀斑，并标记后挑取蚀斑并重悬于100ul无血清DMEM培养基。
进一步的，步骤(1)-(4)中，在克隆纯化筛选前先进行细胞繁殖。
本发明提供的HSV减毒株在制备疱疹疫苗中的应用。
一种疱疹疫苗，包含本发明所述的HSV减毒株。
本发明的有益效果及技术原理：
本研究针对HSV1和HSV2两种病毒中均具有的、能特异性抑制天然免疫反应/获得性免 疫反应/细胞应激保护性反应的不同产物，以及能够进入机体神经系统导致潜伏性感染的能力， 设计了一种能够基于缺失修饰病毒不同基因而改变病毒在长期进化过程中形成的、特异性针 对宿主细胞应激反应和天然免疫反应的不同信号传导途径和不同效应靶点的作用特性的技术 策略，该策略基于对HSV感染宿主细胞过程的病理机理，组合了一系列的、能够系统控制病 毒在分步抑制细胞反应时所转录激活的若干编码基因，并使这些可对细胞生理性应激和天然 免疫学反应功能产生病理侵袭的病毒基因失活，从而得到了一个特定的HSV1基因缺陷减毒 毒株。
附图说明
图1是WR-1病毒PCR鉴定结果电泳图；
图2是WR-2病毒PCR鉴定结果电泳图；
图3是WR-3病毒PCR鉴定结果电泳图；
图4是WR-4病毒PCR鉴定结果电泳图；
图5是WR-4和野毒株在二倍体上皮细胞的增殖动力学曲线；
图6是WR-4和野毒株在SH-SY5Y细胞的增殖动力学曲线；
图7是WR-4和野毒株在vero细胞上蚀斑形态图；
图8是WR-4毒株和野毒株滴鼻感染小鼠体重变化图；
图9是WR-4毒株和野毒株滴鼻感染小鼠存活率变化图；
图10WR-4株和野毒株在脑病毒载量差异；
图11WR-4株和野毒株在脊髓病毒载量差异；
图12WR-4株和野毒株在三叉神经节病毒载量差异；
图13WR-4株和野生型毒株感染小鼠后血清中的TNF-α表达变化；
图14WR-4株和野生型毒株感染小鼠后血清中的IFN-β表达变化；
图15WR-4株和野生型毒株感染小鼠后血清中的IFN-γ表达变化；
图16WR-4株针对HSV1感染给予治疗后小鼠体重变化；
图17WR-4株针对HSV1感染给予治疗后小鼠生存率变化；
图18WR-4株针对HSV1感染给予治疗后脑组织中病毒增殖变化；
图19WR-4株针对HSV1感染给予治疗后脊髓组织中病毒增殖变化；
图20WR-4株针对HSV1感染给予治疗后三叉神经节组织中病毒增殖变化；
图21WR-4株针对HSV1感染给予治疗后血清中IFN-γ表达变化；
图22WR-4株针对HSV1感染给予治疗后外周血中CD8+T亚群细胞变化。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进 行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1 HSV减毒株及其制备方法
本实施例提供了一种HSV减毒株，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏编号为CGMCC No.21598，保藏日期为2021年07月13日。该HSV减毒株，通过对HSV1的Us5基因、UL41基因、Us11基因和RL1基因修饰剪切后获得。
本发明的HSV减毒株，其基因序列除了对Us5基因、UL41基因、Us11基因和RL1基 因进行修饰外，其余均与HSV1基因相同。
修饰后的Us5基因序列如SEQ ID NO:1所示。
修饰后的UL41基因序列如SEQ ID NO:2所示。
修饰后的Us11基因序列如SEQ ID NO:3所示。
修饰后的RL1基因序列如SEQ ID NO:4所示。
该HSV减毒株的制备方法为：
(1)设计引物A：US5-F1:CACC GGGCTTTTGGGAAGCCTCGT；US5-R1:AAAC ACGAGGCTTCCCAAAAGCCC；US5-F2:CACC GGGCTGTGCGCCGTAGTCCT；US5-R2:AAAC AGGACTACGGCGCACAGCCC。
引物转染HSV1 F毒株感染的293细胞后，可在Cas9酶存在下，剪切HSV1病毒的Us5基因第185到329位核苷酸的片段，剪切重组后继续在细胞中繁殖48小时，并经过克隆纯化筛选，得到Us5基因部分剪切病毒株，命名为WR-1。剪切后的Us5基因序列如SEQ ID NO:1 所示。
病毒感染宿主细胞时，对细胞的刺激将引起细胞生理应激反应，其中一个主要的内容即 是细胞凋亡，该生理性反应将可以使病毒借以增殖的宿主细胞迅速自行死亡，从而在一定程 度上抑制病毒的增殖。而HSV病毒的Us5基因编码产物，可以作用于细胞凋亡相关蛋白并发 挥其激酶作用，在改变该蛋白的表观生物学性质的基础上使细胞凋亡启动过程中止，通过删 除病毒Us5基因的相关编码区序列，降低病毒对宿主细胞的病理损伤。
(2)在WR-1的基础上，设计引物B：UL41-F1:CACC CATCTTCGTTACCGATCGCG；UL41-R1:AAAC CGCGATCGGT AACGAAGATG；UL41-F2:CACC CGCGGCACCTCTCTGG CCTC；UL41-R2:AAACGAGGCCAGAG AGGTGCCGCG。引物转染WR-1毒株感染的293细胞后，可在Cas9酶存在下， 剪切UL41基因从249到435位编码区的基因，剪切重组后继续在细胞中繁殖48小时，并经 过克隆纯化筛选，得到UL41基因部分删除的毒株，命名为WR-2。剪切后的UL41基因序列 如SEQ IDNO:2所示。
HSV在感染细胞的过程中，在利用其编码Us5基因产物以阻断细胞应激反应—细胞自主 程序化死亡的同时，还可以通过一个多功能的蛋白增加其对细胞病理性劫持。该蛋白由UL41 编码，亦即Vhs蛋白(Virion host shutoff protein)，其可以利用具有的mRNA特异性核酸内切 酶活性，选择性降解宿主细胞的mRNA，这一过程对细胞在应激性反应过程中的另一重要环 节—激活干扰素系统、编码多种特异性病毒因子以限制病毒在细胞间的扩散—产生重要的影 响，使细胞在通过程序化死亡(凋亡)机理破坏病毒感染细胞以限制病毒增殖的方式失效的 同时，还直接破坏感染细胞向周围未感染细胞发出预警信号及产生抗病毒效应分子的反应过 程。同时，由于Vhs还具有作用于细胞内天然免疫反应系统中RLRs受体(即 retinoic-acid-inducible gene 1 like receptor)的功能,由于这类受体分布于细胞器表面，能够识别 结合入侵病原体的异源DNA分子，同时激活相关的cGAS/STING介导的DNA分子识别通路， 从而激活细胞的NF-kB转录系统，产生一系列相应的天然免疫反应信号分子，其作为机体上 皮组织中的第一级免疫系统，可以对树突状细胞、NK细胞、以及巨噬细胞等天然免疫反应 细胞产生激活作用，使之趋化于感染细胞部位，吞噬感染细胞或病原分子，将之作为抗原递 呈给获得性免疫系统中的T细胞，激活特异性抗病毒反应。因此，病毒在感染上皮细胞时通 过Vhs分子作用于RLRs受体并阻断其对天然免疫反应的刺激，可使机体正常的天然免疫— 获得性免疫反应过程的正常激活受到直接影响。这因此造成HSV感染时，宿主细胞应激反应 —天然免疫反应—获得性免疫反应的每一个环节都受到影响。通过破坏病毒对细胞应激反应 中特异性mRNA分子的抑制分子Vhs编码基因UL41，同时控制了病毒利用这一分子对细胞 内RLRs的干扰性作用，保证了细胞内天然免疫反应的顺畅激活。
(3)在WR-2的基础上，设计引物C：US11-F1:CACC TCCGCCG GCATGCACCC CAG；US11-R1:AAAC CTGGGGTGCA TGCCGGCGGA；US11-F2:CACC GCGAGCTCCC AGAGACCCCA； US11-R2:AAAC TGGGGTCTCT GGGAGCTCGC。引物转染WR-2毒株感染的293细胞后，可在在 Cas9酶存在下，剪切Us11基因编码区从91到289位的核苷酸基因片段，剪切重组后继续在 细胞中繁殖48小时，并经过克隆纯化筛选，得到WR-3毒株。剪切后的Us11基因序列如SEQ ID NO:3所示。
在WR-2毒株已经可以去除病毒抑制细胞应激反应/天然免疫反应的遗传基础的前提下， 对具有阻断宿主细胞PKR酶激活以抑制细胞蛋白合成功能蛋白—Us11基因编码蛋白做了相 应的基因修饰突变，在降低病毒对细胞反应抑制作用的同时，亦根据Us11编码蛋白具有能够 辅助病毒的RL1基因编码的ICP34.5蛋白抑制eIF2-α亚基磷酸化的能力，从而在去除Us11 编码蛋白对PKR作用功能时，这一措施能够同时下调病毒ICP34.5的功能，对于病毒株在感 染宿主过程中的综合毒力有较强的减弱作用。
(4)在WR-3的基础上，设计引物D：RL1-F1:CACC GAGTCCGCGT CCGACGACGA；RL1-R1:AAAC TCGTCGTCGG ACGCGGACTC；RL1-F2:CACC CGCCTGCG CCTGCGACGC GC；RL1-R2:AAACGCGCGTCGCA GGCGCAGGCG。引物转染WR-3毒株感染的293细胞后，可在在Cas9酶存在下， 去除RL1基因序列中编码从207到453位氨基酸序列的基因片段，剪切重组后继续在细胞中 繁殖48小时，并经过克隆纯化筛选，获得HSV减毒株，命名为WR-4。剪切后的RL1基因 序列如SEQ ID NO:4所示。
发明人通过对HSV感染中可能长期存在的病理损伤、以及免疫系统无法彻底清除病毒等 的原因做了进一步的分析，基于该病毒在感染过程中能够在不同层面上抑制机体生理性应激/ 天然免疫反应/获得性免疫反应的特征，再加上病毒能够进入并引起在神经细胞(主要是三叉 神经节和骶神经节)中的长期潜伏，从而使得该病毒在感染机体过程中摆脱了免疫系统的监 控及清除，成为疫苗研究中的难题，基于这一分析和推理，以及在通过基因改造手段去除了 病毒干扰细胞生理性应激/天然免疫反应/获得性免疫反应的三个重要基因Us5/UL41/Us11的 基础上，对该病毒感染神经细胞过程中具有重要作用的RL1基因(其编码ICP34.5蛋白，对 病毒进入神经系统的潜伏感染有重要作用，做了相应的缺失突变，使病毒进入神经细胞形成 潜伏感染的功能缺失。同时，在WR-3株中修饰突变Us11基因的基础上，RL1基因缺失突变 所产生的低毒力—包括对上皮细胞和神经细胞毒力均可以有稳定的下降，并保证了毒株减毒 特征在不同环境下的稳定性和不可逆转。
实施例2 WR-1病毒、WR-2病毒、WR-3病毒和WR-4病毒克隆纯化方法
实施例1中，WR-1病毒、WR-2病毒、WR-3病毒和WR-4病毒克隆纯化筛选采用的方 法为：
Vero细胞铺种于6孔板中至细胞贴壁完全后。弃去原有培养基，PBS清洗。突变病毒用 无血清MEM培养基做10倍稀释(1:1-1:106)后取不同稀释度的病毒液以1ml/每孔的体积加 入各个细胞孔中，并设置1个阴性对照孔。置于5％CO2 37℃培养箱中吸附2-3h。随后，弃去 细胞培养板中的病毒液后缓慢沿板壁按2.5-3ml/孔的体积将已高压并使其温度降至42℃左右 的琼脂糖培养基混合物加入细胞孔中。待其冷后置于5％CO237℃倒置培养，观察3-4天直到 蚀斑出现。
蚀斑出现肉眼可见蚀斑，并标记后挑取蚀斑并重悬于100ul无血清DMEM培养基，冻存于-80℃备用或继续扩增。
实施例3 实施例1中WR-1病毒、WR-2病毒、WR-3病毒和WR-4病毒的PCR检测方 法
所有筛选获得的病毒克隆均在Vero细胞中增殖一代后，取病毒收获液200ul,以通用方 法提取病毒DNA基因，以此基因为模板进行4个修饰基因的特异性PCR鉴定，PCR体系为： 正反向引物各2pmol,Prime Star Max 25ul,DNA模板2ul,无菌蒸馏水补充至50ul体积，PCR 程序为：98℃,3min；98℃，20sec,58℃,15sec,72℃,1min；35cycles。产物在1.2％凝胶上电 泳鉴定。
PCR检测所用引物序列表为：
Us5-sense：CTCAGAACCCACCCGAAA
Us5-AS：AAGACAGACT TTGTTATACC
UL41-sense：CCTGTGGAACGTCATGTA
UL41-AS：CTCGTCGTCTTCGTATCC
Us11-sense:ACCATCACCCGAGTCTCT
Us11-AS:GTAGAGCCCTGAGTCATCC
RL1-sense:TAACCTCCACGCCCAACT
RL1-AS:ACGTTAGACCGAGTTCGC
通过PCR检测，分别得到实施例1WR-1病毒、WR-2病毒、WR-3病毒和WR-4病毒的 PCR鉴定结果电泳图如附图1-4所示。
实施例4 WR-4株(HSV减毒株)的生物学特征鉴定
对WR-4在组织培养的人二倍体上皮细胞WR-N株和SH-SY5Y细胞的增殖特性做了初步的观察。
人二倍体上皮细胞WR-N株，作为来源于人胚肺的上皮细胞，用于反映HSV易于感染各种上皮细胞的基本生物学特性；SH-SY5Y细胞是一种来自神经系统的神经母细胞瘤细胞，尽管其是一种肿瘤细胞，但依旧具有神经细胞生物学特征，其能反映HSV感染神经细胞的基本生物学特性。
首先将WR-4和野毒株分别以相同的moi接种于这两种细胞，比较二者在两种细胞上的 增殖动力学特征。实验结果表明，WR-4在两种细胞上的增殖动力学趋势都明显低于野毒株 (附图5和附图6)。同时，WR-4在vero细胞上所形成的克隆蚀斑形态明显小于野毒株(附 图7)。这一结果提示了两个方面的结论。其一，病毒在上皮细胞内增殖速度降减，提示了病 毒在细胞应激反应的压力下，其增殖速度与野毒株相继有明显下降。这表明改造Us5和UL41 的策略有明显效果。其二，突变病毒株WR-4在神经细胞母细胞瘤SH-SY5Y细胞中亦同时表 现了较低的增殖速率和较小的蚀斑形态，提示该毒株与感染神经细胞相关的RL1基因改造， 已引起了其对神经细胞感染相应特性的改变。
实施例5 WR-4株(HSV减毒株)实验性减毒活疫苗的制备
WR-4实验性减毒活疫苗毒株经在单层人二倍体细胞上增殖后检测确定其病毒滴度不低 于105CCID50/ml,稀释制备为病毒滴度105CCID50/ml的半成品,分装为0.5ml/瓶，加入冻干保 护剂后，经常规方法冻干，即为实验性减毒活疫苗。保存于4℃。
实施例6 WR-4株(HSV减毒株)减毒活疫苗感染小鼠的安全性观察
将实施例6所得减毒活疫苗，以5x 104CCID50/剂的剂量通过滴鼻途径接种小鼠后，对其 21天内的感染过程及病理表现做了病原学和病理学的检查，同时设置阴性对照组(Mock)。 20+60只接种WR-4毒株和20+60只接种了野毒株(Mckrae株)的Balb/c小鼠在接种后，对 两个组各20只感染小鼠以及阴性对照组20只小鼠隔天称体重并记录其变化，同时观察其死 亡个数，记录21天内的生存率。另外，两个组感染小鼠的60只部分每2天处死6只，并对 其各器官组织取样做病毒载量检测。同时取包括神经系统在内的主要器官组织切片进行组织 病理学检查。结果表明，WR-4毒株滴鼻感染小鼠后的21天内，20只小鼠体重均呈稳定上升 (附图8)。同时，亦未出现任何死亡现象(附图9)。而接种野毒株(Mckrae株)的20只小 鼠，在感染后第3-4天后出现体重明显下降和部分个体的死亡，存活的9只小鼠体重至第12 天才开始恢复至攻毒前水平(附图8、附图9)。而对每2天处死小鼠的小鼠各组织器官中的 病毒克隆的检测表明，WR-4株和野毒株在脑、脊髓、三叉神经的病毒载量表现出具有统计 学意义的差异,尤其在小鼠的大脑、脊髓和三叉神经节组织中(附图10-11)，野毒株在其中的 增殖高于WR-4株2个数量级约100倍左右。这一检测结果提示，WR-4由于其编码的、能特 异性与机体免疫系统作用的功能蛋白分子的基因缺陷，已获得了在机体中增殖能力大幅下降 的生物学表型。
通过对WR-4滴鼻感染小鼠各组织器官的病理检查亦表明，WR-4对小鼠各主要组织的病 理损伤能力已大幅下降(表1)。
表1：突变株WR-4及野生型毒株感染小鼠后各器官组织病理学观察
在该减毒活疫苗感染小鼠的中枢神经系统组织中，相较野毒株感染所导致的大范围炎症 细胞集聚，血管及周边组织充血、水肿、部分神经细胞退行性变等病理现象。WR-4毒株感 染小鼠仅表现小血管周围轻度的炎细胞浸润。同时，在其余组织中，野毒株感染可引起程度 不等的炎细胞集聚、充血和水肿等表现，而WR-4感染则只是引起轻微的炎细胞浸润。有意 思的是，WR-4感染动物的淋巴结中均可看到明显的细胞增生表现。这些检查结果表明，WR-4 毒株感染小鼠的特征和野毒株的强致病型相较，已经转变为非致病型，其表现在小鼠体内的 增殖能力明显下降，且未引起明显的组织病理损伤。
WR-4对毒株感染小鼠过程中体内免疫系统的反应特征：
首先，对野毒株感染和WR-4感染小鼠后第3、5、7天血清中干扰素，包括TNF-α、IFN-β 和IFN-γ的含量测定表明，二者具有明显的差异(附图13)，WR-4感染动物血清中的IFN-β和IFN-γ明显高于野毒株感染动物(附图14、附图15)。其次，二者血清中的TNF-α亦表现 了明显差异，野毒株感染动物则明显高于WR-4感染组(附图13)。结合前面所观察到的WR-4 感染动物时淋巴结中淋巴细胞的明显增生现象，认为，WR-4毒株能够在进入小鼠体内后， 既可以以其抗原相关分子直接刺激天然免疫系统并产生相应免疫反应，该免疫反应事实上是激活获得性免疫反应的关键前提。
实施例7 WR-4株(HSV减毒株)减毒活疫苗的免疫学保护效果观察
以(20+50+30)×2的实验设计形成WR-4治疗组和野毒株对照组，同时设置20只阴性 对照组，两个组均首先以野毒株(Mckrae株；2×104CCID50/每只小鼠)滴鼻感染，其中20只作为体重观察及生存率观察组，50只作为感染过程中病理及免疫反应观察组，30只作为后 期观察组。WR-4治疗组在野毒株感染后第3天开始给予WR-4毒株的接种治疗，每天一次肌 肉注射，连续三天，剂量为105CCID50/只/次，其中，20只部分从感染野毒株并给予WR-4治疗后开始观察，隔天记录其体重变化及死亡情况；50只部分在第1次治疗性注射后次日开始每间隔2天后处死5只，至22天处死完毕。对每一次处死动物做器官病毒载量检查，组织病理学观察，血液中IFN-γ含量检查，T细胞亚组比例观察。30只部分自野毒株感染并给予WR-4治疗后至感染后2个月，4个月及6个月每次处死10只小鼠,同时观察上述指标。所有 观察结果表明，WR-4作为治疗性疫苗的使用，可以明显降低野毒株感染的临床表现，小鼠 体重恢复时间明显缩短(附图16)，病死率显著下降(附图17)。在感染过程中，野毒株感染 所致的病毒在各组织中的载量可因WR-4治疗性免疫而出现具有统计学意义的下降(附图18、19、20)，而野毒株感染引起的组织病理损伤在WR-4治疗注射过程中亦有明显减轻(表2),这些治疗效果很可能与WR-4治疗注射所引起的干扰素水平上升(附图21)和T细胞群中 CD8+亚组比例上升相关(附图22)。更重要的是，在后期的观察中，WR-4治疗组也明显表 现出野毒株引起的临床症状的较快恢复，尤其是病毒在神经系统存留载量的降低和存留时间 的缩短(附图18、19、20)。这些结果提示，本发明构建的WR-4毒株，因其构建策略独特， 把四种影响及抑制宿主细胞的生理性应激-天然免疫反应系统的病毒功能基因加以综合的缺 失性突变，使得该毒株进入细胞后即激活了细胞应激系统—天然免疫反应系统，使细胞抗病毒的非特异性因素，如干扰素表达的大幅上升，同时又通过去除病毒对免疫递呈环节的抑制 策略，使得加强的天然免疫反应的上调进一步无障碍地促进特异性抗病毒免疫反应的形成， 这一系列策略，使病毒抑制免疫系统反应，侵犯神经形成潜伏感染的特性均被消除，其存留 的结构和功能蛋白则可以表现为一种特异性免疫刺激制剂的效应。因此，该效应可以针对 HSV1感染机体所引起的临床病理过程表现相应的治疗意义，并较明显地改变了HSV1感染 所引起的临床和病理表现，具有应用意义。
表2突变株WR-4针对HSV1感染给予治疗后各器官组织的病理学观察
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 威瑞生物科技（昆明）有限责任公司
<120> 一种HSV减毒株及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> DNA
<213> 人单纯疱疹病毒1型(Herpse simplex virus 1)
<400> 1
atgtctctgc gcgcagtctg gcatctgggg cttttgggaa gcctcgtggg ggctgttctt 60
gccgccaccc atcggggacc tgcggccaac actggaccca gttgtcgtat aa 112
<210> 2
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人单纯疱疹病毒1型(Herpse simplex virus 1)
<400> 2
ctactcgtcc cagaatttgg ccaggacgtc cttgtagaac gcgggtgggg gggcctgggt 60
ccgcaactgc tccagaaacc tgtcggcgat atcaggggcc gtgatatgcc gggtcacgat 120
agatcgcgcc aggttttcgt cgcggatgtc ctggtagata ggcaggcgtt tcagaagagt 180
ccacggcccc cgctccttgg ggccgataag cgatatgacg tacttaatgt agcggtgttc 240
caccagctcg gtgatggtca tgggatcggg gagccagtcc agggactctg gggcgtcgtg 300
gatgacgtgg cgtcgccggt tggccacata actgcggtgc tcttccagca gctgcgcgtt 360
cgggacctgg acgagctcgg gcggggtgag tatctccgag gaggacgacc tggggccggg 420
gtggcccccg gtaacgtccc ggggatccag ggggaggtcc tcgtcgtctt cgtatccgcc 480
ggcgatctgt tgggttagaa tttcggtcca cgagacgcgc gtctcggtgc cgccggcggc 540
cggcggcaga gggggcctgg tttccgtgga gcgcgagctg gtgtgttccc ggcggatggc 600
ccgccgggtc tgagagcgac tcgggggggt ccagtgacat tcgcgcagca catcctccac 660
ggaggcgtag gtgttattgg gatggaggtc ggtgtggcag cggacaaaga gggccaggaa 720
ctgggggtag ctcatcttaa agtactttag tatatcgcga cagttgatcg tgggaatgta 780
gcaggcgcta atatccaaca caatatcaca gcccatcaac aggaggtcag tgtccgtggt 840
gtacacgtac gcgaccgtgt tggtgtgata gaggttggcg caggcatcgt ccgcctccag 900
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caggatggcc ttggctccaa acacaaccgg ctccatacaa ttgaccccgc gatcggtaac 1140
gaagatgggg aaaagggact tttgggtaaa cacctttaat aagcgacaga ggcagtgtag 1200
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<212> DNA
<213> 人单纯疱疹病毒1型(Herpse simplex virus 1)
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<212> DNA
<213> 人单纯疱疹病毒1型(Herpse simplex virus 1)
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gactggccgg acagcccccc gcggcgccgg agccccccgc gacccccgcg acccccgcga 300
cccccgcgac ccccgcgacc cccgcgcggg tgcgcttctc gccccacgtc cgggtgcgcc 360
acctggtggt ctgggcctcg gccgcccgcc tggcgcgccg cggctcgtgg gcccgcgagc 420
gggccgaccg ggctcggttc cggcgccggg tggcggaggc cgaggcggtc atcgggccgt 480
gcctggggcc cgaggcccgt gcccgggccc tggcccgcgg agccggcccg gcgaactcgg 540
tctaacgtta cacccgaggc ggcctgggtc ttccgcggag ctcccgggag ctccgcacca 600
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