一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用
阅读说明：本技术 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用 (Salmonella bacteriophage capable of simultaneously cracking escherichia coli and application thereof ) 是由 杜新永 张得彦 李先胜 马如霞 王立坤 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003,保藏编号为CGMCC No.22494,对全基因进行测序后发现,不具有毒力基因和溶原性基因；本发明得到的噬菌体对宿主菌BS20078的裂解效率均在98.7％以上,单独使用时,对沙门氏菌的裂解能力相对较强,裂解谱较宽；而且噬菌体RDP-SA-21003对引起鸡气囊炎、腹膜炎的大肠杆菌具有裂解能力。(The invention discloses a salmonella phage RDP-SA-21003 capable of simultaneously cracking escherichia coli, the preservation number is CGMCC No.22494, and after sequencing of the whole gene, the salmonella phage RDP-SA-21003 does not have virulence genes and lysogenic genes; the cracking efficiency of the obtained phage on host bacteria BS20078 is over 98.7 percent, and when the phage is used alone, the cracking capacity on salmonella is relatively strong, and the cracking spectrum is wide; moreover, the bacteriophage RDP-SA-21003 has the capability of cracking Escherichia coli causing chicken airsacculitis and peritonitis.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella pullorum)属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，是沙门氏菌病的病原体。广泛存在于自然界中，迄今为止已经发现1000株左右。大多数脊椎动物体内均可分离到沙门氏菌，其主要寄生于人类和动物的肠道内。菌体大小为(0.6-0.9)×(1-3)μm，一般无芽孢，也无荚膜，多数有鞭毛，抗原结构和生化特性相对复杂。
沙门氏菌种类繁多，根据细菌表面的抗原所定义的抗原特性，已经描述了超过2500个肠道沙门氏菌血清型。由鸡白痢沙门氏菌造成的家禽感染是家禽养殖危害最大的细菌性疾病之一，能够引起家禽高发病率和死亡率。除此之外，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等都是家禽易感的沙门氏菌。沙门氏菌极易在养殖场中进行水平传播和垂直传播，所以净化家禽特别是种禽养殖中的沙门氏菌病能极大地提高养殖效益。
沙门氏菌属中有人类致病菌、兽类致病菌以及人兽致病菌。感染沙门氏菌后，一般会出现胃肠炎症、发热、腹泻以及败血症等临床症状。当前，世界范围内的食物中毒问题中就有沙门氏菌引起的食物中毒。沙门氏菌可以不通过宿主以直接或间接的方式在动物之间、人与动物、人与人之间传播，而其主要的传播途径就是消化道。动物在感染了沙门氏菌后，繁殖力会受到影响，生长受阻，甚至会病状加重，死亡率升高。
由于抗生素的不合理使用，引起了细菌多重耐药性、药物残留、食品安全、环境菌群不平衡等问题，严重威胁人类及动物的健康。因此，寻找新型抗菌药物及治疗方案已成为当前的研究重点。
在畜牧养殖等方面，使用抗生素免疫造成免疫失败，兽药残留问题威胁着人类的身体健康。面对这样的挑战，噬菌体疗法已广泛应用于医学、畜牧兽医、食品卫生等各个领域中致病菌的防控。在农作物种植方面，研究者尝试将噬菌体用于马铃薯、柑橘，商业化的噬菌体制剂在农作物中大规模使用。在食品工业中，其表面细菌生物膜形成是食品工厂的主要问题之一，而形成生物膜的细菌对恶劣的环境条件、抗生素和消毒剂具有很高的抵抗力，噬菌体有着良好的治疗效果。
噬菌体具有特异性强、毒副作用小等特点，展现了良好的杀菌作用，同时具有良好的生物安全性，在防控细菌感染方面具有巨大的潜力。
特点优势：(1)特异性强。噬菌体具有独特的杀菌机制和高度的宿主专一性，是广谱抗生素无法比拟的优势，以致病菌为宿主筛选的噬菌体，不会对人及动物体内的其他正常菌群造成威胁。(2)相较于抗生素，噬菌体不易产生耐药性。噬菌体具有很强的降解生物被膜的能力，而生物被膜增强了细菌对抗生素的抗性，可使用噬菌体消除生物被膜来裂解多重耐药菌。(3)安全性高。噬菌体由核酸和蛋白质组成，降解为氨基酸和核酸，分布广且易分离筛选，与抗生素不同，噬菌体是人和动物正常的共生体，摄入噬菌体是一种自然过程。大多数研究表明噬菌体治疗细菌性感染有很强的安全性。(4)噬菌体个体微小且增殖能力强。一个噬菌体感染一个细菌后，可产生100个左右的子代噬菌体，渗透药物无法穿透的区域，通过一种“自动给药”的现象来确定剂量，避免在治疗部位重复使用噬菌体，单次给药就可达到理想效果。(5)噬菌体分布广泛。噬菌体存在自然界的各个角落，包括土壤、河流、污水，凡是有细菌的场所就有相应噬菌体的存在。在健康人体和动物体内(胃肠道、口腔等)的正常菌群中也广泛存在。(6)易筛选易获得。筛选纯化新噬菌体周期短，几周或几个月。通过人工培养细菌，扩增并过滤除菌，纯化制备高价噬菌体即可获得。综上，噬菌体作为抗菌剂具有特异性强、安全性强、不易产生耐药性等优势。
噬菌体治疗细菌性疾病具有很多优势。例如起效快、2-4h就能杀死病原菌，缓解症状，改善养殖动物的精神状态；对养殖动物安全，噬菌体特异性强，只能杀死相对应的病原菌，对动物肠道有益微生物不会有副作用，因此不会破坏肠道菌群，而抗生素在杀灭病原菌的同时，会导致微生态失衡，引起机会性感染甚至更严重的全身性感染；环境友好，噬菌体是宿主依赖性的，只有在宿主存在时才会发生作用，随着宿主的死亡而死亡，不会在体内残留；防止细菌耐药性，噬菌体作用机制与抗生素不同，治疗效果不受细菌耐药性的影响，基本没有副作用，长期以来，噬菌体在人体、动物、食品中的应用已经有了悠久历史，具有良好的治疗效果。
本发明在于相应国家全面禁抗的号令，解决细菌耐药性，抗生素滥用的问题，从禽粪便中分离纯化出一株裂性沙门氏菌噬菌体，为禽沙门氏菌的防治提供更多的可能性。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用，旨在解决养殖场禽类因感染沙门氏菌，发病急而治疗不及时，且因致病菌耐药性而导致用药无效等问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体，透过电镜观察，该沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003头部为多面体立体对称，包裹着核酸，直径65-40nm，有一个长30nm的尾，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目短尾病毒科。经基因测序发现，不具有毒力基因和溶原基因，该噬菌体于2021年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22494。
进一步地，该噬菌体具有较广谱的杀灭沙门氏菌的能力，同时对大肠杆菌也有一定的裂解能力。
进一步地，该噬菌体对引起鸡气囊炎、腹膜炎的大肠杆菌具有裂解能力。
本发明的第二个目的是提供该沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的用途。
本发明的第三个目的是提供沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的药物中的用途。
本发明的第四个目的是提供沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的饲料中的用途。
本发明的第五个目的是提供一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，包括有效量的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。
本发明的第六个目的是提供一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，还包括用于抗沙门氏菌的抗生素。
本发明的第七个目的是提供一种预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。
本发明的第八个目的是提供一种清洁剂或消毒剂，其成分包括沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明发现并分离了一株禽沙门氏菌，并以该沙门氏菌为宿主分离得到了噬菌体RDP-SA-21003，该噬菌体RDP-SA-21003对养殖环境中禽沙门氏菌具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽沙门氏菌的防治提供了良好的噬菌体来源；
(2)在本发明中，噬菌体RDP-SA-21003经60℃处理60min，效价仅下降一个数量级，对温度有较好的耐受性；在pH6-9的条件下，37℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，效价仍保持在1011pfu/mL以上，对酸碱也有较好的耐受性；在稀释107倍，对病原菌仍有较好的裂解效果。
(3)本发明得到的噬菌体对宿主菌BS20078的裂解效率均在98.7％以上，单独使用时，对沙门氏菌的裂解能力相对较强，裂解谱较宽；而且噬菌体RDP-SA-21003对引起鸡气囊炎、腹膜炎的大肠杆菌具有裂解能力，此特性显示这株噬菌体具有很重要的研究价值，如全基因组测序统计分析，以研究相关裂解基因，对噬菌体裂解能力相关的分子改造具有重要的意义；
(4)本发明沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、LB培养基、氯游离水等。
(6)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003(Salmonella pullorum phage RDP-SA-21003)，可以有效杀灭鸡肉表面的沙门氏菌并防治鸡肉在保存过程中沙门氏菌的污染，可作为食品防护的各种产品的有效成分。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由沙门氏菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品；所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。
(7)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003(Salmonella pullorum phage RDP-SA-21003)，可用于制备组合物，试剂，或试剂盒；可应用于沙门氏菌的快速检测，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的沙门氏菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度；
(8)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可以单独或混合使用，用作为生物杀菌剂，饲料添加剂，或因沙门氏菌引起的细菌感染的治疗药物、保健品及医疗器械；沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可应用于治疗或预防由沙门氏菌引起的感染性疾病；可被沙门氏菌感染的寄主包括人类、家畜(猪、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭、鹅等)，以及各种兽类、鱼类、鼠类等；
(9)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可以应用于工业生产，可由宿主菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，具有极好的推广前景。本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所述沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003或其组合物制备成应用于医疗，检测，消毒及食品防护等方面的各种产品加以工业应用。产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。
附图说明
本发明上述的以及其它的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：
图1为本发明噬菌体RDP-SA-21003的电镜图；
图2为本发明噬菌体RDP-SA-21003的热稳定性试验示意图；
图3为本发明噬菌体RDP-SA-21003酸碱稳定性示意图；
图4为本发明噬菌体RDP-SA-21003的遗传稳定性试验示意图；
图5为本发明噬菌体RDP-SA-21003一步生长曲线示意图；
图6为本发明噬菌体RDP-SA-21003复溶稳定性试验示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明使用从青岛一养殖场病禽肝脏中分离得到的沙门氏菌BS20078，并通过实验确定了BS20078的致病性和耐药性，以BS-20078为宿主，从环境中分离得到一株沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003，并通过全基因组序列确定了RDP-SA-21003的基因型。
实施例1致病性沙门氏菌BS20078的分离及其鉴定
从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基(SS琼脂)上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL LB肉汤中，37℃200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性沙门氏菌，将其中一株命名为BS20078，保存于-80℃冰箱。
实施例2噬菌体RDP-SA-21003的分离及鉴定
粪便处理：从养殖场采取粪便，称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用。
制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用。
噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和沙门氏菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，观察结果。如果有噬菌体，那么平板上有透明斑。挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化3次，得到一种噬菌体，并将其命名为RDP-SA-21003。
RDP-SA-21003在双平板形成的噬菌斑直径在2mm-4mm。
将噬菌体增殖液与60％的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。
实施例3噬菌体的形态观察
取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图1所示。
由图1可知，噬菌体RDP-SA-21003有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约60nm，有一个长约30nm的尾，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，可将该噬菌体归类为有尾病毒目短尾病毒科。
实施例4噬菌体基因组测序
通过对单株噬菌体的富集培养后，在4℃条件下8000g离心15分钟，加入10％PEG8000和0.5M NaCl静置过夜，再加入等量氯仿混匀，静置分层后5000g下离心10min，去处氯仿层和PEG层后，加入限制性核酸内切酶消化处理，并采用梯度密度氯化铯条件下悬浮噬菌体，后期采用TM缓冲液透析3次，每次30min，一部分送华大基因生物测序公司进行全基因组测序。测序方法如下：
采用Illumina TruSeqTMNano DNA Sample Prep Kit方法构建文库；具体步骤为：
1)以1μg DNA起始量建库；
2)Covaris M220超声打断DNA到300-500bp；
3)补平3’端加A、连接index接头(TruSeqTMNano DNA Sample Prep Kit)；
4)文库富集，PCR扩增8个cycles；
5)2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；
6)TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；
7)cBot固相载体上进行桥式PCR扩增，生成clusters；
8)Illumina Hiseq测序平台，进行2×150bp测序。
该噬菌体基因组全长为39740bp，不具有毒力基因和溶原基因。
实施例5噬菌体热稳定性试验
将噬菌体原液分装到50毫升灭菌离心管中，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃和90℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍梯度稀释后，铺双平板测定其效价。结果如图2所示。
由图2可知，随温度的升高和时间的延长，噬菌体效价逐渐下降，在60℃条件下处理30min和60min，噬菌体效价仅下降1个数量级，仍维持在1010pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的耐高温性能。
实施例6噬菌体pH稳定性的测定
用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1*1012pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板测定效价。37℃倒置培养4-6h后统计结果。结果如图3所示。
由图3可知，在pH5-9的条件下，37℃培养1h后，其效价仅基本不变，效价仍保持在1011pfu/mL以上，说明RDP-SA-21003有较好的耐酸碱性能。
实施例7：稳定性遗传实验
将RDP-SA-21003连续传代29次，每代培养基中加入等量的RDP-SA-21003和BS20078，每代培养时间6h，然后铺双平板，测定其效价；结果如图4所示。
由图4可知，将RDP-SA-21003连续传29代后，测定其效价，其效价稳定在1011pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。
实施例8噬菌体生长曲线的绘制
取对数生长期的沙门氏菌菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌BS20078和噬菌体RDP-SA-21003，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃200r/min的摇床中振荡培养并计时。定时取样测定其效价，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图5所示。
由图5可知，噬菌体感染宿主菌后的20min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约20min，感染后30-90min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为60min。通过计算，噬菌体裂解量约为245PFU/感染细胞，表明噬菌体RDP-SA-21003具有潜伏期短、裂解力强和高复制的特点。
实施例9RTD实验
在平板上划分区域，将一滴宿主菌(约100μL)滴加到区域中心处，晾干，将不同稀释度的一滴噬菌体液滴加到宿主菌的斑点上，晾干，37℃培养16-24h。根据宿主菌生长状况，凡是不能连片生长的，称为CL浓度(CL浓度是可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度，可以用于指导生产实践的稀释方案)。结果发现RDP-SA-21003在稀释107倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。
实施例10最佳感染复数的测定
按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。结果由表1所示。
表1最佳感染复数试验
由表1可知，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-SA-21003的最佳感染复数为0.1。
实施例11沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003对部分沙门氏菌及大肠杆菌的裂解谱实验
分别取沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003，大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031、沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032原液，采用滴定法测定噬菌体裂解谱，分别取16株实验室分离到的沙门氏菌、大肠杆菌，制成菌悬液，并经过生化鉴定及血清学鉴定，确定血清型，备用。
取上述各沙门氏菌菌悬液200ul与半固体琼脂混合后倒入琼脂板中，冷却，凝固后，取10ul沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003滴于平板上，自然干燥后，37℃培养6-8h，观察结果。
取上述各大肠杆菌菌悬液200ul与半固体琼脂混合后倒入琼脂板中凝固后，分别取10ul沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003、大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031、沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032滴于平板中不同位置，自然干燥后，37℃培养6-8h，观察结果。结果如表2所示。
表2裂解谱对比试验
注1：++为透亮+为一般透亮--为不裂解。
注2：其中作为对比的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031，沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032均已公开，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.21406，CGMCC No.21994。
由表2可知，沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003对于沙门氏菌裂解率可达到75％，对于大肠杆菌的裂解率可达到50％，作为对比大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031对于大肠杆菌的裂解率达到62.5％，而沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032对于大肠杆菌的裂解率为0％，说明沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003不但对沙门氏菌具有高裂解率，对于大肠杆菌也有很好的裂解作用且与大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031的裂解率接近，而沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032对大肠杆菌无裂解作用。
实施例12：噬菌体RDP-SA-21003对于鸡沙门氏菌及大肠杆菌的治疗效果
选取14日龄健康小鸡250只，设置沙门氏菌攻毒组和大肠杆菌攻毒组，各选取100只分别进行攻毒，攻毒成功后，各选取其中50只分别进行饲喂沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003连续饲喂3天，各组剩余50只分别作为阳性对照，未攻毒的50只作为阴性对照，每天观察死亡情况并记录。结果如表3所示。
表3
结果显示，经过饲喂沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003的两组死亡率较低，说明噬菌体RDP-SA-21003对于大肠杆菌病和沙门氏菌病均具有治疗作用。
实施例13噬菌体的工业化生产工艺
1.种子制备
(1)宿主种子制备：无菌环境下挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，将培养后的宿主菌以5％的接种量接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，再以5％的接种量接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，150rpm培养4-6h，培养好的宿主菌种子置于4℃冰箱备用。
(2)噬菌体种子制备:将保存的噬菌体种子适当稀释后，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，37℃，培8-12h，选取噬菌斑呈现云雾状的平板，用5mL的LB液体培养基洗下上层培养基，然后12000rpm，10min离心，过0.22μm的滤膜，收集清液。
清液与宿主分别以2％的比例接种于5mL的LB培养基，37℃，200rpm培养4-8h(培养至增殖液变澄清或者出现絮状物为止)，将培养好的噬菌体和宿主各以2％的接种量同时接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，再将培养好的噬菌体和宿主各以2％的接种量同时接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，培养好的噬菌体种子置于4℃冰箱备用。
2.噬菌体增殖：
将制备好的宿主菌以3％的比例接种于种子发酵罐中，培养3-4h后，OD600值在0.7-0.9，将宿主菌通过移种管道接种于发酵罐，接种量为5％，宿主在种子罐中培养3-4h，OD在0.7-0.9时以5％的接种量接入噬菌体，培养6-8h，待溶氧反升，pH趋于稳定，结束增值。
注：发酵罐参数：种子罐200-300rpm，37℃，通气1:0.6-0.8vvm。发酵罐：120-150pm，37℃，通气1：0.6-0.8vvm。
培养基成分：酵母浸粉2.5％，甘油0.3％，氯化钠0.8％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钙20ppm，氯化镁20ppm。
3.噬菌体后处理工艺
(1)离心：将增殖完成的噬菌体，用管式离心机离心，14000rpm，流速≤30L/H，去除未裂解的宿主和细菌碎片等。
(2)采用400nm的中空纤维膜进一步过滤除菌。
(3)采用100KD的卷式膜进行浓缩。
(4)过滤除菌：浓缩后的噬菌体采用三级过滤(聚丙烯0.45μm，双层聚丙烯0.2μm，聚醚砜0.22μm)除菌。
4、噬菌体低温喷雾干燥
将过滤除菌后的噬菌体液体(效价3.3*1011pfu/ml)加入载体并搅拌均匀，载体：8％多空淀粉，2％聚乙烯吡咯烷酮，1％乳糖，0.5％改性壳聚糖，0.2％维生素C。然后进行温喷雾干燥，参数：进风口温度150℃，出风口温度75℃。
缓冲液溶解后，铺双平板，37℃培养，噬菌体效价可达到1011pfu/g，且，由图6可以看出，噬菌体喷干粉复溶后4℃放置72小时效价仍稳定，表明该噬菌体可以耐受较高的温度，可以采用常规喷雾干燥塔进行生产，提高生产效率，降低生产成本。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
序列表
<110> 瑞科盟（青岛）生物工程有限公司
<120> 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39740
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ttgatattaa agttccagcc tttagcttgg acctgacgat tgacacgatg caggatacgt 60
tgagcgttag agacgtcagc gtttccttcg tcaagctgta ggactgctgg ttcgccaata 120
gctgctaaca tatcgttgat ggcgtctaag tcatcgttag cattcagtgg aatgtattga 180
gccataagtc tcctctcact ttaagcaaaa aacccctcaa gcacccgaag gcacccaagg 240
ggtttcaatt agttgttgga ctcagccagt ttagcggccc tgttcgcagc acgagtacgc 300
gcagctttct gttgaggagt tagagtctcc tcttcaggtt cggccgctac tgtagcgacg 360
ttaggttggc taaaggtgct tacgccgctg ggctgaaaac cagtgcgcca gccgcttcag 420
gacgcagacc accgtgaccc atagcgtatt taccaacaat caggtcaccc tgagcatcga 480
cgtcacggtc acgttccagc gccaagtcac gcagcttcac agtacccaca gcagaacggt 540
gagagaacag acccacaacg ttgtccatag caactttaac gtcgccagta gcagttgccg 600
ggaatgcgtg tttctgaccg gaagcgatag agatgccatc agcaccacga gtctcaccag 660
cgccaccctg taccagatgc ggaacttcaa caacaacgaa gcccatcacg ttacggatgt 720
taccagtctc tgggtcaatc agcgcagcat agttagcagc gttcggcatc agagccgcga 780
ggattgcaga gtagttgtcc ggcgtggtgt agaagtaacg gtcgccagca ggaacgtagt 840
tggaggtcag cttcgcacga gcaatggtca gttgaccaat gattgcttca cccagtttag 900
caggggtatc gaggtcagct ttcttaccaa cttccagtac ggacgcagta cccagaccag 960
cgatgttctc gttggatgca gccgggaggt tacacaggat agccatttca gccagaaccg 1020
caccatcagc agcgatagcc agagcttcac ccaactggtt ggagtattcg cctgccacgt 1080
catagtggtt catcgcatct tcaatgtcga aaatcatcac atcggcagtc agcagaccgt 1140
caatggtaat cactttctcg gtatgtttga tacctttacg cttatcggac agtcgctcac 1200
ccggagccag atacacacca gaggtgcgac ccatgaccgg gaactgagca gacttaccgt 1260
tctgaattgt tcggacaata tgcttgtcag cagttacaga gcggcgagtg aatgcggtca 1320
ggacttcacc agcaaagacc ttcaggaaca acgctagagc gtcggaactg gatttgcctt 1380
taccttggtc tgtaccaatt ttctgacccg gaacgtttgc catatgataa ttctcctatt 1440
caattgaaag ataaagttta ttacttactg tatgcccaat ccgtatggac tgaagtaatg 1500
gggaaacctt tgagtctttc tcttggtctc cctatagtga tagtttagtc ctacaggctt 1560
gaggcagcta ccttagcgcg aacttccatc gtgtacttag cgtcacgcag gtatcgcggg 1620
tcactcatag ccttaatcat gtcagccttg gagctgaatg cttcggtctg aggagcctta 1680
ggtgcgacca caggtttagc ctgagtggtt atggtacgct ggggtttaac acccacagct 1740
ttacaaagag tcttgccagc cagattcagc agagccttgg tagtcgcaat gtccttacga 1800
acgatagcag cttccagtgc ctcacgagtt gacgggtcgt tggactcaag gtgtgacagg 1860
atgcgattaa actgttccgc accaccagca tagcgaacca caccagcagc atactgttca 1920
gccagagctt cctgcccacg tacaaacgaa tctacgaaac gcttggtgta acctgcttcc 1980
tgcaacttag cgtaggatgc gtcagacagc ttacagtcct tggcgtattc agccttgata 2040
gcggtaattt catcagcagt gaccttgcct gcttctacag cagaagacac catgtcatcg 2100
aatgcagctt cgttttcatc cagagcggtg acactttcgg tcagctcttt cggtgcatca 2160
cccagttcga tgaactcagg ctgctcacca tctgtctcag actcttcgtc atctgactcg 2220
tggtcttctt caccttcagt ctcttcgacg ttctcgtctt cttcggtcgc ctcctcgttt 2280
tcggcttcca gttgattgaa ggtaatagca tcatcgccat cacgaacagc tacgtcctgt 2340
tcaagcatag acttctggtg ttcgttcagg tcctcaacgg aaccagtgat tgcattagag 2400
ctaacgccga actcggcata aactgattga gacattgagt cattctcctt taagtcgtta 2460
ataggtaaac acctacttgc agtgtgggac taacggctac catatggtcg gcttagtcgc 2520
tcttactttc ggtgttccta tagtgatagt ttaggcttga gccatgtcct cgccagctcc 2580
ctgacctaca gcagcaccca tgttagcacc agcagcagac gcaccgttga ccacagctcc 2640
ttgagcggat tgttcagcaa tacgttgcat cttctcgtcc tgagtaagca gaagaccagc 2700
agtgtcaatg cctaaggcat tcagcagtcg cagcttaagg gtcggcaagt tgatgtcagg 2760
gtcctgagag agctgctgaa gaccagtcat catgttaacc gcctgagtta gcttctccaa 2820
gtcctgacca cgacctaacg cttccagacc agtggagaca gtaggctcta ccgcttcttt 2880
cggaaggtca ggaatcattc cagcagactg aagttggttc atcagcacac ggacgatagg 2940
taactgaagc tcttgtgact gcactgagta cacgccacct aaggtcgcct ccagttcgcc 3000
agcaacataa cgaatctctt cagcagtgac tcgctcggca ttacgctgaa cagcgctatt 3060
aagaaggaag gcccagccta aacgttgctc gatagcgtca gccaccgact tggcaatcgt 3120
aaagtcctga cctttcgtca gttgcaggaa gttgatgtcc tcgacgcgac cagccacgaa 3180
ctcacctgta gccgccttgt tcagacgacg aggttgcgtg ataccgttcg ggttaacgag 3240
gcccaccacc ttggaggcta ccttagccat tttggtgata gcttctgtaa tcgtctccag 3300
cgagttcagg tctcccagat actcctcgca ataagaacga ccatagtctt caccgtccag 3360
tcgaaccatt cgtaccggga tgtatggaca tgcagtcagt gggtaggaac catcggtccc 3420
tgctacctca atgccttcca cttcctcgta gcgcagatac tcgtcgtcct gacggtagat 3480
gtgcgtatac acttccagct cggtgtcagg ctcatagtcg tctgcgttga gttgggactt 3540
aacgtcttcc ggtagagcac taaacgctac cttgtcgaga gtcacaatct gcaagatgtt 3600
accgaaagca tcacgttgaa caacgtagga cactaagcgg tacattcgca taggactgta 3660
agtaccctgt tcaggctctg gaatgtagag cagacagtta cctgagacga taagctgctt 3720
cagggcctcg aacaatggga cacggaaact gttagtctcc atgtaggcca tcaacacacg 3780
ctcgaccata gccagccctt cgtcaacacg ggcagccgcc tctgagtcct gactcaaggt 3840
cttggcctca tattctgaga ctgttagtcg catccacggt gactgaggaa ataatgccaa 3900
catcagcttt gcagccaagt tgttcaaaca gcgagcaccc acagcttgcc acggcgtcac 3960
gtattccgta gatgagttgt cggactcctt aggaaatagc gatgggatgg tcacggcagc 4020
gcagttctgt gcgcgggtct cgtaaggctg tcgtccgttc ttcaatctat cataaactga 4080
cttcgcgcct tcagcagcaa atccttcacg ttcagccatc tacgtgcctc catgttttac 4140
cttggcgaac acgcaaaact gtagacttgc taacgcctag ctcacgagcc agtgttgtac 4200
aacctacggt tgacttgcgg atttctcgaa caaggtcttc tgttaaaacc gataaccctt 4260
ggtcttcacc tctagccatt ttggttttat tgatgcgacc acgctttgag gcgtcctgca 4320
tgttatcacg ctgagttcct aactctaagt ggtttacgtt gaaacacgct ggattatcac 4380
acttatgacg gacgagcatt ccgtctggta ttggcccatg cgcatcggcg taagcgagtc 4440
ggtgcatata cactaactta ccgtctatac gcttctgccc atatcctgct gaggatttgg 4500
cccacttcca ctcgatgcac ccggtcaaat agagatgccc ccaccagagg tacgagagac 4560
ctgaaggcta cgcttaccgg aacgcttaac tttcttctcg tcagatgcag tcacttcggt 4620
atccacatct tcaattttgt cgttcggtac ttccactggt gctgccggtg ctgcaggcgc 4680
tggggtctga gcctcaacaa ccttaggtgc atcgttagct ccaagaccaa ctgtccctaa 4740
cgcacctttt actactttct tgaaagcctt actgattgat ttacccacga ttaatctcct 4800
tgttcgtgct aacgcacttg gttgttacga tgtctaccga cccagaaaca tgcttgacac 4860
gagaatacca gccaagaccc caacgcttgc actcttcgtc tatgatgtgt ctgacagtct 4920
caagaacctt gcgggaggac tgcgagtcac gacgaatagc gacgattgaa aggtcaagac 4980
cgggagtcgg tcggtgccaa gatgcggtag ccagcatgta gagatacgct actggttgac 5040
ctgagacatc gtagattgtg tactcttcac cgtcgaactc gtcagccata cggtaagtat 5100
gagccttgaa gtcctcgaat gacttgaagt tagactgccc gtcttcccag aggcgacaag 5160
cgcacatgtg gcgaccttcg tgtgagttga gatatggtag cattgtctta ccccatgttg 5220
acgccagagg ctcgcatagc gcggctaact gacgatttat ctttaggtgc agactccttc 5280
ttgaccttca ggtctttgat acctttggtc tcgttggtgt ccacatcaga ttcagccccg 5340
atgtcaactg acgcaacttc ctcactcaga ggcgctggtt caggtgctcg ttcaagtgct 5400
tggaccgaag gcttcggagt gctaatcttt ggactgaaac acatagtccc tcctacagtt 5460
aatcgaactg aacggtatct ttcagctcac gacgcgtagc aaccgcagag tcgagagtgt 5520
cagagcaata ctggagaccc ttgatgaacc cggcaatgaa cgcatcgctg tagccctgct 5580
gcttgaggag actgatagcg cccatcttct cagcgtagct tgcgttgaac aatacgtgca 5640
ggaactggat ggcagactgg gagatgttag ggacatcgag tctttcttcc tgtaactgct 5700
taacaacgtt ttcaatagca ttaatagcca tcttgaatct cctctttaag ttaagactaa 5760
agtctatctt atagtcatat cttaggtcct aaagtcccta tagtgatagt ttagtgtttc 5820
acctatggat gactgttggg ttgataggat atgactatcg gttagactca gtgtttagga 5880
cggttgttcg acccgaacca cttgtacatg cagtaaaggg ccagaagtcc ggcccagtaa 5940
attacatgga tggtgtccac aggatgacct ccttggactt agggtcatag tcagaggctc 6000
gacaaatacg agcgacctga gcttggacca gaagttcctc ctcggtcatc ccagctttag 6060
cagccagagt caccatgcag tcccacaacg tcatgtcttc acgcttcgga tacttcttcc 6120
attcggtctt aatctggcct ttgttcttgc cagtcttaag ctcacggctc tcctgcacga 6180
agtagtacgg ctcgtcaagg aacgcacgag tggtgtcctc acccattccc ggaatgccac 6240
cgtagccatc tgtagtatca cccttgatgg tctgctccat gtgccagtag tctgcctcgg 6300
cagtcgtatg actcagaatt tcaccagtgg ttaaccagaa gaactcacag ttcgggatgg 6360
tcttgaagtc cttatcacag gacaccagca ccgcatgatc acatccgaca atctgaggtc 6420
gggtccctat gatacccata cagtcatcac cctcaagcgt aggacgcagg aagctgttga 6480
accgtgggtc agccatcact tcggctacga acttcttgta acctacaggc ttgcgagaac 6540
ctttacggtt ggccttatag gtaggcagga cgtccttacg ccagttgtaa tcgtcagtga 6600
agcacatcac aatcttagcg tctttccacg ccttgcgctt cttaacgatt tcagagatgg 6660
tgttctcaag gatacgacga gccttggcat ggtcgcagat aagggtataa atatcatcac 6720
cccaatctgt ctcgtcctca gcagcagcca tagatgaaaa cactaagtag tcaccatcta 6780
acacaagagc tattttcttt tcgctcacag gcagcctccg tgttggttca ggaactttgt 6840
gccagaagcg gtaatctccc acgcaccgtt gttgcgccca tccatagaca ggcagcttag 6900
atgtccacga ctcgcagcct cagccacaag tgcagcgttg ttgcgcacat agtttgactg 6960
gaaggtcttc gggcaggact taagggccgc taggacccgt aagtattcac tcattgcttg 7020
aaccccactc gtatacgttt agtaatatcc atcaatgaca ctctttccac gttggtccaa 7080
tcttaccttc ggtatcaagg acacatttaa agttatagaa ctcacccacc ttacgcatag 7140
caagctgagc aatcttgacg acttcttcgg caatctcctg agtacgacat gcaatctgca 7200
attcgtcgtg cacccatgcc atgtacgcga agtctccttc ccagccgtgt acatacccgg 7260
cctcttcaag catacgttca gtctcaacaa tccagtgttt acagaccact gcaccatcac 7320
cttgtagtaa ggcgttaagt gctgagtgcg gtgaccggat gtgaatgcgg cgaccgtcca 7380
gacctttcaa ccatcgacgt ttccacttca cgatgttctc accatctacc cacttagagt 7440
ctgagattaa cgtattactc acagcttccc tgaggtcctt gatggctggt gtaccctcaa 7500
tgaatttctt catgagagct gaaccttcct tcttaccacc gccgactatc agtccaatct 7560
tagctgcccc tgcaccatac aggaacgcat agatgaacgt cttagagttg ttacggaaag 7620
cctcatggtc gtggttagac ttatcgcgtg ggacgttagg tgctaaccca gcgtttactg 7680
cgttggccca gtggatgtca ccttcgacca cagtctgcgc ataggcacca ccatcaaacg 7740
gagcagctcg gttccccaga cagcgaagct caagaccaga agcatctaca cccacttgaa 7800
tccaagggtc tggcttaccg tccttcttgt tccacgctgc accgaaagca ccacggcagg 7860
tctcaccata tggagcaccg ttagccggga cttgagccat gtttggtgaa ctatgggtcg 7920
cacgtccggt tactgccccg catgggttga ttgaaccgtg catacgtccg tctggaccta 7980
caagtttcaa ccatgcgttc ttaccttcag ccgcctgacc gatgcgcttc tggactacca 8040
gatactcacg gaccagctct acgcaagcct gagcctctgc gtctggtaac ttaacgtgtt 8100
ctaacgtctc gtcatcgact acaggtttcc ctgtgtcagt gaagtccaca ggctcccagc 8160
cacgctccat cagaactttc gctaagtggt ctccgcttcc aggattaaac tcaacgtaag 8220
tgattggcgt gaatggtgct ccttccatcg tgtctcgtga gtcgaactcg caaggcttca 8280
gacctaagcg ttgagctttg ttcttcggct tcttgaatac tgacccgacc ttaggataca 8340
cgactctcgg atacttcgga aggtcctttc ctgtccgtgg atgcttgaag aactccttgc 8400
ctccttttgg tgcgtaccag ctaccgaaag tcgaacgcag cttgtccaga agctctgcac 8460
gtttgacggt gagttcacga tataagcctt cgaccatctc ggtgttcatc ggatagccat 8520
tacgttcaat cttcgcacag gtccacgcag catcatgttc cagacgcaac gcataaatct 8580
ggtcgaaagc gaactgttca gactggaagt aatacttgtc agtcaggaac ttcttgaaca 8640
acgccagtgt gaccacaacg tcttgaacgt tatagtcaag catctcctga gacgggaaca 8700
accattcgtc cccagcctta tattcgatac cttcagcctt gcacttggca acgtaatcgt 8760
gtttgtactc acctttcatc tcaccgagac gataacccca agcctcaaga gactgacgac 8820
ccatcatatt aggcggcaga cgaccagctt tcaccgcgct catgtctgag aacttaatgt 8880
ttggatacat caagcgacca agtaccaagg tatcaataat tcgaccctta ttcacattta 8940
ggttcttacc aaagtatttc ttcttcagta ttttcaaggc tggtatatca tagttcacac 9000
cattgtgcag aaccagcata ccgtcagtgg atgccataat agattctatg cggtctatgt 9060
actctttgaa tccacctgtc agcccagtca taggggcaac accatatttc tcagtagcct 9120
gagttccagc gttaatgata acaccacaat ggaactgtga cacagtgtct agtagaccgt 9180
cagtctctat atctgtgcca tagaatgagt tgagattaaa cattatattt ctccaagtac 9240
gttatagcag ccctaagcac ggctaccttg tcaccgaact taccaagtgc gctattacat 9300
gtaccacata gcaatcccct aacaatacct gagtcatggc aatggtcaac gtgggctaca 9360
ttattcttac tctcaataga cccatgcttg aagataatgt ctgagcatat agcgcatctg 9420
cccttttgac tatcgaacat agtgtcatat tcctcaagtg tgagaccata ggctttctta 9480
agccaagact tacgggcaga taggcgatgc gcctcaccgg cctctgtacc tttgtttcga 9540
tgatatcgcg acctattatc ctcacgaaca caagatatgc accacccatt tgtcttcctg 9600
aactcagtgg actcctttgt agagccacat ctactgcaag tcctcatatt gcttctcctt 9660
tagttataag tctaatcata aaggccactc gctgtgaatg accttgagtc tagacctaga 9720
agtctgtacg caagaagtgg tacataaact tccggttagc tttcttccat gccttagagt 9780
cgaacctttg gtctcccaga atgttagaca ggcaggttgc ttcatcgctc caccatttgt 9840
acatgaaccg atggtagcga gctttaagtt ttcttagcaa tgtactcctc cttagaagtc 9900
ggtatcttcc cacgagccgc tatcctcttc tccgctgctg ccagtgaagc taattggttc 9960
aagccacccg gtcgtcttgt tgtattcgag gtatcctgcc actccagtgt cacccgtaaa 10020
acgacacttg agcagacgaa gttgaacaat attaggagta tcaccttgct ggtttcgctc 10080
aagggcaata atagtatcag acagttgacg gagagcacca gaaccacgta ggtcagtgat 10140
tgaaacaggt cgtccttctt catgcgattt acctttctcc gggttcttca ggtggcatat 10200
gaccacgaca accacaccct tcgtcttcgc aaacttcttg agacgagtca tgatgcggtc 10260
aatggtctta cgttcatctg agttatcttc catgccagac acaacgattg agatgtggtc 10320
cagcagtatg acgtcacagt cgagaccgtc caccatgtat gctaacttag cgaacaaggt 10380
gtcttcctct gactctgcga atgaatcgta caggtggaac ttatcgtctc cgaacagctt 10440
gtcataccat tcgtcaaacc gtccatcctc taatatggct tgcttcagtt ccttgctctg 10500
tcgtagacgg acgttattgt ccagacccat aaggtcctga actgtttcct ctacagcctc 10560
ttcaagcata gccataccca cacgcttacc tcctctgccc cactctaaga ggagctgacg 10620
gacgaaggta gacttaccca tgcctgaccc tgaagtcacc atgataagct caccagctcg 10680
cgcacctaat gtcatcgcgt tgagtgttgt gcatgacgag aacatgagac cttcagtctc 10740
tgccttaagc attgcctccc gtgtgcggtc cttcagactt gccgctgata ccacaccagc 10800
cggtacgaaa ggtttagcgt tccagatagc atcggtgatg gccttgaagt ccttcgcctg 10860
aagtgcagcg ttggcgtctt tgtacccgtt gatgaacgca accttaaccc gacctgctgg 10920
taagactggt gctgcatcct caatggcctg acgacccggt tcatccatgt cgaacatcaa 10980
gattatctct tcgaactggt cgagatactc aaggttcgca gccatagctt tcttcgcaga 11040
cttggagcct aacggaagcg agaccacagg atacttaccg tcctgcacct gagccacaga 11100
cagagcgtct atctcaccct cggtgatgac tatcttctta ccaccgttcc agagctgaga 11160
gccaaacagc atgtcagact tgacgctacc gatagccgtg aagttcttct cagcgtctcg 11220
gactttctgc cctaccttgg tcccggacct gtcgtaataa tccgccacct gaaccatctt 11280
gccacccatg ttacccaccc agtagctgta cttcttgcat atctccatgc ttagactacg 11340
ggctggtagt gggacatatc gtccagcgtt ctcaccgaac gttaacagat tgctcacttg 11400
ctttctacct cctgagggtg tgtatccctc ggtcaactcc atgtctcctt tcttccatgc 11460
gactgaaggg tcacatgcaa aacaaaattg atggccgtct gagtaaacac cattggcatc 11520
cgaggaccca cagtctggac actgggtgtg atacagaaat acactctcgt cgccttggtc 11580
atcgtatgac attggtcact ccttaatcac aaatgcgaac aaagggacag gactaattgt 11640
cccaccccta aggtgatagt ttaggctttg aagaactgag ccagctggtc agctttggtg 11700
tcagcttgac gagccttcat gccagcttcc agtgacgcga tggtcagctt gtcagccaga 11760
gcagcagcat cagccgcacc atcagcagtc ttcttttcta cctttcgttc cataaccgca 11820
tcacgacgat aaccacgcac caccagacga ccaagaaatt cgataagttt aatcactgag 11880
ttgttctcct ttggaattta ttaaccgtgg tcggaagtga ccagttcgtt ggtagtcaac 11940
cagcgttgca agtcgaaact tggacacgcc ttcggtgcta tgtcatggtg tgctttgatt 12000
tctgcctgag gatacaggac cttcaggtca tccagcttgt tgcgaaggga gttcatctgg 12060
gctggagtga agttagcttc aaactgaccc ttagcgttga ccccacctac aaggcagacg 12120
cctacggacc gtgagttcca atccttaacg tgtgacccta cgacattgac cggtcgaccc 12180
tcttccacag tgccatcacg cttgatgata aagtggtagc caattgccag ccagccctgt 12240
tgtttatgcc acatctcaat ggtctcacga ccaatgtcca tagtcggcgg tgtcgctgaa 12300
cagtggacga agattgcgtc tgtagcttga cgtggtttga attgtacctt actccccatc 12360
gtacaccacc agctctacag ctactaggtt cagatgtcgt tggaaacggt tagcatccgt 12420
ggtgtgcatc tggagcaact tatggttgaa gacgtgagag ttgctaatct tcacgtacac 12480
ttcgtcaggc ttaccgtgga cgatgaacgt ctgacctaca ccaatcttgt tgatggtcag 12540
gacttcacgt ttaacggtaa caggtgggac gcttgaggct ggcaggactt gaggtttatc 12600
ctctaagatt tcctcaagat attcatttaa aacccatgcc ccccacattc cgtcaggctg 12660
agtgttataa cctttcgctc cgtgcttgaa gagtccacgc tcggaggatt ccaccagagt 12720
catttctaac cccggatgcg ggtctttctt acattttgta acgatagtgc ctgcaggcca 12780
ccctgcgcgc atagccttaa gtctatattt ctgagtcatc acttaactcc tttcttcttg 12840
ggaatgagta taccagaagg cagacgtaca gtcgcctctc tcagccactc aaccgggatg 12900
aacttatcgg catacttata gccgttcttt tcgcaccatg cgccatacgt ggtcggagac 12960
cctttgtata acttggagcg ggaactggag aacacgaacc gaatgtctaa ctctgggtgc 13020
tgttctcgta ccagaaggtg cttcttacgg tcatcactat cgaagatacc tttggtctcc 13080
acgatgatac cgttaggaag gataaaatct ggtgtgtact tgtggtcgga agccggaatc 13140
acatagttga tataatggct ttcgtactcc gctttgacgc cgttctgttc cagccactgc 13200
tggtttttgg cttcaagtcc agagcggtag gcacccacag agtgcccccg ttttgcagac 13260
cattgggcca ttagaagtcg taatcgccac cagagttaga gtcgtcacca ccttcggaac 13320
catcgtcacc aaagtcatca gactcgaagt caccatcggt tgacgctttg tagccagtac 13380
cgaggtcttc atcatcaccc cagccaccat ctccaccagc gccatcacct ttccattcct 13440
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