一种靶向pd-l1的pet分子探针及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种靶向pd-l1的pet分子探针及其制备方法与应用 (PET molecular probe targeting PD-L1 and preparation method and application thereof ) 是由 周明 胡硕 张现忠 王晓博 陈蓓 饶婉倩 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种靶向PD-L1的PET分子探针及其制备方法与应用,属于核医学与放射性药物领域。本发明提供一种靶向PD-L1的PET分子探针及其制备方法和应用,并且实现了在多个动物肿瘤模型中的高特异性,高灵敏度显像。本发明制备获得的靶向PD-L1的PET分子探针在临床人体水平也得到了进一步验证,可以较好的对PD-L1高表达的肺癌患者中PD-L1的表达水平进行无创活体显像,有望为PD-L1患者的早期无创筛查已经免疫治疗过程中PD-L1表达水平的监测提供新的显像手段。(The invention provides a PET molecular probe targeting PD-L1, a preparation method and application thereof, and belongs to the field of nuclear medicine and radiopharmaceuticals. The invention provides a PET molecular probe targeting PD-L1, a preparation method and application thereof, and realizes high-specificity and high-sensitivity imaging in a plurality of animal tumor models. The PET molecular probe targeting PD-L1 prepared by the invention is further verified in clinical human body level, can better carry out noninvasive living body imaging on the expression level of PD-L1 in a lung cancer patient with high expression of PD-L1, and is expected to provide a new imaging means for monitoring the PD-L1 expression level in the early noninvasive screening of the PD-L1 patient in the immunotherapy process.)
技术领域
本发明属于核医学与放射性药物领域，尤其涉及一种靶向PD-L1的PET分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗已然成为继手术治疗、放射治疗和化疗药物治疗之后的第四大肿瘤治疗疗法，也是目前最热门的肿瘤治疗手段。例如，针对PD-1/PD-L1信号通路的免疫疗法在临床肿瘤患者的治疗中取得了巨大成功，并因此获得了2018年度诺贝尔医学奖。然而，并不是所有肿瘤患者都对该治疗有响应；且由于其作用机制不同，与既往的治疗手段相比，肿瘤的治疗反应模式多样，如出现延迟应答、假性进展、超进展、免疫相关不良事件等现象，对临床治疗决策和疗效评价带来了困难与挑战。研究表明，PD-1/PD-L1免疫治疗效果不仅依赖于PD-L1的表达水平，而且还与PD-L1在治疗过程中的实时动态变化密切相关。因此，实时精准检测免疫检查点PD-L1的表达及动态变化显得至关重要。传统的穿刺病理活检和免疫组化受限于有创操作、肿瘤异质性导致结果失真等原因难以实时精准监测免疫检查点PD-L1的动态变化；CT、MRI和超声是基于肿瘤形态变化的结构影像技术，无法在分子水平上反应PD-L1的表达及动态变化。因此，临床迫切需要一种新型的检测方法来实现对PD-L1表达的无创、动态和精确监测。
正电子发射断层扫描(PET)由于其具有高分辨率、高灵敏度等优点，可以从整体上直观且无创性地监测及评估肿瘤免疫检查点表达水平，提供更精确、实时、全面的信息，避免了病理切片及治疗手段对机体免疫检查点表达水平的影响，为筛选免疫检查点免疫治疗有疗效响应的患者、优化肿瘤抗免疫检查点治疗方案、评估预后提供准确依据。分子探针是制约PET分子影像的关键，开发靶向PD-L1的放射性分子探针是当前核医学和放射性药物领域研究的重点之一，也是本领域研究人员亟需解决的关键技术难题。
发明内容
本发明实施例的首要目的在于提供一种靶向PD-L1的PET分子探针，实现对PD-L1表达的无创、动态和精确监测。
本发明实施例的另一目的在于提供上述靶向PD-L1的PET分子探针的制备方法。
本发明实施例的再一目的在于提供上述分子探针在PD-L1PET显像中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种靶向PD-L1的PET分子探针，所述分子探针的结构式如式I下：
当所述的靶向PD-L1的PET分子探针记名为68Ga-NOTA-NF12；
当所述的靶向PD-L1的PET分子探针记名为18F-AIF-NOTA-NF12。
其中，所述的68Ga-NOTA-NF12具体的制备步骤如下：
(1)取25-30μg标记前体化合物NOTA-NF12，加入1mL 0.25M NaOAc水溶液，混匀，获得NOTA-NF12溶液；
(2)用4mL 0.05M HCl将68Ga淋洗至NOTA-NF12溶液中，放射性活度约为10-50mCi，90℃，反应10min；
(3)加入去离子水淬灭反应，获得反应体系；
(4)将步骤(3)的反应体系过C18Plus柱进行富集，并用去离子水清洗C18Plus柱；
(5)依次用1mL乙醇和10mL生理盐水将产物淋洗至装有滤膜产品瓶中，获得靶向PD-L1的PET分子探针68Ga-NOTA-NF12。
进一步地，步骤(5)中获得的68Ga-NOTA-NF12的放射性活度为20-26mCi。
进一步地，步骤(3)中淬灭反应所用去离子水的用量为10mL。
进一步地，步骤(4)中去离子水清洗的用量为10mL。
其中，所述的18F-AIF-NOTA-NF12具体的制备步骤如下：
1)采用回旋加速器生产18F并经过管道传输至阴离子交换柱QMA进行捕获，用N2将QMA吹干；其中生产的获得的18F的放射性活度为250-300mCi；
2)反应管中提前加入300ug AIF-NOTA-NF12，1.0ml乙腈和0.03ml 0.4M A1C13溶液和0.5mLpH＝4.0的醋酸缓冲液；
3)0.3mL0.9％NaCl将步骤1)中获得的18F淋洗至反应管中，得放射性活度为200-250mCi，110℃，反应10min；
4)加入5mL去离子水，HPLC纯化收集产物峰，放射性活度为80-120mci；
5)产品溶液过C18Plus柱进行富集，然后依次用2mL乙醇和10mL生理盐水进行淋洗，并将淋洗液过无菌过滤膜，获得靶向PD-L1的PET分子探针18F-AIF-NOTA-NF12。
进一步地，步骤1)中所述回旋加速器优选为GE公司Qilin回旋加速器。
进一步地，步骤1)中所述的阴离子交换柱QMA为QMA^READI-CLINGTM型柱。
进一步地，步骤5)中获得的18F-AIF-NOTA-NF12的放射性活度为50-60mCi。
上述的靶向PD-L1的PET分子探针在PD-L1免疫诊疗试剂盒中应用。
上述的靶向PD-L1的PET分子探针在制备肿瘤PET显像剂中的应用。
上述的靶向PD-L1的PET分子探针在肿瘤PET显像中的应用。
本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明解决的技术问题在于提供一种68Ga或者18F-AIF标记的多肽类靶向PD-L1的PET分子探针及其制备方法，并且实现了在多个动物肿瘤模型中(B16黑色素瘤、PANC02胰腺癌、MC38结肠癌、TNBC三阴乳腺癌肿瘤以及H1975肺腺癌等)的高特异性，高灵敏度显像。
2.本发明制备获得的靶向PD-L1的PET分子探针在临床人体水平也得到了进一步验证，可以较好的对PD-L1高表达的肺癌患者中PD-L1的表达水平进行无创活体显像，有望为PD-L1患者的早期无创筛查已经免疫治疗过程中PD-L1表达水平的监测提供新的显像手段。
附图说明
图1为本发明实施例1中的68Ga-NOTA-NF12放射化学纯度HPLC结果图。
图2为本发明实施例2中的18F-AIF-NOTA-NF12与标准品19F-AIF-NOTA-NF12放射化学纯度HPLC结果图。
图3为本发明检测实施例1中B16肿瘤模型鼠尾静脉注射68Ga-NOTA-NF12和18F-AIF-NOTA-NF12B16模型显像图。
图4为本发明检测实施例1中18F-AIF-NOTA-NF12B16在PANC02胰腺癌、MC38结肠癌、TNBC三阴乳腺癌肿瘤以及H1975肺腺癌肿瘤模型中显像图。
图5为本发明检测实施例2中18F-AIF-NOTA-NF12在肺腺癌患者中的显像图，其中，A为肿瘤部位。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种靶向PD-L1的PET分子探针以及制备方法与应用，旨在解决为PD-L1患者的早期无创筛查提供检测探针的问题。
实施例1
本实施例提供一种靶向PD-L1的PET分子探针，所述分子探针的结构式如式I下：
本实施例1中所述的靶向PD-L1的PET分子探针记名为68Ga-NOTA-NF12。
上述68Ga-NOTA-NF12具体的制备步骤如下：
(1)含有标记前体化合物NOTA-NF12(25-30μg)的EP管中加入1mL0.25MNaOAc水溶液，混匀，获得NOTA-NF12溶液；
(2)NOTA-NF12溶液转移至20mL反应管中；用4mL0.05MHCl将68Ga淋洗至反应管中，放射性活度约为10-50mCi，90℃，反应10min；
(3)加入10mL去离子水淬灭反应，获得反应体系；
(4)将步骤(3)的反应体系过C18Plus柱进行富集，并用10mL去离子水清洗C18Plus柱；
(5)依次用1mL乙醇和10mL生理盐水将产物淋洗至装有滤膜产品瓶中，形成靶向PD-L1的PET分子探针68Ga-NOTA-NF12,放射性活度约为20-26mCi。
获得的靶向PD-L1的PET分子探针68Ga-NOTA-NF12为产品注射液，在PD-L1免疫诊疗试剂盒中应用。
如图1所示，制备获得的靶向PD-L1的PET分子探针68Ga-NOTA-NF12产品注射液进行HPLC纯度分析：流动相A为含0.1％TFA的蒸馏水，流动相B为含0.1％TFA的乙腈，色谱柱为ZORBAXSB-C18；洗脱方式为梯度洗脱(0-2mim：5％乙腈；2-15min：90％乙腈)，产品出峰时间为7.3min左右，纯度95％-99％。
实施例2
本实施例提供一种靶向PD-L1的PET分子探针，所述分子探针的结构式如式I下：
本实施例2中所述的靶向PD-L1的PET分子探针记名为18F-AIF-NOTA-NF12。
上述的18F-AIF-NOTA-NF12具体的制备步骤如下：
1)采用GE公司Qilin回旋加速器生产18F(250-300mCi)并经过管道传输至阴离子交换柱QMA(QMA^READI-CLINGTM型柱)进行捕获，用N2将QMA吹干；
2)反应管中提前加入300ug AIF-NOTA-NF12,1.0ml乙腈和0.03ml 0.4M A1C13溶液和0.5mL pH＝4.0的醋酸缓冲液；
3)0.3mL 0.9％NaCl将18F淋洗至反应管淋洗至反应管中，得发射性活度为200-250mCi，110℃，反应10min；
4)加入5mL去离子水，HPLC纯化收集产物峰(80-120mci)；
5)产品溶液过C18Plus柱进行富集，然后依次用2mL乙醇和10mL生理盐水进行淋洗，并将淋洗液过无菌过滤膜，得到靶向PD-L1的PET分子探针(18F-A1F-NF12)，其活度为50-60mCi。
获得的靶向PD-L1的PET分子探针18F-AIF-NOTA-NF12为最终显像剂注射液，在PD-L1免疫诊疗试剂盒中应用。
制备获得的靶向PD-L1的PET分子探针18F-AIF-NOTA-NF12产品注射液进行HPLC纯度分析；分析条件为：高效液相色谱法(ZORBAX SB-C18,4.6x250mm,5.0μm)流动相为20％乙腈溶液，流速为2.0mL/min，检测器为放射检测器。采用标准品19F-AIF-NOTA-NF12作为参照，检测结果如图2所示。
检测实施例1：动物模型的构建和检测：
1.取50只小鼠，分别构建皮下黑色素瘤B16模型，PANC02胰腺癌、MC38结肠癌、TNBC三阴乳腺癌肿瘤以及H1975肺腺癌肿瘤大小为0.5cm左右时作为模型鼠备用；
2.通过上述实施例1和实施例2方法制备放射性标记制备68Ga-NOTA-NF12和18F-AIF-NOTA-NF12；
3.B16肿瘤模型鼠尾静脉注射68Ga-NOTA-NF12和18F-AIF-NOTA-NF12(0.1-0.2mCi)(结果图如图3所示)，其余模型均注射18F-AIF-NOTA-NF12(0.1-0.2mCi)(结果图如图4所示)；
4.30min后进行小动物PET/CT显像；
5.数据分析获取肿瘤部位的SUV值，其中68Ga-NOTA-NF12探针肿瘤摄取SUV值为7.1±1.3，18F-AIF-NOTA-NF12探针肿瘤摄取SUV值为7.3±1.1。
检测实施例2：肺腺癌患者显像方法和结果
受检者仰卧于PET/CT检查床，静脉注射18F-AIF-NOTA-NF124.44MBq/kg后，分别于5、15、30、45、60、75、90min，分别进行PET/CT静态扫描，先进行CT扫描，扫描范围及顺序为脑部-盆腔，然后立即进行PET采集，采集范围同CT，采集顺序为盆腔-脑部，共8个床位，每个床位15.7cm，每个床位间重叠3.7cm，PET采集方法采用3D-TOF序列，CT扫描管电压为120kV、自动mAs、螺距为0.984:1、矩阵512*512，PET矩阵256*256，CT及PET层厚均为3.75mm。PET图像重建均用有序子集最大期望值迭代(OSEM)法，得到三维图像及横断、冠状、矢状断层图像。将PET和CT图像传到GEAW4.6后处理工作站，进行帧对帧图像对位融合，在健康志愿者脑、肺、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、肾实质、膀胱、肌肉及骨髓等处分别勾画感兴趣区(ROI)的放射性摄取，取ROI区内放射性计数平均值即平均SUV值，所有ROI测量3次取平均值，计算标准摄取值(standard uptake value，SUV)，根据公式SUV＝病灶的放射性浓度(kBq/ml)/注射剂量(MBq)/体重(kg)，由AW4.6后处理工作站完成。显像结果如图5显示，注射药物30min左右，肿瘤病灶部位有较高的佘曲志，SUV值大约为3.3，具有较高的靶本比值，图中A为肿瘤部位。
本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
1.本发明解决的技术问题在于提供一种68Ga或者18F-AIF标记的多肽类靶向PD-L1的PET分子探针及其制备方法，并且实现了在多个动物肿瘤模型中(B16黑色素瘤、PANC02胰腺癌、MC38结肠癌、TNBC三阴乳腺癌肿瘤以及H1975肺腺癌等)的高特异性，高灵敏度显像。
2.本发明制备获得的靶向PD-L1的PET分子探针在临床人体水平也得到了进一步验证，可以较好的对PD-L1高表达的肺癌患者中PD-L1的表达水平进行无创活体显像，有望为PD-L1患者的早期无创筛查已经免疫治疗过程中PD-L1表达水平的监测提供新的显像手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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