具体实施方式

本发明提供了一种镥标记的纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦混合后进行反应，将反应产物纯化、冻干后溶于四氢呋喃中，得到A溶液；

(2)将DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液混合得到B溶液；

(3)将PCPDTBT溶于四氢呋喃，得到C溶液；

(4)将A溶液、B溶液、C溶液混合，在水中进行超声自组装，通氮气，过柱，超滤后，得到DOTA-SPN-GIP，加水得到DOTA-SPN-GIP溶液；

(5)将步骤(4)得到的DOTA-SPN-GIP溶液、¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、醋酸钠溶液混合后反应，将反应产物加入PBS或者生理盐水后超滤即可得到镥标记的纳米载体(¹⁷⁷Lu-SPN-GIP)。

在本发明中，所述步骤(1)中，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的质量比为8～12∶1～3∶13～15；优选为9～11∶2∶14；进一步优选为10∶2∶14；

在本发明中，所述步骤(1)在反应前，将葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦分别调节pH＝7.2～7.6后再混合进行反应；优选为调节pH＝7.3～7.5；更优选为调节pH＝7.4；

在本发明中，所述步骤(1)中反应为在室温震荡10～14h；优选为11～13h；更优选为12h；

在本发明中，所述步骤(1)中葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的总质量与四氢呋喃的体积比为1.6～3.6g∶130～170L；优选为2.0～3.2g∶140～160L；进一步优选为2.4～2.8g∶145～155L；更优选为2.6g∶150L。

在本发明中，所述步骤(2)中DOTA-NHS在二甲基亚砜中与NH₂-PEG₄₅-DSPE在二甲基亚砜中的浓度均为8～12g/L；优选为9～11g/L；进一步优选为10g/L；

所述混合为在室温震荡1.5～2.5h；优选为1.7～2.3h；进一步优选为1.9～2.1h；更优选为2h；

DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液的体积比为3～5∶24～28；优选为4∶25～27；进一步优选为4∶26。

在本发明中，所述步骤(3)中PCPDTBT与四氢呋喃的质量体积比为1～2g∶1～2L；优选为1g∶1L。

在本发明中，所述步骤(4)中加水量为A溶液、B溶液、C溶液总体积的3～5倍；优选为4倍；

超声频率≥20KHz；自组装时间为12～18min；优选为13～17min；进一步优选为14～16min；更优选为15min。

在本发明中，所述步骤(4)中，A溶液、B溶液、C溶液体积比为130～170∶25～35∶40～60；优选为140～160∶27～33∶44～56；进一步优选为145～155∶29～31∶48～52；更优选为150∶30∶50；

通氮气后，通过PD10凝胶柱，接特定区段的中间产物，然后进行超滤；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为1mg时，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第4～5mL；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为2Nmg，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第(3N+1)～(3+2)NmL；

DOTA-SPN-GIP与水的体积比为3～7∶10；优选为4～6∶10；进一步优选为5∶10。

在本发明中，所述步骤(5)中，所述¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液的放射量为148～185MBq；优选为158～175MBq；进一步优选为162～171MBq；更优选为165MBq；

¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、DOTA-SPN-GIP溶液与醋酸钠溶液的体积比为3～5∶4～6∶0.5～1.5；优选为4∶5∶0.7～1.3；进一步优选为4∶5∶0.9～1.1；更优选为4∶5∶1；

所述醋酸钠溶液的浓度为0.15～0.35M；优选为0.20～0.30M；进一步优选为0.25M；

所述反应为在室温震荡25～35min；优选为27～33min；进一步优选为29～31min；更优选为30min。

在本发明中，所述步骤(5)中，反应产物与加入的PBS或者生理盐水的体积比为1∶3～5；优选为1∶4。

在本发明中，所述步骤(1)中所述纯化为超滤，参数设置为4000～6000转/min，25～35min，超滤5～8次；优选为参数设置为4500～5500转/min，27～33min，超滤6～7次；进一步优选为4800～5200转/min，29～31min，超滤7次；更优选为5000转/min，30min，超滤7次；

所述步骤(4)和(5)中超滤参数设置均为3000～4000转/min，4～6min，超滤1～3次；优选为参数设置3300～3700转/min，5min，超滤2次；进一步优选为3400～3600转/min，5min，超滤2次；更优选为3500转/min，5min，超滤2次。

本发明还提供了所述镥标记的纳米载体的制备方法制备得到的镥标记的纳米载体。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实验用到的仪器和试剂

自配试剂

(1)0.05MHCl30％HCl264μL加超纯水稀释为50mL体积。

(2)0.25M醋酸钠(NaOAc)称取1.025g无水醋酸钠粉末溶于50mL超纯水中，超声溶解。

实施例1

一种镥标记的纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)在反应前，将葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦分别调节pH＝7.2，然后将三者混合后进行室温震荡10h，将反应产物超滤(参数设置为4000转/min，25min，超滤5次)、冻干后溶于四氢呋喃中，得到A溶液；

其中，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的质量比为8∶1∶13；葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的总质量与四氢呋喃的体积比为1.6g∶130L；

(2)将DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液混合，室温震荡1.5h得到B溶液；

其中，DOTA-NHS在二甲基亚砜中与NH₂-PEG₄₅-DSPE在二甲基亚砜中的浓度均为8g/L；DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液的体积比为3∶24；

(3)将PCPDTBT溶于四氢呋喃，得到C溶液；

其中，PCPDTBT与四氢呋喃的质量体积比为1g∶2L

(4)将A溶液、B溶液、C溶液混合，在水中进行超声(超声频率≥20KHz)自组装12min，通氮气，过PD10凝胶柱，接特定区段的中间产物，然后进行超滤(超滤参数设置均为3000转/min，4min，超滤1次)，得到DOTA-SPN-GIP，加水得到DOTA-SPN-GIP溶液；

其中，加水量为A溶液、B溶液、C溶液总体积的3～5倍；A溶液、B溶液、C溶液体积比为130∶25∶40；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为1mg时，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第4～5mL；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为2Nmg，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第(3N+1)～(3+2)NmL；DOTA-SPN-GIP与水的体积比为3∶10；

(5)将步骤(4)得到的DOTA-SPN-GIP溶液、148MBq的¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、0.15M醋酸钠溶液混合后室温震荡25min，将反应产物加入PBS或者生理盐水后超滤(超滤参数设置均为3000转/min，4min，超滤1次)即可得到镥标记的纳米载体；

其中，¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、DOTA-SPN-GIP溶液与醋酸钠溶液的体积比为3∶4∶0.5；反应产物与加入的PBS或者生理盐水的体积比为1∶3。

实施例2

一种镥标记的纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)在反应前，将葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦分别调节pH＝7.6，然后将三者混合后进行室温震荡14h，将反应产物超滤(参数设置为6000转/min，35min，超滤8次)、冻干后溶于四氢呋喃中，得到A溶液；

其中，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的质量比为12∶3∶15；葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的总质量与四氢呋喃的体积比为3.6g∶170L；

(2)将DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液混合，室温震荡2.5h得到B溶液；

其中，DOTA-NHS在二甲基亚砜中与NH₂-PEG₄₅-DSPE在二甲基亚砜中的浓度均为12g/L；DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液的体积比为5∶28；

(3)将PCPDTBT溶于四氢呋喃，得到C溶液；

其中，PCPDTBT与四氢呋喃的质量体积比为2g∶1L

(4)将A溶液、B溶液、C溶液混合，在水中进行超声(超声频率≥20KHz)自组装18min，通氮气，过PD10凝胶柱，接特定区段的中间产物，然后进行超滤(超滤参数设置均为4000转/min，6min，超滤1～3次)，得到DOTA-SPN-GIP，加水得到DOTA-SPN-GIP溶液；

其中，加水量为A溶液、B溶液、C溶液总体积的5倍；A溶液、B溶液、C溶液体积比为170∶35∶60；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为1mg时，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第5mL；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为2Nmg，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第(3N+1)～(3+2)NmL；DOTA-SPN-GIP与水的体积比为7∶10；

(5)将步骤(4)得到的DOTA-SPN-GIP溶液、185MBq的¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、0.35M醋酸钠溶液混合后室温震荡35min，将反应产物加入PBS或者生理盐水后超滤(超滤参数设置均为4000转/min，6min，超滤3次)即可得到镥标记的纳米载体；

其中，¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、DOTA-SPN-GIP溶液与醋酸钠溶液的体积比为5∶6∶1.5；反应产物与加入的PBS或者生理盐水的体积比为1∶5。

实施例3

一种镥标记的纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)在反应前，将葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦分别调节pH＝7.4，然后将三者混合后进行室温震荡10～14h，将反应产物超滤(参数设置为5000转/min，30min，超滤7次)、冻干后溶于四氢呋喃中，得到A溶液；

其中，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的质量比为10∶2∶14；葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、Mal-PEG₁₂-DSPE和三(2-羧乙基)膦的总质量与四氢呋喃的体积比为2.6g∶150L；

(2)将DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液混合，室温震荡2h得到B溶液；

其中，DOTA-NHS在二甲基亚砜中与NH₂-PEG₄₅-DSPE在二甲基亚砜中的浓度均为10g/L；DOTA-NHS的二甲基亚砜溶液和NH₂-PEG₄₅-DSPE的二甲基亚砜溶液的体积比为4∶26；

(3)将PCPDTBT溶于四氢呋喃，得到C溶液；

其中，PCPDTBT与四氢呋喃的质量体积比为1g∶1L

(4)将A溶液、B溶液、C溶液混合，在水中进行超声(超声频率≥20KHz)自组装15min，通氮气，过PD10凝胶柱，接特定区段的中间产物，然后进行超滤(超滤参数设置均为3500转/min，5min，超滤2次)，得到DOTA-SPN-GIP，加水得到DOTA-SPN-GIP溶液；

其中，加水量为A溶液、B溶液、C溶液总体积的4倍；A溶液、B溶液、C溶液体积比为150∶30∶50；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为1mg时，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第4～5mL；

当所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽的使用量为2Nmg，所述中间产物为PD10凝胶柱流出的第(3N+1)～(3+2)NmL；DOTA-SPN-GIP与水的体积比为5∶10；

(5)将步骤(4)得到的DOTA-SPN-GIP溶液、165MBq的¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、0.25M醋酸钠溶液混合后室温震荡30min，将反应产物加入PBS或者生理盐水后超滤(超滤参数设置均为3500转/min，5min，超滤2次)即可得到镥标记的纳米载体；

其中，¹⁷⁷LuCl₃/HCl溶液、DOTA-SPN-GIP溶液与醋酸钠溶液的体积比为4∶5∶1；反应产物与加入的PBS或者生理盐水的体积比为1∶4。

实施例4¹⁷⁷Lu-SPN-GIP放射纯度分析(以实施例3得到的镥标记的纳米载体作为实验对象，下同)

(1)用PBS作为洗脱剂在100K超滤管中离心纯化镥标记的纳米载体；

(2)收集超滤管上层溶液作为标记产物；

(3)将硅胶板剪成1×10cm长的纸条状，并在1cm处用铅笔画横线标注；

(4)将收集标记产物用毛细吸管点样于1cm处正中横线中，以超纯水为展开剂(1mL)，待展开至8cm处取出自然晾干。

(5)将晾干的硅胶纸条用纸轻裹好(防止污染TCL)装样测量分析。

(6)将标记纯化后的¹⁷⁷Lu-SPN-GIP分别置于生理盐水NS及10％FBS中，不同时间点(0.5h、4h、24h、48h)后测放射性化学纯度。

结果：(1)¹⁷⁷Lu-SPN-GIP的标记率与放化纯

¹⁷⁷LuCl₃标记半导体聚合物通过HCl-NaOAc缓冲体系调pH值4～5之间，在常温下反应半小时，标记率为86.36±6.12％，虽然较加热的标记方法标记率有所下降，但避免了半导体聚合物纳米颗粒的破坏。通过几种展开剂的比较，纯水为最为合适的展开剂，能完全将游离¹⁷⁷Lu分开，而标记的¹⁷⁷Lu-SPN-GIP全部留在原点。其具体结果如图1和图2所示(放化纯分析；图1：游离¹⁷⁷LuCl₃以水为展开剂TLC结果；图2：¹⁷⁷Lu-SPN-GIP以水为展开剂TLC结果)。

(2)¹⁷⁷Lu-SPN-GIP标记物稳定性分析

将标记纯化后的¹⁷⁷Lu-SPN-GIP分别置于PBS及10％FBS中，分别于0.5h、4h、24h、48h后测放射性化学纯度。24h后¹⁷⁷Lu-SPN-GIP在体外放化纯为95.52±1.67％，体内放化纯为89.46±2.24％(P＝0.0198)；48h后体外放化纯为89.78±0.75％，体内放化纯为84.22±2.60％(P＝0.0235)。说明标记的¹⁷⁷Lu-SPN-GIP在48h内具有良好的体内外稳定性，其具体结果如图3所示(¹⁷⁷Lu-SPN-GIP体内外稳定性分析)。

实施例5¹⁷⁷Lu-SPN-GIP对CFPAC-1细胞生长抑制效应实验

(1)取对数生长期CFPAC-1细胞，胰酶消化调整成5×10⁴个/mL，铺96孔板，每孔100μL，细胞浓度为5×10³个/每孔，在37℃，5％CO₂培养箱中过夜；

(2)给每组细胞换液，加入规定剂量培养液100μL，各剂量浓度为0、0.37、3.7、7.4、11.1、14.8、18.5MBq/mL；24小时后更换正常培养基继续培养；

(3)分别在更换正常培养基后的0小时、24小时、48小时、72小时、96小时加10μLCCK8溶液(10％)，继续培养箱中培养1小时；

(4)1小时后用酶标仪测量各孔450nm处吸光值。再根据测得的OD值计算细胞相对存活率。细胞活力＝(加材料组-空白)/(对照组-空白)×100％。

结果：通过加入¹⁷⁷Lu-SPN-GIP共同孵育24小时后更换正常培养基继续培养，可以观察到24小时内细胞并没有显示出生长抑制效应，但是随着时间的累积生长抑制效应逐渐显示出来，而且呈剂量依赖性。同时和游离组¹⁷⁷LuCl₃相比，¹⁷⁷Lu-SPN-GIP表现出更卓越的生长抑制效果，其具体结果如图4(CFPAC-1细胞在不同剂量的¹⁷⁷Lu-SPN-GIP中不同时间后存活率)和图5(CFPAC-1细胞在¹⁷⁷Lu-SPN-GIP及¹⁷⁷LuCl₃中96小时后细胞存活率)所示。

实施例6

1、CFPAC-1细胞对¹⁷⁷Lu-SPN-GIP的结合实验

(1)细胞长至90％以上用0.25％胰酶消化细胞，调整细胞浓度为

1×10⁵/mL，铺12孔板，每孔加入培养基1mL。在37℃，5％CO₂培养箱中过夜。

(2)次日细胞完全贴壁后更换加有¹⁷⁷Lu-SPN-GIP和¹⁷⁷LuCl₃的培养基(37kBq/mL)，每组设3个复孔。

(3)将加入放射性标记药物的培养基分别与CFPAC-1细胞作用1小时，2小时、4小时、8小时及24小时后用移液枪吸取上清液至EP管中(对应编号)，并用PBS清洗两次后用胰酶完全消化孔底细胞，并用PBS清洗全部收集于对应管中。测量总的放射性计数T。

(4)将EP管离心1500转10分钟后弃上清，并用PBS清洗两次细胞沉淀，去上清，测细胞沉淀计数B。

(5)不同时间点细胞结合率为B/T×100％。

2、用共聚焦显微镜观察CFPAC-1细胞对DOTA-SPN-GIP的摄取情况

(1)取处于对数生长期的CFPAC-1细胞用0.25％胰酶消化后调整细胞浓度并铺板。铺直径10mm共聚焦皿，10⁵个/孔，放置于37℃，5％CO₂培养箱中24小时。

(2)24小时后细胞贴壁再分别加25μg/mL的DOTA-SPN-GIP，对照组(不加)，共同培养1h、2h、4h、8h，每个时间点做两个单独实验。

(3)不同时间点作用完成后用4％多聚甲醛固定30分钟。

(4)然后用PBS清洗三次，每次5分钟。

(5)用Hoechst33342(1:2000)室温避光孵育5分钟，PBS清洗三次，保存于湿润的避光盒中。

(6)分别选用635nm及Hoechst33342通道激发并观察细胞摄取情况。

结果：在此部分工作中主要研究CFPAC-1细胞在¹⁷⁷Lu-SPN-GIP中摄取情况，通过细胞结合的放射性核素的放射性计数来反应结合率，同时也通过共聚焦显微镜来直观地观察证实摄取情况，其具体摄取结果如图6(CFPAC-1细胞在¹⁷⁷Lu-SPN-GIP中摄取情况)和图7(CFPAC-1细胞摄取SPN-GIP在不同时间点的摄取情况)所示：

通过DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-四乙酸)表面修饰半导体聚合物，易于核素镥177的标记，该方法合成方便，在常温条件下即可稳定高效率标记。标记方法简单易行，标记合成的¹⁷⁷Lu-SPN-GIP在体内外具有良好的体内外稳定性。标记后的¹⁷⁷Lu-SPN-GIP比游离的¹⁷⁷LuCl₃在细胞层面具有更为优异的抑制细胞活性作用。¹⁷⁷Lu-SPN-GIP对肿瘤细胞的抑制作用不仅呈放射活度剂量依赖性，而且呈时间依赖性，孵育24小时后，随着观察的周期越长，抑制作用越明显。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。