用于癌症成像和放疗的组合物和方法

文档序号：1776179 发布日期：2019-12-03 浏览：24次 >En<

阅读说明：本技术 用于癌症成像和放疗的组合物和方法 (Composition and method for cancer imaging and radiotherapy ) 是由塞德里克·马利塞帕斯卡利娜·勒科尔谢乔纳森·诺瓦克马里恩·大卫贾马尔·铁姆萨曼尼于 2018-01-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种偶联化合物,其包含可药用的标志物M和具有至多30个氨基酸残基并且能够结合低密度脂蛋白受体(LDLR)的肽或假肽P,还涉及所述偶联化合物在通过向对象给药所述偶联化合物并分析标志物的存在和/或量而标记和/或检测和/或治疗对象中的癌细胞的方法中的用途。(The present invention relates to a kind of coupling compounds, it includes pharmaceutical marker M and at most 30 amino acid residues and can in conjunction with LDL receptor (LDLR) peptide or false peptide P, further relate to the coupling compound by the presence and/or amount that the coupling compound and analysis mark object are administered to object mark and/or detect and/or treatment object in cancer cell method in purposes.)

用于癌症成像和放疗的组合物和方法

技术领域

本发明涉及用于癌症成像、检测和放疗的组合物和方法。具体来说，本发明涉及包含靶向LDLR的肽和可药用标志物的偶联化合物，及其用于标记、检测、分期或治疗癌症、特别是过表达低密度脂蛋白受体(LDLR)的癌症的用途。

背景技术

癌症是全世界发病和死亡的主导原因之一，根据英国癌症研究中心(CancerResearch UK)和WHO，在2012年有大约1400万新增病例和820万例癌症相关的死亡。

尽管许多形式的癌症现在可以治疗，但它们中的一些仍然难以治疗。例如，胰腺癌仍然是最致命的癌症之一，第一年内的死亡率为75％，5年存活率仅为6％。每年在法国有约12,000人被诊断为患有胰腺癌，在全世界这一数字为约340,000。预计到2030年，这种癌症将变成第二大癌症死因。胰腺癌影响50岁以上的男性和女性两者，并且特别难以治疗。同样地，多形性成胶质细胞瘤(GBM)这种最常见且最具攻击性的恶性原发性脑部肿瘤，是一种尽管致命但罕见的疾病。在欧盟每年诊断出约25,000新增病例(www.pubcan.org/cancer)。它仍然是重要的临床挑战，因为它对当前的治疗响应不良。事实上，目前5年后存活率约为3％，并且尽管我们在肿瘤病理发生的基础了解方面取得显著进展，但在过去的25年中患者的总存活期中位数仅仅增加了3.3个月(从11.3个月到14.6个月)(Patel MA等，2014Sep29；6(4):1953-85)。

如果实现早期诊断，则可以避免在癌症中观察到的大多数死亡。考虑到各种不同癌症的5年存活率随着诊断时的肿瘤期急剧下降，对开发能够在可能的最早时间识别肿瘤的非侵入性成像工具和鉴定可能对治疗性干预响应的患者，存在着迫切需求。通过开发有效的成像和治疗剂，可以极大地改善癌症死亡率和发病率。

已做出大量努力以开发用于癌症的早期和准确诊断的新方法。各种不同的成像技术投入使用，包括正电子发射断层扫描(PET扫描)、单光子计算机断层扫描(SPECT)、X-射线计算机断层扫描(CT扫描)、核扫描、超声和磁共振成像(MRI)。尽管这些成像技术非常成熟，但它们大多数依赖于被分析器官的非特异性、宏观和生理学变化。到目前为止在肿瘤学中最广泛使用的PET示踪剂是¹⁸F-FDG，这是一种测量葡萄糖利用的探针和用于癌症诊断和分期的已确立的工具。然而，¹⁸F-FDG具有重要的限制，包括在某些肿瘤(例如***)中的较低摄入和在某些正常组织(例如脑)中的高背景摄入。

基于选择性受体靶向肽的药剂，由于它们的独特性质例如对它们的靶的高亲和性和特异性，在过表达相应肽受体的肿瘤细胞的分子成像中引起了相当多的关注。事实上，靶向在肿瘤中高表达的受体将提供更好的癌症诊断，因为所述靶向受体的肽将区分病理与正常组织。

关于癌症治疗，许多方法已被单独或组合使用，例如化疗、免疫疗法或放射疗法。

放射疗法(也被称为放疗、X-射线疗法或辐照)是基于使用电离辐射来杀死癌细胞并缩减肿瘤。它在广泛种类的肿瘤上用于治愈性和缓解性迹象两者。放射疗法的效果被集中并限制到待治疗的区域。放射疗法在待治疗的区域(“靶组织”)中通过损坏遗传物质引起损伤或破坏细胞，使得这些细胞不可能继续生长和***。尽管辐射损伤癌细胞和正常细胞两者，但大多数正常细胞可以从放射的效果恢复并正常发挥作用。放射疗法的目的是损坏尽可能多的癌细胞，同时有限地损害附近的正常组织。电离辐射通过损坏癌组织的DNA起作用，导致细胞死亡。

存在几种类型的放射疗法，包括：

-外放射疗法(EBRT)，其是最常见的放疗形式。患者坐或躺在沙发上，并将外部电离辐射源指向身体的特定部位。X-射线和电子束是外放射疗法的最广泛使用的源。

-近距放射疗法，其中将密封的放射源置于需要治疗的区域内部或附近。

-开放源放射疗法(或开放源放射性核素疗法)，其使用被称为放射性药物(本质上是放射活性药物)的固态、液态、气态或其他形式的放射活性物质。将它们通过各种不同手段(主要是注射或摄食)引入到体内，并根据它们的性质和给药途径集中到特定位置、器官或组织。这包括任何物质，从简单化合物例如碘化钠，其通过捕获碘离子集中到甲状腺，到复杂的生物药物例如重组抗体，其被附连到放射性核素并寻找细胞表面上的特异性抗原。这种技术是基于放射性药物的物理、化学和生物学性质来靶向身体区域，以备放射治疗。

放疗表现出几种副作用。副作用的本质、严重性和持续时间取决于接受辐射的器官、所述治疗本身(辐射的类型、剂量、分次、同时进行的化疗)和患者的状态。有急性副作用(恶心、呕吐、肠道不适、肿胀、不育……)和后期副作用(纤维化、脱发、干燥、心脏病、认知下降……)。因此，对开发引起较少副作用的靶向放疗，存在着需求。

肽受体放射性核素疗法(PRRT)是一种分子疗法(也被称为放射性同位素疗法)，被用于治疗某些癌症例如神经内分泌癌。在PRRT中，将细胞靶向蛋白(或肽)与少量放射活性材料或放射性核素组合，产生被称为放射性肽的特殊类型的放射性药物。当注入到患者的血流中时，这种放射性肽移动并结合到特定肿瘤细胞，向癌组织递送高剂量辐射，同时保护正常组织。

在有效的成像和靶向药剂领域中存在着明显未满足的医学需求。靶向在肿瘤中高表达的受体将提供更好的癌症诊断和疗法，因为所述受体靶向肽将区分病理与正常组织。

本申请涉及基于LDLR靶向剂的用于癌症成像和放疗的新的组合物和方法。本发明提供了结合LDLR并针对成为成像或放疗药剂进行过优化的偶联化合物，并显示出这些化合物允许有效、可靠且选择性地标记过表达LDLR的癌细胞，并且最适合于这些癌症的高效诊断或放疗。

本发明提供了用于表达LDLR的癌症的有效成像、诊断、检测或放疗的新的组合物和方法。具体来说，本发明提供了能够结合到并成像过表达LDLR的癌细胞的偶联化合物。本发明允许这些癌症的体内检测及其有效且选择性的化疗。事实上，本发明显示了本发明的偶联药剂能够区分癌细胞与非癌细胞，并且可用于向癌细胞提供足够水平的辐射而不影响健康组织。

因此，本发明的一个目的涉及一种式(I)的偶联化合物：

M-P (I)，

其中，

M表示可药用标志物，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合LDLR的肽或假肽，

其用于通过向所述对象给药所述偶联化合物并分析标志物的存在和/或量而在对象中标记和/或检测癌细胞的方法中。

本发明的另一个目的是一种用于在对象中标记或检测过表达LDLR的癌症的方法，所述方法包括(i)向所述对象给药式(I)的化合物：

M-P (I)，

其中，

M表示可药用标志物，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合LDLR的肽或假肽，

和(ii)分析标志物的存在和/或量。

在特定实施方式中，所述偶联化合物是包含几个式(I)的单体的多聚体化合物。

根据优选实施方式，M表示放射性核素或荧光标志物，并且P包含氨基酸序列(II)：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-A4 (II)，

其中A1和A4独立地表示半胱氨酸或其类似物或同电子排列体，A2表示脯氨酸或其类似物或同电子排列体，A3表示甘氨酸或其类似物或同电子排列体。

此外，M和P可以共价地或通过非共价相互作用直接或通过间隔物与彼此相连。在特定实施方式中，使用辅基将M连接到P或使用螯合基团例如NODAGA、DOTA、DOTA-GA或NOTA或其功能性衍生物将M禁闭。

本发明的另一个目的涉及一种式(III)的偶联化合物：

M-C-S-P (III)，

其中，

M表示可药用放射性核素，

C表示与M形成螯合物的螯合剂，

S表示间隔物，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合LDLR的肽或假肽。

本发明的另一个目的涉及一种包含如上所述的偶联化合物的组合物，及其在医学成像或放疗中的用途。

本发明的另一个目的是一种在对象中治疗过表达LDLR的癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药式(III)的偶联化合物：

M-C-S-P (III)，

其中，

M表示适合于在放疗中使用的可药用放射性核素，

C表示与M形成螯合物的螯合剂，

S表示间隔物，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合LDLR的肽或假肽。

本发明可用于检测或治疗任何过表达LDLR的癌症，例如胰腺癌、肾上腺癌、成胶质细胞瘤、***癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。它可用于任何哺乳动物，例如人类对象。

附图说明

图1：蛋白质印迹，示出了人类和小鼠LDLR在各种不同癌细胞系中的表达：(A)CHO95(过表达与eGFP融合的人类LDLR的细胞系)，Hela(***)，NCI-H295R(肾上腺腺癌)，Capan，BxPC3和Panc1(胰腺癌)，MCF-7和MDA-MB231(乳腺癌)。在右侧图上，将小鼠胰腺细胞系PK4中LDLR的表达与小鼠正常胰腺进行了比较。(B)示出了成胶质细胞瘤细胞系U87MG(两条泳道)、***癌细胞系PC3和NCI-H295R。

图2：偶联物A(A)、偶联物B(B)、偶联物C(C)和偶联物D(D)在表达与GFP偶联的人类LDLR的CHO细胞上的结合/胞吞。LDLR-GFP信号可以在第2列中可视化，偶联物信号在第4列中使用A680荧光直接可视化或在第3列中使用抗hFc-A594偶联第二抗体可视化。细胞核用Hoechst染为蓝色，并且它的信号可以在第1列中可视化。LDLR-GFP和偶联物的共同标记可以在合并图像上第5列中作为高亮信号可视化。

图3：在A中，在移植有PK4A肿瘤并在尾静脉中用偶联物A注射的小鼠中，偶联物A在胰腺、胰腺肿瘤和肾脏(对照)中的组织生物分布。在B中，在用偶联物C注射的小鼠中，偶联物C在胰腺和胰腺肿瘤中的组织生物分布。生物分布使用ELISA定量来评估。

图4：在A中，移植有PK4A肿瘤并在静脉内注射偶联物C或偶联物D(对照)后15min、30min、60min和120min分析的小鼠的全身荧光成像。在B中，在静脉内注射偶联物C或偶联物D(对照)后4h收获的胰腺肿瘤、健康胰腺和肝脏的离体成像。

图5：笼-βAla-PEG12-肽-NH₂化合物的合成反应图式。在本图式中，显示了NODAGA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH₂的合成作为实例。

图6：在用NCI-H295R细胞移植后第14天给药¹⁸F-FDG(A)、⁶⁸Ga-CH44(B)和⁶⁸Ga-CH40(C)的小鼠的PET成像。肾上腺肿瘤用圆圈指示。

图7：在用NCI-H295R细胞移植后第32天给药⁶⁸Ga-CH44(A)和⁶⁸Ga-CH40(B)的小鼠的PET成像。肾上腺肿瘤用圆圈指示。

图8：在用NCI-H295R细胞移植后第37天给药⁶⁸Ga-FG770(A)和⁶⁸Ga-FG769(B)的小鼠的PET成像。

图9：在用Pk4a细胞移植后第4天给药¹⁸F-FDG(A)、⁶⁸Ga-CH44(B)和⁶⁸Ga-CH40(C)的小鼠的PET成像。胰腺肿瘤用圆圈指示。

图10：在用Pk4a细胞移植后第12天给药⁶⁸Ga-CH44(A)和⁶⁸Ga-CH40(B)的小鼠的PET成像。胰腺肿瘤用圆圈指示。

图11：在用U87MG细胞脑移植后第14天给药⁶⁸Ga-CH44(A)、第16天给药⁶⁸Ga-CH40(B)、第21天给药⁶⁸Ga-CH44(C)、第21天给药⁶⁸Ga-CH40(D)和第21天给药⁶⁸Ga-RGD(E)的小鼠的PET成像。

图12：在移植有U87MG的动物中第21天时⁶⁸Ga-CH44、⁶⁸Ga-CH40和⁶⁸Ga-RGD的定量，表示成肿瘤与对照的比率。

图13：在用NCI-H295R细胞移植后第48天给药⁶⁸Ga-CH44(A)和⁶⁸Ga-MG04(B)的小鼠的PET成像。

图14：化合物VHd的结构。

发明详述

本发明涉及基于LDLR靶向药剂的用于癌症成像和放疗的组合物和方法。本发明提供了包含结合LDLR的组成部分和可药用标志物的偶联化合物。更具体来说，本发明显示了这些化合物可以在体外和体内有效地标记癌细胞，并且允许其高效成像、检测、分期或放疗。

更具体来说，本发明的目的在于一种使用式(I)的偶联化合物标记癌症或肿瘤或癌/肿瘤细胞的方法：

M-P (I)，

其中，

M表示可药用标志物，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合低密度脂蛋白受体(LDLR)的肽或假肽。

人类LDLR是一种839个氨基酸的跨膜蛋白，包含三个区：细胞外区(1-768)，跨膜区(768-790)和细胞质区(790-839)。所述细胞外区被分成两个子区：LDL结合区(1-322)和所述LDL结合区之外的区(322-768)。据报道，LDLR被大多数具核细胞表达，并且通常认为在非病理细胞的表面处存在1000至3000个LDLR。癌细胞上的LDLR量可能急剧增加，高达100,000个或更多。已报道过表达LDLR的肿瘤细胞包括***癌(Chen等，2001,Int.J.Cancer,91,41-45)、结肠癌(Niendorf等，1995,Int.J.Cancer,61,461-464)、白血病(Tatidis等，2002,Biochem.Pharmacol.,63,2169-2180)、结肠直肠癌(Caruso等，2001,Anticancer Res.,21,429-433)、乳腺癌(Graziani等，2002,Gynecol.Oncol.,85,493-497)、成胶质细胞瘤脑肿瘤(Malentiska等，2000,Cancer Res.,60,2300-2303；Nikanjam等，2007,Int.J.Pharm.,328,86-94)的细胞，以及肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌的细胞。然而，尚不知道这种提高的表达是否可以影响所述受体、特别是细胞外区322-768的构象/可利用性。事实上，已观察到受体的高表达可以引起聚集或构象变化。这种聚集可能改变使用结合细胞外区322-768的LDLR靶向剂将药剂靶向这些细胞的能力。

有趣的是，并且尽管LDLR遍在表达，但本发明的偶联物允许有效地标记过表达LDLR的细胞，特别是过表达LDLR的癌细胞，并且能够有效地靶向这些表达LDLR的癌细胞。这种效应可能是由适合的受体密度、偶联物对LDLR的结合亲和性和作用机制(非竞争性)造成的。

本发明显示，本发明的偶联物保留了有效结合过表达LDLR的癌细胞的能力。

本发明显示，本发明的偶联物可以将可药用标志物导向过表达LDLR的细胞，其方式适合于将这些细胞(例如癌细胞)与具有正常LDLR水平的细胞(例如正常细胞)区分开。

本发明显示，本发明的偶联物可以为过表达LDLR的细胞提供足够水平的标记，不论LDLR密度如何和可能存在的重新组织。

因此，本发明提供了安全有效的标记和放疗药剂，并允许设计有效的癌症诊断和治疗方法。

因此，本发明的一个目的涉及一种式(I)的偶联化合物：

M-P (I)，

其中，

M表示可药用标志物，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合LDLR的肽或假肽，

其用于通过向所述对象给药所述偶联化合物并分析标志物的存在和/或量而在对象中标记和/或检测癌细胞的方法中。

本发明还涉及一种使用如上所定义的偶联化合物在对象中标记、成像、诊断或分期癌症的方法。

在特定实施方式中，本发明的偶联化合物还包含结合到不同于LDLR的分子的第二靶向基团T。这种双重偶联化合物的实例是下式(IV)的化合物：

M_n-P-T-M_m (IV)，

其中，M和P如上所定义，T表示第二靶向基团，n是1或0，m是1或0。优选地，m+n＝1。

在另一个特定实施方式中，所述双重偶联化合物具有下述结构：

(M-C-)_nP-T(-C-M)_m

其中M、C和P如上所定义，T表示第二靶向基团，n是1或0，m是1或0。优选地，m+n＝1。

T可以是结合到不同于LDLR的靶分子(或结合到表达这种分子的细胞)的任何基团。优选地，这种靶分子是由癌细胞，例如由胰腺癌细胞或***癌细胞或卵巢癌细胞或肾上腺癌细胞表达的分子。这种靶向基团的实例包括但不限于PSMA(***特异性膜抗原)、神经降压素、生长抑素的类似物及其衍生物。

偶联物

本发明公开了特定的靶向LDLR的偶联物的用途以及新偶联物的设计。正如将在下文描述的，这些偶联物可以是式(I)的单体或多聚体结构。

在特定实施方式中，所述偶联物是如上所定义的式M-P(I)的化合物。优选地，P包含氨基酸序列(II)：

A1-Met-A2-Arg-Leu-Arg-A3-A4 (II)，

其中A1和A4独立地表示半胱氨酸或其类似物或其同电子排列体，A2表示脯氨酸或其类似物或其同电子排列体，A3表示甘氨酸或其类似物或其同电子排列体。

更具体来说，A1和A4彼此独立地表示选自D或L构型的半胱氨酸(Cys，C)或其衍生物的氨基酸残基，所述衍生物选自D或L构型的2-氨基-3-巯基丙酸及其S-取代的衍生物、S-乙酰基半胱氨酸或2-氨基-3-(乙酰基硫基)丙酸、硒代半胱氨酸(Sec，U)或2-氨基-3-(硒代)丙酸、半胱氨醇、3-巯基丙酸(Mpa)或青霉胺(Pen)。

在优选实施方式中，A1和A4彼此独立地选自半胱氨酸(Cys)、(D)-cys、青霉胺(Pen)和(D)-青霉胺((D)-Pen)。

更优选地，A2表示选自下述的残基：脯氨酸(Pro，P)，吡咯烷-2-甲酸，高脯氨酸，2-(2-吡咯烷基)乙酸，3-羟基脯氨酸(3Hyp)，4-羟基脯氨酸(4Hyp)，3-甲基脯氨酸，3,4-二氢脯氨酸，3,4-亚甲基并脯氨酸，4-氨基脯氨酸，4-酮基脯氨酸，硫代脯氨酸，噻唑烷-4-甲酸(Thz)，2-酮基噻唑烷-4-甲酸，吲哚啉-2-甲酸(Idc)，哌啶甲酸(Pip)，哌啶-2-甲酸，六氢烟碱酸(Nip)，哌啶-3-甲酸，4-酮基哌啶甲酸，4-羟基哌啶甲酸，氨基-1-环己烷甲酸，或脯氨醇。

在优选实施方式中，A2选自脯氨酸、哌啶甲酸(Pip)或噻唑烷-4-甲酸(Thz)。

更优选地，A3表示选自下述的残基：甘氨酸(Gly，G)，2-氨基乙酸，肌氨酸(Sar)，N-甲基甘氨酸(MeGly)，N-乙基甘氨酸(EtGly)，烯丙基甘氨酸(allylGly)，2-氨基戊-4-烯酸，2-环戊基甘氨酸(Cpg)，2-环己基甘氨酸(Chg)，2,2-二丙基甘氨酸(Dpg)，2-(3-吲哚基)甘氨酸(IndGly)，2-茚满基甘氨酸(Igl)，2-新戊基甘氨酸(NptGly)，2-辛基甘氨酸(OctGly)，2-炔丙基甘氨酸(Pra)或2-氨基戊-4-酸，2-苯基甘氨酸(Phg)，2-(4-氯苯基)甘氨酸，氮杂甘氨酸(AzGly)，甘氨醇或2-氨基乙醇。

在优选实施方式中，A3是甘氨酸或肌氨酸。

在优选实施方式中，P包含选自下述SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：9任一者的氨基酸序列，或基本上由所述氨基酸序列构成，或由所述氨基酸序列构成：

SEQ ID NO：1，(D)-Cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Pen；

SEQ ID NO：2，(D)-Cys-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Sar-Pen；

SEQ ID NO：3，(D)-Cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Sar-Cys；

SEQ ID NO：4，(D)-Cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Gly-Pen；

SEQ ID NO：5，(D)-Cys-Met-Pip-Arg-Leu-Arg-Sar-Pen；

SEQ ID NO：6，Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys；

SEQ ID NO：7，(D)-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys；

SEQ ID NO：8，Asp-Ser-Gly-Leu-Cys-Met-Pro-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys-Asp-Pro-Arg；

SEQ ID NO：9，(D)-Pen-Met-Thz-Arg-Leu-Arg-Gly-Cys。

发明人获得的结果显示，本发明的偶联物与包含SEQ ID NO：13或14的氨基酸序列的乱序肽相比对LDLR具有提高的亲和性(K_D)(参见实施例3)。此外，本发明的偶联物在胰腺肿瘤中与健康胰脏相比表现出更好的积累(参见实施例4)。具体来说，如实施例中所示，癌组织的标记可以比非癌组织的标记高出10至50倍。这种积累水平足以允许在成像中可靠且清晰地分辨。此外，它意味着在用于放疗的情况下，所述偶联物对肿瘤细胞相比于健康细胞具有非常好的特异性。

正如上文讨论的，标志物M可以是任何放射性核素或荧光标志物。

可以使用的荧光标志物是例如Alexa Fluor 680、CF680、ATTO680、荧光探针682、花菁5.5、IRDye 680或Vivotag。通常，所有近红外(IR)荧光标志物可用于成像，因为它们允许极小的组织自荧光。更具体来说，Alexa Fluor 680是明亮且光稳定的近IR染料，其在光谱上与Cy5.5染料类似。用于成像和流式细胞术中的稳定信号产生，Alexa Fluor 680染料是水溶性的，并且从pH 4至pH 10对pH不敏感。Alexa Fluor 680的NHS酯(或琥珀酰亚胺基酯)是用于将这种染料偶联到蛋白质或抗体的最常用的工具。染料的NHS酯可用于标记蛋白质、胺修饰的寡核苷酸和其他含胺分子的伯胺(R-NH₂)。

在最优选实施方式中，M是适合用于医学成像，例如用于正电子发射断层扫描(PET)成像、闪烁扫描术、正电子发射断层扫描-计算机断层扫描或单光子发射计算机断层扫描的放射性核素。优选地，M是适合用于PET的放射性核素。

适合用于本发明的放射性核素的实例包括但不限于¹⁸F、¹¹C、¹⁵O、¹³N、⁶⁸Ga、⁸²Rb和⁸⁹Zr。用于成像的优选放射性核素应该具有短的半衰期(例如30分钟至3或4天)和低的能量发射(例如低于300keV的γ射线发射的放射性核素)。优选地，所述放射性核素是⁶⁸Ga。⁶⁸Ga具有短的半衰期(68分钟)，并且是发射正电子的同位素。

为了在放疗中使用，放射性核素通常是发射β射线或高能γ射线的放射性核素，优选地具有较长的半衰期(例如1至75天之间)。在放疗中使用的优选放射性核素选自⁹⁰Y、¹¹¹In、¹³¹I和¹⁷⁷Lu。在优选实施方式中，使用⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu或¹¹¹In。

本发明的偶联物可以通过本领域技术人员已知的任何技术来合成(化学、生物或遗传合成等)。对于化学合成来说，使用商业化装置，其可以并入天然以及非天然氨基酸例如D对映异构体和具有不同于天然同系物的侧链的疏水性和空间位阻的侧链的残基(所谓的外来的、即非编码氨基酸)，或含有一个或多个肽模拟键的肽序列，所述肽序列可以尤其包括亚甲基(-CH₂-)或磷酸酯基(-PO₂-)、仲胺(-NH-)或氧(-O-)或N-烷基肽的嵌入。所述肽或假肽或其蛋白质部分，也可以从编码它们的核酸序列获得。这些核酸序列可以是DNA或RNA，并且可以与控制序列组合和/或***到生物表达载体中。

在本发明的偶联化合物中，M与P之间(和/或P与T之间)的偶联可以将相关试剂的化学本质、阻碍和数目考虑在内，通过任何可接受的键合手段来进行。因此，偶联可以通过一个或多个共价键、离子键、氢键、疏水键或范德华键来进行。此外，偶联也可以在所述肽或假肽的天然存在或已被引入的官能团例如-OH、-SH、-CO₂H、-NH₂、-SO₃H、-CN、-N₃、-NCS、-PO₂H、炔基、马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯的任何位点处进行。因此，M可以通过在所述肽或假肽的N-端或C-端末端处、在该肽序列的天然或非天然氨基酸侧链所携带的反应性基团处通过共价键，或通过辅基，连接(偶联)到所述肽或假肽。同样地，偶联可以在所述成像或放疗药剂的任何位点处进行。

优选地，所述相互作用足够强，使得在到达作用位点之前M不从所述肽解离，并且M和所述肽在执行成像方法或M具有治疗效果所必需的时间内保持偶联。因此，本发明的优选偶联是共价或离子结合。所述成像或放疗药剂可以在所述肽的末端之一(N-端或C-端)处或在所述序列的组成氨基酸之一的侧链处，直接偶联到所述肽。所述成像或放疗药剂也可以在所述肽的末端之一处或在所述序列的组成氨基酸之一的侧链处，利用连接物或间隔物间接偶联。在特定实施方式中，通过使用例如螯合剂进行禁闭，将M连接到所述肽。

就此而言，在优选实施方式中，所述偶联化合物包含能够与M形成螯合物的螯合剂C。这些偶联物具有结构M-C-P。可以使用各种不同的螯合剂。优选地，C选自NODAGA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1-戊二酸-4,7-二乙酸)、DOTA(四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-三乙酸)、DOTA-GA(2,2',2”-(10-(2,6-二氧代四氢-2H-吡喃-3-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)及其功能性衍生物。NODAGA和NOTA优选用于成像，而DOTA优选用于放疗。

术语“功能性衍生物”意味着从上面提到的螯合剂，通过将其一个或多个功能基团(即参与螯合功能的基团)用另一个功能基团代替而不损伤所述螯合功能，和/或通过添加和/或缺失不参与螯合功能的基团而不损伤所述螯合功能，所衍生的任何化合物。

所述螯合剂C可以直接地或通过通常共价偶联到P和C(或T和C)的间隔物S连接到肽P(或连接到T)。就此而言，在特定实施方式中，所述偶联物包含结构M-C-P，其中M、C和P如上所定义，并且其中C直接连接到肽P。在另一个特定实施方式中，所述偶联物包含结构M-C-S-P，其中M、C、S和P如上所定义。在另一个特定实施方式中，所述偶联物包含结构M-C-P-T或P-T-C-M或M-C-S-P-T或P-T-S-C-M，其中M、C、S、P和T如上所定义。在另一个实施方式中，P和T通过间隔物基团偶联。

S可以选自本质为烷基、芳基、PEG或肽，并且在它们的末端处具有官能团例如胺、酯、醛、烷基或芳基酸、酸酐、硫氢基或羧基、源自于溴化氰或氯化氰、羰基二咪唑、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤、马来酰亚胺、叠氮化物、异硫氰酸酯、炔烃的基团的双功能或多功能试剂。在特定实施方式中，S包含一个或几个PEG，优选地在其一个末端处具有β-丙氨酸。例如，S是12个PEG的寡聚物，并在链的一个末端处具有β-丙氨酸。在另一个实施方式中，S包含几个Gly残基例如G3或G4S。在其他特定实施方式中，S包含涵盖D或L构型的氨基酸的亲水的带负电荷的肽序列例如几个His-Glu重复单元(2或3个单元)，或涵盖D或L构型的氨基酸的亲水的中性序列例如Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn。在另一个实施方式中，在血浆中稳定但在肾中被近端小管刷状缘膜处的水解酶特异性裂解的可代谢基团，可用于降低肾潴留。例如，可以使用甘氨酰-赖氨酸键。因此，S可以是任何药代动力学改良剂。

在特定实施方式中，本发明涉及式(III)的偶联化合物：

M-C-S-P (III)，

其中，

M表示可药用放射性核素，

C表示与M形成螯合物的螯合剂，

S表示间隔物，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合低密度脂蛋白受体(LDLR)的肽或假肽。

在特定实施方式中，本发明涉及如上所定义的偶联化合物，其还包含第二靶向基团T。

本发明的优选偶联化合物是式(III)的化合物，其中

M表示可药用放射性核素，

C选自NODAGA、DOTA、NOTA和DOTA-GA，

S表示包含双功能试剂、PEG或肽的间隔物，或者S不存在，并且

P表示具有至多30个氨基酸残基并且能够结合低密度脂蛋白受体(LDLR)的肽或假肽。

在本发明的最优选化合物中，C是NODAGA或DOTA，并且P包含选自SEQ ID NO：1-9的氨基酸序列。

本发明的偶联化合物的具体实例包括：

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其中S是如上所定义的间隔物。

在特定实施方式中，本发明的偶联化合物可以采取多聚体形式，即包含P或M基团或两者的几个拷贝。更具体来说，所述偶联化合物可以包含结构M-P-X_i-P_j-M_k，其中M和P如上所定义，X是交联剂，i是选自0或1的整数，j是选自0、1、2、3、4或5的整数，并且k是选自0、1、2、3、4或5的整数。在这些多聚体结构中，当i＝0时，j和k通常也等于0。此外，k可以等于或小于j。此外，在这些多聚体结构中，M可以如上所述(即直接地或使用螯合剂和/或间隔物)连接到P。

这些多聚体化合物的具体实例具有结构M-P-X-P_j-M_k，其中M和P如上所定义，X是交联剂，j是1并且k是0。

交联剂X可以是与在药物或兽医领域中的用途相容的任何化学交联基团。所述基团优选地不具有生物活性和毒性。所述交联剂的尺寸可以由专业技术人员调整。X基团的优选实例是聚赖氨酸或聚谷氨酸平台(直链、环化或支链区段)或多官能有机化合物例如具有一个氨基和四个叠氮基官能团的PEG(3)-Pentrimer-G1-(NH2+4xN3)*4HCl。在特定实施方式中，所述交联剂含有至少两个、优选地至少三个反应性官能团，允许至少2个肽的偶联。反应性官能团的实例包括例如胺、酸、硫醇、叠氮化物、炔烃、羰基化合物或肼。所述肽可以通过与所述试剂的反应性官能团的共价键直接地或通过间隔物偶联到X，所述间隔物可以例如由甘氨酸或一系列甘氨酸、PEG分子或氨基己酸构成。

本发明的这种多聚体化合物的具体实例是如图14所表示的化合物VHd：

DOTA-PEG2-E(PEG2-SEQ ID NO：1)-PEG2-E(PEG2-SEQ IDNO：1)-NH2.

本发明还涉及不含标志物基团M的任一上述偶联化合物。这些化合物是最终标记的偶联化合物的制备中的中间体。事实上，正如实施例中所示，首先制备所述偶联物，并随后、通常在给药之前进行标记。因此，本发明还涉及不含M的如上所定义的任何偶联物。具体来说，本发明涉及结构C-(S-)_nP的化合物，其中C、S、P和n如上所定义并如上所定义进行偶联，还涉及如上所进一步定义的其包含T基团的变体和/或其多聚体。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含至少一种如上所定义的偶联化合物。所述组合物可以包含一种或多种可药用赋形剂或稀释剂。

本发明还涉及一种诊断组合物，特征在于它包含由例如上文所定义的偶联化合物构成的诊断或医学成像试剂。

成像/诊断用途

本发明的偶联物可用于在任何哺乳动物中，特别是在人类对象中体内标记、检测或诊断表达LDLR的癌症。

就此而言，在特定实施方式中，M是适合用于成像的放射性核素或荧光染料，并且所述标记和/或检测方法包括：

a)向对象给药所述偶联化合物，

b)执行成像方法，以及

c)分析在步骤b)中获得的信号，

其中信号的存在指示了所述对象中癌细胞的存在和/或癌症的演化阶段。

所述偶联物可以按照各种不同途径给药。优选地，通过系统、肠胃外或局部注射来注射所述偶联物。具体来说，注射可以是静脉内、皮下、肌肉内、动脉内或肿瘤内的。在特定实施方式中，本发明的偶联化合物被静脉内注射。这种给药方式允许所述化合物在生物体中适合地扩散并到达感兴趣的组织。在另一个实施方式中，给药通过肿瘤内注射进行。这种方式在已知或高度怀疑肿瘤存在时是适合的，并且执行所述方法以例如对肿瘤分期、评估其进展或治疗的有效性。

给药的化合物的量可以由专业技术人员根据所述方法的目的(成像、检测、监测)和所述对象来调整。

本发明的化合物可用于本身在本领域中已知的各种不同成像方法，例如但不限于闪烁扫描术、正电子发射断层扫描(PET)、正电子发射断层扫描-计算机断层扫描(PET-CT)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。优选的方法是PET。

取决于方法，得到的信号可能是定量标志物值、图像、分布曲线、正电子湮灭事件的数目等。在步骤c)中，对这种信号进行分析以确定所述对象中癌症的存在、分期或进展。术语“分析”是指允许确定信号是否对应于正常信号的任何方法。所述分析可能不仅是可视的，而且包含定量分析。所述分析可以包括将通过成像获得的信号的值与同一对象或另一个对象的已知健康组织的信号的值进行比较的步骤。也可以将所述信号的值与参比值进行比较。

比参比值或来自于健康组织的对照更加重要的在步骤b)中获得的值，指示了癌细胞的存在。癌症的演化阶段可以通过在同一对象中比较在时间上隔开的两个不同成像工作段之后获得的信号来评估。

本发明的偶联化合物特别适合于标记和/或检测过表达LDLR的癌细胞。就此而言，术语“过表达LDLR的细胞”是指相对于标准表达水平表达多出至少10％的LDLR的细胞。通常，在“正常”细胞的表面处存在1000至3000个LDLR。过表达LDLR的细胞是表达多出至少20％的LDLR、更具体来说多出至少50％、75％、100％或150％的LDLR的细胞。

可以使用本发明的方法检测的过表达LDLR的癌症的具体实例包括胰腺癌(pancreatic cancer)、肾上腺癌、成胶质细胞瘤、***癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌(pancreas cancer)、卵巢癌、肺癌或胃癌。

放疗

另一方面，本发明还涉及本发明的偶联化合物用于通过放疗治疗癌症的用途。

术语“治疗”和其他类似表述是指获得药理和/或生理效果，例如癌细胞生长的抑制或提高癌细胞死亡。

就此而言，所述治疗方法包括向需要的对象给药如上所定义的偶联化合物。

优选地，所述偶联化合物包含适合于放疗的放射性核素，例如发射β射线或高能γ射线的放射性核素，其优选地具有长的半衰期(例如1至75天之间)。用于放疗的优选放射性核素选自⁹⁰Y、¹¹¹In、¹³¹I和¹⁷⁷Lu。在优选实施方式中，使用⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu或¹¹¹In。

所述化合物应该以足以辐照所述肿瘤的量给药。这种量可以由专业技术人员调整。

所述治疗可以单独地或与其他癌症疗法例如化疗相组合(例如轮流或联合)使用。

所述方法可用于治疗任何过表达LDLR的癌症，例如胰腺癌、肾上腺癌、成胶质细胞瘤、***癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌或胃癌。它可以在任何哺乳动物对象、特别是人类对象中，在癌症发展的任何阶段使用。通常，执行几个连续的治疗方案。为了在疗法中使用，本发明的偶联化合物可以采取任何可药用盐的形式。表述“可药用盐”例如且非限制性地是指可药用碱或酸加成盐、水合物、酯、溶剂化物、前体、代谢物或立体异构体。表述“可药用盐”是指通常可以通过游离碱与适合的有机或无机酸进行反应来制备的无毒性盐。这些盐保留游离碱的生物学有效性和性质。这些盐的代表性实例包括水溶性和水不溶性盐例如乙酸盐、N-甲基葡萄糖胺、氨基芪磺酸盐(4,4-二氨基芪-2,2’-二磺酸盐)、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、氢溴酸盐、溴化物、丁酸盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、盐酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、二氯水合物、二磷酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二胺四乙酸钙、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基对氨基苯胂酸盐、六氟磷酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代羟酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(1,1-亚甲基-双-2-羟基-3-萘甲酸盐或emboate)、泛酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、对甲苯磺酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺基水杨酸盐、氨基磺酸盐(suramate)、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物、三氟乙酸盐和戊酸盐。

此外，所述偶联化合物可以用任何适合的可药用赋形剂、载体或稀释剂配制。就此而言，本发明还涉及包含如上所定义的化合物和可药用载体或赋形剂的组合物。所述可药用载体可以选自根据每种给药方式经典使用的载体。根据所设想的给药方式，所述化合物可以采取固体、半固体或液体形式。对于游离或包含在明胶胶囊中的固体组合物例如片剂、丸剂、粉剂或颗粒剂来说，可以将所述活性物质与下述物质组合：a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；c)粘合剂，例如硅酸镁和硅酸铝、淀粉糊、明胶、黄芪树胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、染料、调味剂和甜味剂。所述赋形剂可以是例如医药级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和类似物。对于半固体组合物例如栓剂来说，赋形剂可以是例如乳液或油性悬液或基于聚亚烷基二醇的例如聚丙二醇。液体组合物特别是注射液或包含在软胶囊中的液体组合物，可以例如通过将活性物质溶解、分散等在药品纯的溶剂例如水、生理盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油、乙醇、油及其类似物中，来制备。

本发明的组合物或偶联物可以通过任何适合的途径给药，并且非限制性地，通过肠胃外途径，例如采取可以通过静脉内、输注、皮下或肌肉内途径注射的制剂的形式；通过口服途径(或经口)，例如采取包衣或未包衣片剂、明胶胶囊、粉剂、丸剂、悬液或口服溶液的形式(一种这样的用于口服给药的形式可以具有立即释放或延长或延迟释放)；通过直肠途径，例如采取栓剂的形式；通过局部途径特别是通过透皮途径，例如采取贴片、润发油或凝胶的形式；通过鼻内途径，例如采取气溶胶和喷剂的形式；通过经舌途径；或通过眼内途径。

本发明还涉及用于制备或制造如上所定义的偶联化合物的方法，所述方法包括将标志物M偶联到肽P，优选地使用螯合剂C。

本发明还涉及制造药物组合物的方法，所述方法包括提供如上所定义的偶联化合物，并用适合的赋形剂或稀释剂配制所述化合物。

在考虑了下面的实施例后，本发明的其他方面和优点将变得显而易见，所述实施例在本质上仅仅是说明性的，并且不限制本申请的范围。

实施例

实施例1：小鼠和人类组织中的LDL-受体(LDLR)表达

为了评估LDLR在感兴趣的小鼠和人类细胞系中的膜表达，使用试剂盒ProteoExtract亚细胞蛋白质组提取试剂盒(Calbiochem,La Jolla,CA,USA)从人类和小鼠癌细胞系制备膜提取物。

膜提取物使用BioRad DC蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)，按照制造商的说明书来定量。将1、10μg或20μg的细胞膜蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在4-12％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜(AmershamBiosciences)上。将膜用山羊抗LDLR抗体(R&D Systems，(1/500))、然后用过氧化物酶偶联的驴抗山羊第二抗体(Jackson Immunoresearch)探测。最后，使用化学发光检测蛋白质。

如图1A中所示，在肾上腺(NCI-H295R)、成胶质细胞瘤(U87MG)、乳腺癌(MDA-MB-231)和***(PC3)人类癌细胞中，LDLR的表达提高。CHO95(稳定表达与GFP融合的hLDLR(hLDLR-GFP)的工程化的中华仓鼠卵巢细胞)被用作阳性对照。在人类胰腺癌细胞(Capan、BxPC3和Panc1)中，LDLR的水平是可变的。在其他细胞类型如Hela(***)或MCF7乳腺癌细胞中，LDLR的表达水平非常低，几乎不可检测。与正常胰腺组织相比，在小鼠胰腺细胞系PK4A(源自于在胰腺中发生自发肿瘤的小鼠)中LDLR表达提高。

实施例2：荧光LDLR靶向偶联物的合成：偶联物A，偶联物B，偶联物C和偶联物D

在下述实施例中，公开了偶联物A、B、C和D的生产和使用。如下所示，偶联物A、B、C和D分别含有肽A(SEQ ID NO：1)、B(SEQ ID NO：13)、C(SEQ ID NO：6)和D(SEQ ID NO：14)。

化合物	组成
		偶联物A	Fc-肽A-A680
偶联物B	Fc-肽B-A680
		偶联物C	Fc-肽C-A680
偶联物D	Fc-肽D-A680

偶联物C和偶联物D融合蛋白的生产

肽C和D被克隆成与IgG1的Fc片段融合。

为了生产与肽C或D融合的Fc片段，在用作模板的质粒pINFUSEhIgG1-Fc2(InvivoGen)的基础上产生质粒构建物。使用寡核苷酸通过PCR来合成被称为引物C或引物D的大引物：

-正向引物：

CTTGGCATTATGCACCTCCA(SEQ ID NO：10)

-含有编码肽C的序列的反向引物：

CTGGCCAGCTAGCACTCAGCAACCGCGAAGACGAGGCATACAAGCACCTTTACCCGGAGACAGGGAG(SEQ ID NO：11)。

-含有编码肽D的序列的反向引物：

CTGGCCAGCTAGCACTCGCAGGGTCTGCCCAGCATTCTGCAAGCACCTTTACCCGGAGACAGGGAG(SEQ ID NO：12)。

将所述PCR反应的产物纯化，用DpnI(消化亲代甲基化DNA的酶)消化，并在使用pINFUSE hIgG1-Fc2质粒作为基质，使用QuickChange II定点突变试剂盒(Agilent)进行的第二个PCR反应中用作大引物。在转化感受态细菌细胞后，获得分离的菌落，制备质粒DNA，并在两条链上对cDNA构建物进行测序，用于验证。被称为pConjugate-C和pConjugate-D的载体允许在转染哺乳动物细胞后表达在C-端与肽C和D融合的Fc片段。将Expi293表达系统(ThermoFischer)用于在培养上清液中瞬时表达融合蛋白偶联物C和D。在转染72小时后回收上清液，并使用Montage抗体蛋白A PROSEP A试剂盒(Millipore)，按照制造商的推荐进行纯化。

偶联物A和偶联物B蛋白合成：

肽A和B与人类IgG1Fc片段(Merck Millipore)的偶联，使用异双功能间隔物sulfo-SMCC(Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)以两步方式进行。首先，允许Fc片段与sulfo-SMCC反应，以获得针对硫醇组成部分的反应性蛋白；在第二个步骤中，将硫醇功能化的肽A或B偶联到赖氨酸连接的Fc-SMCC蛋白。

硫醇功能化的肽的合成

肽A和肽B的氨基酸序列分别为cMThzRLRGPen(SEQ ID NO：1)和cRPLGRMC(SEQ IDNO：13)，其中“Thz”是指噻唑烷，“Pen”是指青霉胺。

选择具有标准正交侧链保护的N-α-Fmoc保护的氨基酸：Fmoc-Cys(Trt)-OH(采取D或L构型)，Fmoc-Pen(Trt)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Thz-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Gly-OH。它们以及哌啶、三氟乙酸(TFA)、二异丙基乙胺(DIEA)、乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(TIS)、苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBop)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-***并[4,5-β]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)和2-三苯甲基硫代-1-乙胺盐酸盐(Trt-半胱胺)均购自IrisBiotech。

二甲基甲酰胺(DMF)、丙酸酐、AcOH、K3[Fe(CN)6]、碳酸铵和二氯甲烷(DCM)购自Sigma-Aldrich。

Pr-肽A-G-CH₂-CH₂-SH和Pr-肽B-G-CH₂-CH₂-SH两者通过固相肽合成(SPPS)方法，使用Fmoc/tBu策略和购自Iris Biotech的Fmoc-Gly-Wang树脂(100-200目，1％DVB，载样量0.7mmol/g)来合成。这种树脂允许合成在侧链上完全去保护并在C-端具有游离羧酸的肽。将Gly残基***在C-端位置处，以便能够功能化并同时避免消旋。

对于cMThzRLRGPen和cRPLGRMC序列来说，肽合成在Liberty^TM(CEM)微波合成仪上进行。

然后使用包含TFA/TIS/H2O/EDT:94/2/2/2的溶液在室温(RT)下至少2小时，裂解下来树脂结合的肽。每克树脂使用最少15mL裂解溶液。然后使用冰冷的醚沉淀粗品肽，以3000rpm离心8min，并在H₂O/0.1％TFA中冷冻干燥。获得白色固体并且不需任何进一步纯化直接用于环化步骤中。

通过来自于采取L或D构型的两个适当保护的Cys或Pen的两个硫醇官能团的分子内环化，获得二硫桥。将粗品Pr-cMThzRLRGPen-G-OH和Pr-cRPLGRMC–G-OH溶解在AcOH0.5％中，以获得0.5mg/mL的终浓度。向所述肽溶液添加碳酸铵(2N)，以达到8-9的近似碱性的pH。然后向反应混合物添加K₃[Fe(CN)₆](0.01N)，直至观察到明亮且持久的黄色。通过分析RP-HPLC进行反应的监测。通常反应在少于30min内是定量的。将反应混合物在0.45μm膜上过滤并通过制备RP-HPLC进行纯化。收集纯度高于95％的级分并冷冻干燥，给出纯白色粉末(最终纯度>95％)。所述纯的合成肽的均一性和身份通过分析RP-HPLC来评估。通过以正离子模式使用的LCQ Fleet(ThermoFisher)上的ESI质谱术，令人满意地检查了所述肽的身份。

Pr-肽B-G-OH和Pr-肽A-G-OH的硫醇功能化在其C-端上，使用半胱胺，通过下述步骤来进行：i)用DMF中的PyBop/DIEA活化第一个Gly残基并与2-三苯甲基硫代-1-乙胺盐酸盐(Trt-半胱胺)反应，和ii)在酸性条件下(DCM/TIS/TFA:3/1/1)除去半胱胺三苯甲基保护。

Pr-肽A-G-CH₂-CH₂-SH和Pr-肽B-G-CH₂-CH₂-SH与Fc片段的化学偶联

在第一步中，将肽A和B用sulfo-SMCC间隔物功能化：使用每个Fc25个肽的摩尔过量，允许肽A-SMCC和肽B-SMCC与人类Fc片段的伯胺(AG 714-Millipore)反应。所述反应在室温(RT)下，在PBS缓冲液中温浴1小时。为了除去过量的肽，然后将混合物在Pierce^TMDextran脱盐柱(Pierce)上纯化。Fc-肽A和Fc-肽B偶联物的浓度使用抗Fc ELISA测定法来确定。

偶联物A、B、C和D的化学合成

为了将荧光团Alexa680^TM(A680激发：679nm；发射：702nm)偶联到Fc-肽A、Fc-肽B、Fc-肽C和Fc-肽D，使用SAIVI^TM快速抗体标记试剂盒(S30045-ThermoFicher)。该试剂盒被设计成以对于体内成像应用来说最适的标记程度(DOL，染料与蛋白质的比率)(约2的DOL)来标记抗体。每种偶联物的DOL(参见表1)可以通过吸收光谱法，利用Lambert-Beer定律来确定：吸光度(A)＝消光系数(ε)×摩尔浓度×光径长度(d)。测量偶联物溶液的UV-VIS光谱。在染料的最大吸收波长(λabs)处的吸光值(Amax)和280nm(蛋白质的最大吸收波长)处的吸光值(A280)的测定提供了结合的染料的浓度，其由c(染料)＝Amax/εmax×d给出，其中εmax是染料在最大吸收波长处的消光系数，并以相同的方式从280nm处的吸光度提供了蛋白质浓度：c(蛋白质)＝Aprot/εprot×d，其中εprot是蛋白质在280nm处的消光系数。然后如下计算DOL：DOL＝[Amax/εmax]/[Aprot/εprot]。

偶联物名称	DOL
		偶联物A	1.3
偶联物B	1.5
		偶联物C	1.3
偶联物D	1.8

表I：偶联物的DOL

偶联物A、B、C和D的浓度使用抗Fc ELISA测定法来确定。

实施例3：偶联物A、B、C和D对LDLR的亲和性(K_D)的表面等离子体共振(SPR)确定。偶联物对由CHO细胞和癌细胞系稳定表达的h/mLDLR的结合/胞吞性质。

偶联物对LDLR的亲和性(K_D)

重组人类LDLR(带His标签的)购自Sino Biological(Beijing,China)。偶联物与LDLR的相互作用在25℃下，使用Biacore T200(GE Healthcare)和作为运行缓冲液的50mMHEPES-NaOH pH7.4，150mM NaCl，0.005％Tween-20，50μM EDTA来试验。将hLDLR以35-60fmol/mm²的密度固定在NiHC传感器芯片(Xantec,Dusseldorf,Germany)上。将偶联物与LDLR包被的流动池的结合针对与未包被的流动池的非特异性结合进行校正。使用单循环动力学方法来测量配体与LDLR的亲和性。将配体在运行缓冲液中稀释，并使用逐渐提高的浓度以30μl/min顺序进样2分钟。在配体进样之前在相同条件下进行运行缓冲液的空白运行进样。将双重减除的传感图整体拟合于来自于Biacore T200Evaluation 2.0版的1:1Langmuir结合模型。K_Ds被概述在下面的表II中：

表II：偶联物A、B、C和D对人类LDLR的亲和性

荧光偶联物被表达LDLR的细胞的结合/胞吞

为了评估对h/mLDLR-GFP具有亲和性的偶联物(偶联物A和C)和对照偶联物(偶联物B和D)被LDLR胞吞的能力，包括将所有偶联物在活的hLDLR-GFP细胞上温浴的免疫细胞化学实验在37℃下进行1小时，然后进行共聚焦显微术分析。

在这些实验中，对于图2来说，LDLR-GFP信号在第2列中可视化，偶联物信号在第4列中使用A680荧光直接可视化或在第3列中使用抗hFc-A594偶联第二抗体可视化。细胞核用Hoechst染为蓝色，并且它的信号可以在第1列中可视化。LDLR-GFP和偶联物的共同标记可以在合并图像上第5列中作为高亮信号可视化。得到的结果表明偶联物A和C结合到CHO-hLDLR-GFP细胞并被其胞吞，而对照偶联物B或D没有。

实施例4：在原初或带有癌症的小鼠中i.v注射的LDLR靶向偶联物的分布的ELISA 定量

小鼠胰腺腺癌PK4A细胞获自S.Vasseur(Inserm U1068,Cellular Stress)并且在以前描述过(Guillaumond F等，2013Proc Natl Acad Sci USA 110(10):3919–3924)。将细胞在增补有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)、胎牛血清(10％Gold Serum,InVitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Invitrogen,Carlsbad,CA)中培养，并在37℃下和含有5％CO2的气氛中温浴。将细胞用于肿瘤诱导。在从Envigo(Harlan,Indianapolis,IN)获得的4周龄Hsd：无胸腺Nude-Foxn1nu雄性裸小鼠中，通过在肩膀之间皮下注射悬浮在150μL完全培养基中的1×10⁶个细胞来诱导PK4A肿瘤异种移植物。每隔一天目测评估肿瘤尺寸，并将动物用于体内成像实验。一旦PK4A皮下肿瘤体积达到接近700-1500mm³尺寸(植入后10至14天)，就将带有肿瘤的小鼠在尾静脉中用5nmoles偶联物注射。在对于偶联物A和B来说2小时和对于偶联物C和D来说4小时后，将全血收集在肝素化试管(Sigma Aldrich)中，并在以5000g离心15min后分离到血浆。然后将小鼠用PBS 1X以2ml/min的速率灌注10min。取出器官，称重，并在PBS/0.1％Triton(Sigma Aldrich)中，在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Aldrich)的PBS中匀浆。将器官匀浆物在-80℃下冷冻12hrs，然后超声处理3x 10s，通过以20000g离心15min进行组织裂解液的澄清。使用抗Fc ELISA测量分离的上清液中的Fc浓度。图3中的结果显示在胰腺肿瘤中与胰腺相比偶联物A的40倍的积累和偶联物C的30倍的积累。示出了肾脏积累作为对照。

实施例5：偶联物C及其乱序对应偶联物D在胰腺肿瘤和健康胰腺中的生物分布

将带有肿瘤的小鼠用5nmol偶联物C以及作为对照的偶联物D静脉内注射(n＝5)。在IV注射后15min、30min、60min和120min，监测荧光全身成像。在实验结束时(分子的IV注射后4h)收获胰腺、肝脏和肿瘤组织，并测量离体荧光。图4显示，与乱序偶联物D相比，偶联物C在胰腺肿瘤中显著积累。此外，这种积累是特异性针对胰腺肿瘤的，因为在健康胰腺组织中没有观察到积累。

实施例6：NODAGA-SEQ ID NO：1-NH₂、DOTA-SEQ ID NO：1-NH₂、NODAGA-βAla-PEG12- SEQ ID NO：1-NH₂、DOTA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH₂以及它们相应的乱序对照NODAGA-β Ala-PEG12-SEQ ID NO：13-NH₂和DOTA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：14-NH₂的合成

在下述实施例中，⁶⁸Ga-CH44被用作⁶⁸Ga-NODAGA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH₂的缩写，⁶⁸Ga-FG770被用作⁶⁸Ga-DOTA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH₂的缩写，⁶⁸Ga-CH40被用作⁶⁸Ga-NODAGA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH₂的缩写，并且⁶⁸Ga-FG769被用作⁶⁸Ga-DOTA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH₂的缩写。

缩写	化合物
		<sup>68</sup>Ga-CH44	<sup>68</sup>Ga-NODAGA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH<sub>2</sub>
<sup>68</sup>Ga-CH40	<sup>68</sup>Ga-NODAGA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH<sub>2</sub>
		<sup>68</sup>Ga-FG770	<sup>68</sup>Ga-DOTA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH<sub>2</sub>
<sup>8</sup>Ga-FG769	<sup>68</sup>Ga-DOTA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH<sub>2</sub>

将两种类型的螯合笼偶联到LDLR靶向肽载体：

-NODAGA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1-戊二酸-4,7-二乙酸)使得能够合成用于成像的放射性标记的偶联物；

-DOTA(四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)被引入用于制备具有用于放疗的潜力的放射性标记的偶联物。

大环化合物NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)和NODAGA是用于螯合常用的放射性示踪剂⁶⁸镓的最有利的配体。在这些配体中选择了NODAGA，因为这种螯合笼与NOTA相比含有额外的偶联组成部分。这确保了所有羧酸臂可用于饱和六齿配位。

对于放疗来说，在临床上使用¹¹¹铟、¹⁷⁷Lu或⁹⁰钇。这些放射性金属良好地啮合在DOTA大环螯合剂中，它们与其形成热力学和动力学稳定的络合物。事实上，DOTA提供了8个供体原子和适合的空腔尺寸，以与这些放射性核素形成更加稳定的络合物。

制备了NODAGA和DOTA衍生物两者，以开发能够偏好性地靶向表达LDLR的癌症的成像剂和受体介导的放疗剂。

设计并制备了不同构建物以评估偶联到肽载体的大环螯合剂的位置和距离：所述螯合剂被偶联到C-端、N-端或另外引入到所述肽载体序列的赖氨酸的氨基侧链。正如在纯化的LDLR上通过SPR分析所评估的，所有衍生物总是结合到靶LDL受体。因此，我们选择了在N-端带有所述螯合剂的构建物，因为这种合成途径更容易建立。

图5示出了笼-连接物-肽-NH₂偶联物的合成的反应图式。在本图式中，示出了NODAGA-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH₂的合成的实例。

参考图5，所述合成反应的试剂和条件如下：

-步骤a：AA(4当量(eq))，HATU(4eq)，DIEA(8eq)，DMF，微波活化；

-步骤b：Fmoc-PEG12-OH(1.5eq)，DIC(4eq)，HOBt(2eq)，DMF，室温(RT)，24h；

-步骤c：Fmoc-(β)Ala-OH(3eq)，COMU(3eq)，DIEA(8eq)，DMF，RT，3h；

-步骤d：DMF/哌啶(20％)15min，TFA/TIS/H₂O/EDT(94/2/2/2)，RT，2h；

-步骤e：AcOH(0.5％)，(NH₄)₂CO₃，K₃Fe(CN)₆，pH＝7-8，[肽]＝1mg/mL；

-步骤f：NODAGA-NHS(2eq)，DIEA(10eq)，DMF，RT，30min。

分析和纯化方法：

-反应进程和纯度监测在装备有C18KinetexTM(5μm，150mm x4.6mm)的ThermoFisher 3000系统上进行。检测在214nm下进行。洗脱系统由H2O/0.1％TFA(溶液A)和MeCN/0.1％TFA(溶液B)构成。流速为2mL/min，梯度为在4min内0-100％的溶液B。

-粗产物在装备有C18LunaTM(5μm，100mm x 21.2mm)的Thermo Fisher3000系统上，通过RP-HPLC进行纯化。检测在214nm下进行。洗脱系统由H2O/0.1％TFA(溶液A)和MeCN/0.1％TFA(溶液B)构成。流速为20mL/min。

H-SEQ ID NO：1-NH2、H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH2和H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH2的合成：

选择具有标准的正交侧链保护的N-α-Fmoc保护的氨基酸：Fmoc-Cys(Trt)-OH(采取D或L构型)，Fmoc-Pen(Trt)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Thz-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-βALa-OH和Fmoc-Gly-OH。它们以及哌啶、三氟乙酸(TFA)、二异丙基乙胺(DIEA)、乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(TIS)、1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉并-碳正离子六氟磷酸盐(COMU)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-***并[4,5-β]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)、N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并***都购自Iris Biotech。

二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)购自Sigma-Aldrich。

Fmoc-21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一烷酸(Fmoc-PEG12-OH)购自PolyPeptide Laboratories，

偶联物H-SEQ ID NO：1-NH2、H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH2和H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH2通过固相肽合成(SPPS)方法，使用Fmoc/tBu策略和购自Iris Biotech的Fmoc-Rink Amide树脂(100-200目，1％DVB，载样量0.7mmol/g)来合成。这种树脂允许合成在侧链上完全去保护并具有C-端酰胺的肽。

对于cMThzRLRGPen(SEQ ID NO：1)和cRPLGRMC(SEQ IDNO：13)序列来说，肽合成在Liberty^TM(CEM)微波合成仪上进行，而连接物Fmoc-βAla-OH和Fmoc-PEG12-OH在涉及时被手动偶联。

对于自动化合成来说，在0.25mmol规模的合成中，使用aa/DIEA/HATU:4/4/8当量(相对于树脂)，通过第n+1个氨基酸的酸官能团的微波活化来偶联氨基酸。偶联时间被调整到10min。对于在噻唑烷或脯氨酸残基后引入的氨基酸来说，双偶联是必需的。由此偶联的新氨基酸的Fmoc基团的去保护，使用DMF中的20％哌啶来进行。将在肽延长期间偶联的最后一个氨基酸去保护，以便能够在N-端上进一步偶联。对于在所述笼与肽载体之间引入有连接物的序列来说，随后使用aa/DIC/HOBt:1.5/4/2当量(相对于树脂)手动引入Fmoc-PEG12-OH。反应在室温进行过夜。TNBS试验允许监测偶联效率。在用哌啶/DMF溶液(20％，3*5min)进行Fmoc去保护后，使用aa/DIEA/COMU:3/8/3当量在室温下3h，最终将Fmoc-βALa-OH偶联到游离的N-端。TNBS试验允许监测偶联效率，并使用20％哌啶在DMF中的溶液除去Fmoc(3*5min)。

使用包含TFA/TIS/H2O/EDT:94/2/2/2的溶液在室温(RT)下至少2小时，裂解下来树脂结合的肽。每克树脂使用最少15mL裂解溶液。然后使用冰冷的醚沉淀粗品肽，以3000rpm离心8min，并在H₂O/0.1％TFA中冷冻干燥。获得白色固体并且不需任何进一步纯化直接用于下一步骤中。

偶联物H-SEQ ID NO：1-NH₂、H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH₂和H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH₂的环化：

通过来自于采取L或D构型的两个适合保护的Cys或Pen的两个硫醇官能团的分子内环化，获得二硫桥。AcOH、K3[Fe(CN)6]和碳酸铵购自Sigma-Aldrich。将粗品H-SEQ IDNO：1-NH₂、H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH₂和H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：13-NH₂偶联物溶解在AcOH 0.5％中，以获得0.5mg/mL的终浓度。向所述肽溶液添加碳酸铵(2N)，以达到8-9的近似碱性的pH。然后向反应混合物添加K₃[Fe(CN)₆](0.01N)，直至观察到明亮且持久的黄色。通过分析RP-HPLC进行反应的监测。通常反应在少于30min内是定量的。将反应混合物在0.45μm膜上过滤并通过制备RP-HPLC进行纯化。收集纯度高于95％的级分并冷冻干燥，给出纯白色粉末(最终纯度>95％)。所述纯的合成肽的均一性和身份通过分析RP-HPLC来评估。通过以正离子模式使用的LCQ Fleet(ThermoFisher)上的ESI质谱术，令人满意地检查了所述肽的身份。

NODAGA和DOTA与H-SEQ ID NO：1-NH₂、H-βAla-PEG12-SEQ ID NO：1-NH2和H-βAla- PEG12-SEQ ID NO：13-NH2的偶联：

使用NODAGA单-N-羟基琥珀酰亚胺(NODAGA-NHS)和DOTA单-N-羟基琥珀酰亚胺(DOTA-NHS)的活化的酯，将螯合剂偶联到所述肽。

NODAGA-NHS和DOTA-NHS从Chematech(Dijon,France)获得。

向DMF中的肽溶液(1.2mM)添加螯合剂(4eq)和DIEA(10eq)。允许反应混合物在室温下搅拌。通过分析RP-HPLC监测反应，评估所述反应是定量的。将反应混合物在0.45μm膜上过滤并通过制备RP-HPLC进行纯化。收集纯度高于95％的级分并冷冻干燥，给出纯白色粉末(最终纯度>95％)。所述纯的合成肽的均一性和身份通过分析RP-HPLC来评估。通过以正离子模式使用的LCQ Fleet(ThermoFisher)上的ESI质谱术，令人满意地检查了所述肽的身份。

实施例7：MG04/VH-DO35、CH44、FG770、CH40和FG769对LDLR的亲和性(K_D)的表面等离子体共振(SPR)确定。

偶联物对LDLR的(K_D)

表II：偶联物CH40、FG769、CH44、FG770和MG04的LDLR亲和性

实施例8：在肾上腺肿瘤的皮下小鼠模型中⁶⁸Ga-CH44及其乱序对应物⁶⁸Ga-CH40的 PET成像

本实施例的目的是使用PET扫描来评估靶向LDLR的偶联物(⁶⁸Ga-CH44)及其乱序对应物(⁶⁸Ga-CH40)在静脉内给药到移植有肾上腺癌的小鼠(异种移植模型)后的生物分布。使用¹⁸F-FDG作为对照。

材料

放射性标记

使用⁶⁸Ga氯化物对CH44和CH40进行放射性标记。使用商业化的基于TiO2的⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器(Obninsk)以⁶⁸Ga³⁺的形式获得镓。通过将20μg NODAGA-CH44和40μg NODAGA-CH40与74–148MBq(2-4mCi)的⁶⁸Ga在200μL乙酸铵缓冲液(4M，pH 6)中，在25℃下反应15分钟来进行放射性标记反应。

为⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40获得的比活性分别为12,5Bq/mmol和5,5Bq/mmol。

肿瘤植入

动物研究按照Aix-Marseille伦理委员会批准的方案(Comity 14)进行。4周龄雄性BALB/c裸小鼠从Charles River Inc.获得。将小鼠在上胁部中用150μL含有50％基质胶(Corning)的完全培养基中的NCI-H295R细胞(7×10⁶)皮下植入。当肿瘤达到700-1500mm³之间的体积时，将小鼠用于成像实验。

给药途径、剂量和实验设计

通过以10±4MBq的剂量静脉内单次快速浓注⁶⁸Ga-CH44或⁶⁸Ga-CH40，动物接受所述试验物质。

将6只小鼠用NCI-H295R肾上腺癌细胞植入。在植入后第14天，以24小时的间隔时间将所述动物分别用¹⁸F-FDG、⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40静脉内给药。在植入后第32天，将所述动物用⁶⁸Ga-CH44，然后在24小时后用⁶⁸Ga-CH40静脉内给药。在每次给药后，使用PET成像评估在肾上腺癌异种移植物和其他组织中的生物分布。

PET扫描

对一组(n＝5-7)裸小鼠i.v.给药10±4MBq的⁶⁸Ga-CH44，并在注射后(p.i.)1h获取PET/CT扫描。PET和PET/CT研究在microPET/microCT啮齿动物模型扫描机(nanoPET/Mediso)上进行。麻醉用5％异氟烷引起并用1,5％异氟烷维持。为了提高图像质量，对于每次静态PET发射扫描(能量窗，400-600keV；时间：一次FOV 20分钟)来说，为每只小鼠获取2千万个符合事件。对于双模态PET/CT来说，获得CT图像(35kVp，曝光时间350ns，中等缩放)，并将解剖登记以及校正的衰减应用于相应的PET扫描。在第一次注射后6小时，对同一组裸小鼠给药10±4MBq的⁶⁸Ga-CH40并在注射后(p.i.)1小时获取PET/CT扫描，这一系列获取构成我们的对照组。

结果

PET成像

在第14天对所有三种化合物进行图像获取，并在第32天对⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40进行图像获取。在第14天，用¹⁸F-FDG注射的动物的成像照片显示出在肿瘤位点处没有显著的积累(图6A)。

相反，在第14天(图6B和C)和32天(图7A和B)，成像照片显示在大多数动物中，⁶⁸Ga-CH44与⁶⁸Ga-CH40相比显著积累。

结论

实验在大多数动物中显示出在第14和32天，⁶⁸Ga-CH44对肾上腺癌的清晰且选择性的成像和标记。

实施例9：在肾上腺肿瘤的皮下小鼠模型中⁶⁸Ga-FG770及其乱序对应物⁶⁸Ga-FG769 的PET成像

本实施例的目的是使用PET扫描来评估靶向LDLR的偶联物(⁶⁸Ga-FG770)及其乱序对应物(⁶⁸Ga-FG769)在静脉内给药到移植有肾上腺癌的小鼠(异种移植模型)后的生物分布。在本研究中使用的笼是DOTA而不是NODAGA。

材料

放射性标记

使用⁶⁸Ga氯化物对FG770和FG769进行放射性标记。使用商业化的基于TiO2的⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器(Obninsk)以⁶⁸Ga³⁺的形式获得镓。通过将20μg DOTA-FG770和20μg DOTA-FG769与74–148MBq(2-4mCi)的⁶⁸Ga在100μL乙酸铵缓冲液(2M，pH 4,5)中，在95℃下反应15分钟来进行放射性标记反应。

为⁶⁸Ga-FG770和⁶⁸Ga-FG769获得的比活性分别为6,45Bq/mmol和6,16Bq/mmol。

肿瘤植入

给药途径、剂量和实验设计

通过以10±4MBq的剂量静脉内单次快速浓注⁶⁸Ga-FG770或⁶⁸Ga-FG769，动物接受所述试验物质。

将6只小鼠用NCI-H295R肾上腺癌细胞植入。在植入后第37天，以24小时的间隔时间将所述动物分别用⁶⁸Ga-FG770和⁶⁸Ga-FG769静脉内给药。在给药后，使用PET成像评估在肾上腺癌异种移植物和其他组织中的生物分布。

PET扫描

对一组(n＝3)裸小鼠静脉内给药10±4MBq的⁶⁸Ga-FG770，并在注射后(p.i.)1h获取PET/CT扫描。PET和PET/CT研究在microPET/microCT啮齿动物模型扫描机(nanoPET/Mediso)上进行。麻醉用5％异氟烷引起并用1,5％异氟烷维持。为了提高图像质量，对于每次静态PET发射扫描(能量窗，400-600keV；时间：一次FOV 20分钟)来说，为每只小鼠获取2千万个符合事件。对于双模态PET/CT来说，获得CT图像(35kVp，曝光时间350ns，中等缩放)，并将解剖登记以及校正的衰减应用于相应的PET扫描。

在第一次注射后24小时，对同一组裸小鼠给药10±4MBq的⁶⁸Ga-FG769并在注射后(p.i.)1h和4h获取PET/CT扫描。所述PET图像的定量感兴趣区域(ROI)分析，使用Interviewfusion在衰减和衰变校正过的PET图像上进行。

结果

PET成像

在第37天对两种化合物⁶⁸Ga-FG770和⁶⁸Ga-FG769进行图像获取。成像照片显示出在大多数动物中，⁶⁸Ga-FG770与⁶⁸Ga-FG769相比的显著积累(分别为图8A和8B)。

结论

实验在大多数动物中显示出在第37天，⁶⁸Ga-FG770对肾上腺癌的清晰且选择性的成像和标记。

实施例10：在胰腺癌的皮下小鼠模型中⁶⁸Ga-CH44及其乱序对应物⁶⁸Ga-CH40的PET 成像

本实施例的目的是使用PET扫描来评估靶向LDLR的偶联物(⁶⁸Ga-CH44)及其乱序对应物(⁶⁸Ga-CH40)在静脉内给药到移植有胰腺癌的小鼠(异种移植模型)后的生物分布。使用¹⁸F-FDG作为对照。

材料

放射性标记

使用⁶⁸Ga氯化物对CH44和CH40进行放射性标记。使用商业化的基于TiO2的⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器(Obninsk)以⁶⁸Ga³⁺的形式获得镓。通过将20μg CH44和40μg CH40与74–148MBq(2-4mCi)的⁶⁸Ga在200μL乙酸铵缓冲液(4M，pH 6)中，在25℃下反应15分钟来进行放射性标记反应。

为⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40获得的比活性分别为12,5Bq/mmol和5,5Bq/mmol。

肿瘤植入

动物研究按照Aix-Marseille伦理委员会批准的方案(Comity 14)进行。4周龄雄性BALB/c裸小鼠从Charles River Inc.获得。将小鼠在肩膀之间用150μL完全培养基中的Pk4a细胞(1×10⁶)皮下植入。当肿瘤达到700-1500mm³之间的体积时，将小鼠用于成像实验。

给药途径、剂量和实验设计

通过以10±4MBq的剂量静脉内单次快速浓注⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40，动物接受所述试验物质。

将小鼠(n＝5至6)用Pk4a胰腺癌细胞植入。在植入后第4天，以24小时的间隔时间将所述动物分别用¹⁸F-FDG、⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40静脉内给药。在植入后第12天，将所述动物用⁶⁸Ga-CH44，然后在24小时后用⁶⁸Ga-CH40静脉内给药。

在每次给药后，使用PET成像评估在胰腺癌异种移植物和其他组织中的生物分布。

PET扫描

对一组(n＝5至7)裸小鼠i.v.给药10±4MBq的⁶⁸Ga-CH44，并在注射后(p.i.)1小时获取PET/CT扫描。PET和PET/CT研究在microPET/microCT啮齿动物模型扫描机(nanoPET/Mediso)上进行。麻醉用5％异氟烷引起并用1,5％异氟烷维持。为了提高图像质量，对于每次静态PET发射扫描(能量窗，400-600keV；时间：一次FOV 20分钟)来说，为每只小鼠获取2千万个符合事件。对于双模态PET/CT来说，获得CT图像(35kVp，曝光时间350ns，中等缩放)，并将解剖登记以及校正的衰减应用于相应的PET扫描。在第一次注射后6小时，对同一组裸小鼠给药10±4MBq的⁶⁸Ga-CH40并在注射后(p.i.)1小时获取PET/CT扫描，这一系列获取构成对照组。

结果

PET成像

在第4天对¹⁸F-FDG、⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40进行图像获取，并在第12天对⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40进行图像获取。在第4天，由于肿瘤尺寸小，各种不同化合物没有显著积累(分别为图9A至9C)。然而，成像照片显示，在大多数动物中，在第12天⁶⁸Ga-CH44与⁶⁸Ga-CH40相比显著积累(分别为图10A至10B)。

结论

实验显示出在第12天，⁶⁸Ga-CH44对胰腺癌的清晰且选择性的成像和标记。

实施例11：在成胶质细胞瘤的原位小鼠模型中⁶⁸Ga-CH44及其乱序对应物⁶⁸Ga- CH40的PET成像

本实施例的目的是使用PET扫描来评估靶向LDLR的偶联物(⁶⁸Ga-CH44)及其乱序对应物(⁶⁸Ga-CH40)在静脉内给药到移植有成胶质细胞瘤的小鼠(异种移植模型)后的生物分布。还在第21天针对在成胶质细胞瘤的几个临床调查中使用的整合蛋白特异性标志物⁶⁸Ga-RGD进行了比较。

材料

放射性标记

为⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40获得的比活性分别为12,5Bq/mmol和5,5Bq/mmol。⁶⁸Ga-RGD的比活性为7,35Bq/mmol。

肿瘤植入

动物研究按照Aix-Marseille伦理委员会批准的方案(Comity 14)进行。6周龄雄性BALB/c裸小鼠从Charles River Inc.获得。将小鼠在脑纹状体中(前卤前方1mm、侧向2mm，并且深度为3mm)用5μLPBS中的U87MG细胞(5×10⁵)植入。小鼠在注射后J14和J21用于成像实验，预期体积分别为9和53mm³。

给药途径、剂量和实验设计

通过以8±4MBq的剂量静脉内单次快速浓注⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40，动物接受所述试验物质。

将小鼠(n＝6)用U87MG成胶质细胞瘤细胞植入。在植入后第14天，以24小时的间隔时间将所述动物分别用⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40静脉内给药。在植入后第21天，将所述动物以24小时和72小时的间隔时间分别用¹⁶⁸Ga-CH44、⁶⁸Ga-CH40和⁶⁸Ga-RGD静脉内给药。

在每次给药后，使用PET成像评估在成胶质细胞瘤和其他组织中的生物分布。

PET扫描

对一组(n＝6)裸小鼠i.v.给药8±4MBq的⁶⁸Ga-CH44，并在注射后(p.i.)1小时获取PET/CT扫描。PET和PET/CT研究在microPET/microCT啮齿动物模型扫描机(nanoPET/Mediso)上进行。麻醉用5％异氟烷引起并用1,5％异氟烷维持。为了提高图像质量，对于每次静态PET发射扫描(能量窗，400-600keV；时间：一次FOV 20分钟)来说，为每只小鼠获取2千万个符合事件。对于双模态PET/CT来说，获得CT图像(35kVp，曝光时间350ns，中等缩放)，并将解剖登记以及校正的衰减应用于相应的PET扫描。在第一次注射后6小时，对同一组裸小鼠给药8±4MBq的⁶⁸Ga-CH40并在注射后(p.i.)1小时获取PET/CT扫描，这一系列获取构成我们的对照组。

结果

PET成像

在第14天对⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-CH40进行图像获取，并在第21天对⁶⁸Ga-CH44、⁶⁸Ga-CH40和⁶⁸Ga-RGD进行图像获取。成像照片显示对于6只小鼠中的4只来说，在第14天出现⁶⁸Ga-CH44的信号，并且在第16天对于⁶⁸Ga-CH40来说没有显著信号(分别为图11A和11B)。在第21天，所有6只小鼠显示出高的⁶⁸Ga-CH44信号，明显比⁶⁸Ga-CH40或⁶⁸Ga-RGD的弱信号更强(分别为图11C、11D、11E)。为了对成像信号定量，进行了肿瘤/对照比率的分析。所述定量表明⁶⁸Ga-CH44比⁶⁸Ga-CH40或⁶⁸Ga-RGD更显著地积累(约4倍)(图12).

结论

实验显示出在第21天，⁶⁸Ga-CH44对成胶质细胞瘤的清晰且选择性的成像和标记。

实施例12：在肾上腺肿瘤的皮下小鼠模型中⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-MG04的PET成像

本实施例的目的是使用PET扫描来评估和比较两种靶向LDLR的偶联物，一种具有NODAGA笼(⁶⁸Ga-CH44)，另一种具有DOTA笼并且没有间隔物(S)(⁶⁸Ga-MG04)，在静脉内给药到移植有肾上腺癌的皮下模型(异种移植模型)后的生物分布。

材料

放射性标记

使用⁶⁸Ga氯化物对CH44和MG04进行放射性标记。使用商业化的基于TiO2的⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器(Obninsk)以⁶⁸Ga³⁺的形式获得镓。通过将20μg CH44与⁶⁸Ga在200μL乙酸铵缓冲液(4M，pH 6)中，在25℃下反应15分钟来进行放射性标记反应。通过将20μg MG04与⁶⁸Ga在200μL乙酸铵缓冲液(pH 4)中，在100℃下反应10分钟来进行放射性标记反应。

为⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-MG04获得的比活性分别为331,3±10,5MBq/g和449,7±148,1MBq/g。络合性能对于⁶⁸Ga-MG04来说为91±16,9％，对于⁶⁸Ga-CH44来说为97±1,4％。

肿瘤植入

动物研究按照Clermont-Auvergne大学批准的方案进行。4周龄雄性BALB/c裸小鼠从Charles River Inc.获得。将小鼠在颈底部处用150μL含有50％基质胶(Corning)的完全培养基中的NCI-H295R细胞(7×10⁶)皮下植入。当肿瘤达到200-400mm³之间的体积时，将小鼠用于成像实验。

给药途径、剂量和实验设计

通过在150,8±40,3μL的体积中以21.6±3.6MBq的⁶⁸Ga-CH44或⁶⁸Ga-MG04的剂量静脉内单次快速浓注，动物接受所述试验物质。

将6只小鼠用NCI-H295R肾上腺癌细胞植入。在植入后第48天，以48小时的间隔时间将所述动物分别用⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-MG04静脉内给药。在每次给药后，使用PET成像评估在肾上腺癌异种移植物和其他组织中的生物分布。

PET扫描

对一组(n＝2)裸小鼠i.v.给药21.6±3.6MBq的⁶⁸Ga-CH44，并在注射后(p.i.)1h获取PET/CT扫描。PET和CT研究在microPET啮齿动物模型(eXplore Vista,GE Healthcare)和microCT啮齿动物模型(eXploreCT120,GE Healthcare)上进行。麻醉用5％异氟烷引起并用1,5％异氟烷维持。为了提高图像质量，对于每次静态PET发射扫描(能量窗，250-700keV；时间：一次FOV 5分钟)来说，为每只小鼠获取2千万个符合事件。对于双模态PET/CT来说，获得CT图像(70kVp，曝光时间32ns，中等缩放)，并将解剖登记以及校正的衰减应用于相应的PET扫描。在⁶⁸Ga-CH44注射后48小时，对同一组裸小鼠给药21.6±3.6MBq的⁶⁸Ga-MG04，并在注射后(p.i.)1小时获取PET/CT扫描，这一系列获取构成第二组。

结果

PET成像

在第48天对⁶⁸Ga-CH44进行图像获取。48h小时后对⁶⁸Ga-MG04进行图像获取。在第48天(图13A)和50天(图13B)，成像照片显示出⁶⁸Ga-CH44和⁶⁸Ga-MG04的显著积累(黄色箭头＝肿瘤，蓝色箭头＝肾脏)。此外，与⁶⁸Ga-CH44相比对⁶⁸Ga-MG04的肿瘤摄入高出73％。图像被显示为具有相同阈值(SUVmin＝0；SUVmax＝1)。SUV(标准化摄入值)：

其中，MBq＝兆贝克勒尔，g＝克。

结论

实验显示出⁶⁸Ga-MG04和⁶⁸Ga-CH44两种分子对肾上腺癌的清晰且选择性的成像和标记，其中对于⁶⁸Ga-MG04来说在肿瘤摄入上具有优势(73％)。

序列表

<110> 维克塔-霍洛斯公司（VECT-HORUS）

法国国家科学研究中心（CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE）

<120> 用于癌症成像和放疗的组合物和方法

<130> B2420PC00

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Cys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X是Thz

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X是Pen

<400> 1

Xaa Met Xaa Arg Leu Arg Gly Xaa

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Cys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X是Thz

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X是Sar

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X是Pen

<400> 2

Xaa Met Xaa Arg Leu Arg Xaa Xaa

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Cys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X是Pip

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X是Sar

<400> 3

Xaa Met Xaa Arg Leu Arg Xaa Cys

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Cys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X是Pip

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X是Pen

<400> 4

Xaa Met Xaa Arg Leu Arg Gly Xaa

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Cys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X是Pip

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> X是Sar

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> X是Pen

<400> 5

Xaa Met Xaa Arg Leu Arg Xaa Xaa

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<400> 6

Cys Met Pro Arg Leu Arg Gly Cys

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Cys

<400> 7

Xaa Met Pro Arg Leu Arg Gly Cys

1 5

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<400> 8

Asp Ser Gly Leu Cys Met Pro Arg Leu Arg Gly Cys Asp Pro Arg

1 5 10 15

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Pen

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X是Thz

<400> 9

Xaa Met Xaa Arg Leu Arg Gly Cys

1 5

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 10

cttggcatta tgcacctcca 20

<210> 11

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物C

<400> 11

ctggccagct agcactcagc aaccgcgaag acgaggcata caagcacctt tacccggaga 60

cagggag 67

<210> 12

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物D

<400> 12

ctggccagct agcactcgca gggtctgccc agcattctgc aagcaccttt acccggagac 60

agggag 66

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 乱序肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> X是(D)-Cys

<400> 13

Xaa Arg Pro Leu Gly Arg Met Cys

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 乱序肽

<400> 14

Cys Arg Met Leu Gly Arg Pro Cys

1 5

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