一种主动靶向型pet/mr双模态影像纳米探针及其制备方法
阅读说明：本技术 一种主动靶向型pet/mr双模态影像纳米探针及其制备方法 (Active targeting PET/MR bimodal imaging nanoprobe and preparation method thereof ) 是由 焦举 樊海明 张勇 邱莹 张欢 邹琼 陈光锋 于 2021-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针及其制备方法。具体公开了一种主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针,所述纳米探针的组成包括纳米颗粒内核、放射性核素和靶向短肽；所述纳米颗粒内核为羧基修饰的锰铁氧体纳米颗粒；所述放射性核素为～(68)Ga。本发明所提供的主动靶向型双模态影像探针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)阳性的前列腺癌的探测具有较高的灵敏性及特异性,能够有效富集在前列腺肿瘤部位,提高肿瘤组织与正常组织的对比度,有望作为一种新型PET/MRI双模态影像探针应用于临床前列腺癌的精确诊断。(The invention discloses an active targeting PET/MR bimodal imaging nanoprobe and a preparation method thereof. The active targeting PET/MR bimodal imaging nanoprobe comprises a nanoparticle kernel, radionuclide and targeting short peptide; the inner core of the nano-particle is a manganese ferrite nano-particle modified by carboxyl; the radionuclide is 68 Ga. The active targeting type bimodal imaging probe provided by the invention has higher sensitivity and specificity for detecting prostate cancer positive by Prostate Specific Membrane Antigen (PSMA), and canCan be effectively enriched at the prostate tumor part, improves the contrast ratio of tumor tissues and normal tissues, and is expected to be used as a novel PET/MRI bimodal imaging probe for accurate diagnosis of clinical prostate cancer.)
技术领域
本发明涉及纳米材料医学应用技术领域，更具体地，涉及一种主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针及其制备方法。
背景技术
肿瘤的早期诊断对患者的有效治疗及预后具有重要意义，单一模式的影像学检测可能会顾此失彼，而多模式影像有望实现各模式之间的优势互补，提高肿瘤诊断的精确性。例如，磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)技术具有不受信号穿透深度限制、无电离辐射、软组织分辨率高、临床适用范围广等优势，在临床肿瘤诊断与分期方面有着重要的作用。然而，MRI存在灵敏度较低，难以进行全身扫描，无法获得定量的图像等问题，限制了其在分子影像方面的应用。而正电子发射计算机断层扫描(Positron EmissionComputed Tomography,PET)显像技术具有高灵敏度，可在分子水平上提供功能及代谢信息的特点，但也存在空间分辨率低的问题。若将两种成像模式有效的结合起来，可以同时兼顾功能性与解剖学信息，提高疾病诊断的灵敏性、准确性和量化能力，以获得更全面的影像分析结果，有望在癌症发展的早期阶段识别微小病变，因此开发高分辨、高灵敏的PET/MRI双模态影像探针显得尤为重要。
超小尺寸的磁性纳米材料因其在纳米尺度上独特的磁学特性、弛豫性能可调控、优异的体内稳定性、表面易修饰以及良好的生物安全性等特点，广泛应用于T1磁共振对比剂的研究中，其主要具有以下三方面的优势：(1)安全性高。当通过静脉注射后，氧化铁纳米颗粒通常会在肝和脾中自然降解，随后进入铁代谢途径，成为人体必需铁元素的一部分。(2)可修饰性强。不同的表面修饰可以通过影响纳米粒子和生物分子间的作用，控制其细胞摄取量的多少和生物分布情况。除此之外，纳米尺度下较高的比表面积为表面配体的修饰提供了更多的位点。(3)制备过程简单。合成方法多种多样，结晶度也显著提高，且它们的尺寸可调，性能可控。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种在前列腺癌中过表达的跨膜蛋白，其在前列腺癌细胞膜中的表达量是正常细胞的100～1000倍，因而被视为一个前列腺癌的重要靶点。谷氨酸尿素类似物(Glu-urea-Lys,Glu)已被证明可以与PSMA进行特异性结合，且已成功应用于临床诊断，具有高度的靶向性和安全性。而在临床PET成像检查中，18F-FDG是应用最广泛的一种小分子正电子发射显影剂，它是通过利用肿瘤细胞的高代谢活性从而被其摄取来反应肿瘤组织的位点，但其缺乏有效的靶向性以及难以区分恶性病变与炎症病变导致误诊，68Ga(t1/2＝67.7min)作为18F(T1/2＝109.8min)的代替核素受到了越来越多研究者的关注，它的优点有：(1)高的正电子产率(89％)；(2)相对易得，通过放射性核素发生器即可产生，与传统的重型回旋加速器相比，成本较低，制备过程简单易得；(3)半衰期相对较短(t1/2＝67.7min)，在保证临床检查的需求下有效地减少了对患者的辐射剂量。(4)金属离子更易稳定且高效连接在螯合剂上，放射化学产率较高。
据文献报道，近年来在探索恶性肿瘤精准诊疗时发现，关键环节是成像靶点的选择和高效特异性分子探针的合成。发明人以往的研究发现，通过将超小锰铁氧体纳米颗粒(UMFNPs)与肿瘤靶向五肽CREKA(cys-arg-glul-lysa-ala)偶联，表现出趋化靶向激活能力，可以准确检测到乳腺癌转移，检测乳腺癌转移的最小检出限为0.39mm，明显高于以往报道的MRI探针的检出限(A Bioinspired Nanoprobe with Multilevel Responsive T1-Weighted MR Signal-Amplification Illuminates Ultrasmall Metastases[J].Advanced Materials,2020,32(4).)。目前，对于前列腺癌的诊断存在病灶检出率低、灵敏度不足等问题，因此亟需一种应用于临床前列腺癌的精确诊断的新型影像探针。
发明内容
本发明的目的是为了克服前列腺癌病灶的检出率低及灵敏度不足等问题，提供一种同时具有前列腺癌主动靶向、T1-MR和PET双模态成像的影像纳米探针及其制备方法。
本发明的第一个目的在于提供一种锰铁氧体纳米颗粒的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供所述锰铁氧体纳米颗粒的制备方法制备得到的锰铁氧体纳米颗粒。
本发明的第三个目的在于提供所述锰铁氧体纳米颗粒在制备纳米药物或影像纳米探针中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针。
本发明的第五个目的在于提供所述的主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针在制备前列腺癌PET/MR成像诊断产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明提供了一种锰铁氧体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1.将FeCl3·6H2O、芥酸和甲醇按质量体积比为(2～3g)：(9～11g)：(40～60ml)混合，加热至40～50℃进行反应，然后调节pH至沉淀析出，对所得沉淀固体洗涤纯化，得到芥酸铁配合物；
S2.将步骤S1所述芥酸铁配合物与油酸锰、油酸、油醇、苄醚混合均匀，在惰性气氛下加热至100～110℃后，以4～6℃/min的反应速率将该体系升温至250～270℃，回流反应后得到棕色产物；
S3.将步骤S2所述棕色产物分散于三氯甲烷中，加入有机溶剂后进行离心，离心后的沉淀重悬，即得锰铁氧体纳米颗粒；其中三氯甲烷与有机溶剂的体积比为1：(1～1.5)；
步骤S2所述芥酸铁配合物与油酸锰、油酸、油醇、苄醚的摩尔比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(1～2)：(5～6)：(40～50)。
优选地，步骤S1所述FeCl3·6H2O、芥酸和甲醇的质量体积比为2.7g：10.2g：50ml；步骤S2所述芥酸铁配合物与油酸锰、油酸、油醇、苄醚的摩尔比为1：1：2：6：50。
更优选地，将FeCl3·6H2O、芥酸和甲醇按质量体积比为2.7g：10.2：50ml混合均匀，加热至40℃以形成澄清透亮的溶液，随后逐滴加入氢氧化钠溶液并反应15～20分钟，反应结束后用甲醇和去离子水交替洗涤红棕色的沉淀，得到芥酸铁配合物。
优选地，所述步骤S1中，油酸锰的合成方法为将四水合二氯化锰和油酸按摩尔比1：2溶解于甲醇溶剂中。
优选地，所述步骤S2中，将步骤S1所述芥酸铁配合物与油酸锰、油酸、油醇、苄醚混合均匀，在惰性气氛下加热至110℃后，以5℃/min的反应速率将该体系升温至265℃，并回流保持30min，然后快速冷却至室温，得到棕色产物。
优选地，步骤S3中，所述棕色产物分散于三氯甲烷中，加入甲醇作为沉淀剂进行离心，离心后的沉淀用三氯甲烷重新分散，即得锰铁氧体纳米颗粒；其中三氯甲烷与甲醇的体积比为1：1。
本发明要求保护所述锰铁氧体纳米颗粒的制备方法制备得到的锰铁氧体纳米颗粒。
所述锰铁氧体纳米颗粒在制备纳米药物或影像纳米探针中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供一种主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针，其特征在于，所述纳米探针的组成包括权利要求4所述锰铁氧体纳米颗粒、放射性核素和靶向短肽；所述的锰铁氧体纳米颗粒还修饰有羧基；所述靶向短肽为谷氨酸尿素类似物Glu-urea-Lys。
优选地，所述锰铁氧体纳米颗粒通过与3,4-二羟基苯基丙酸反应修饰上羧基，3,4-二羟基苯基丙酸与锰铁氧体纳米颗粒的质量比为4～6：2。
更优选地，3,4-二羟基苯基丙酸与锰铁氧体纳米颗粒的质量比为5：2。
优选地，所述放射性核素为68Ga。
本发明要求保护所述的主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针在制备前列腺癌PET/MR成像诊断产品中的应用。
所述的主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
S11.将3,4-二羟基苯基丙酸、所述的锰铁氧体纳米颗粒和四氢呋喃按质量体积比为(4～6mg)：2mg：0.7ml混合加热反应，调节pH至沉淀析出，离心收集沉淀后重悬，即得修饰有羧基的锰铁氧体纳米颗粒；
S12.将步骤S11所述锰铁氧体纳米颗粒的羧基活化后，与靶向短肽、金属螯合剂进行共价反应，透析纯化后得到具有靶向能力的锰铁氧体纳米颗粒；
S13.将步骤S12所述的具有靶向能力的锰铁氧体纳米颗粒与放射性68GaCl3溶液混合反应，采用脱盐柱对反应产物进行纯化，即得所述主动靶向型PET/MR双模态影像纳米探针。
优选地，所述步骤S11中，3,4-二羟基苯基丙酸、所述的锰铁氧体纳米颗粒和四氢呋喃的质量体积比为5mg：2mg：0.7ml。
优选地，所述步骤S11中，将3,4-二羟基苯基丙酸溶于四氢呋喃后，再逐滴加入溶于四氢呋喃的锰铁氧体纳米颗粒溶液，50～55℃加热回流反应2～3h；然后滴加0.5～0.6mM氢氧化钠溶液以沉淀纳米粒子，离心收集沉淀后重悬，即得修饰有羧基的锰铁氧体纳米颗粒。
更优选地，所述离心的条件为5000r/min离心10min。
优选地，所述步骤S12中，首先将所述的锰铁氧体纳米颗粒通过EDC/NHS反应进行羧基活化，然后将靶向短肽、金属螯合剂与羧基活化后的纳米颗粒按质量体积比为(1～2mg)：(15～20mg)：(15～20mg)进行共价偶联后，对反应产物进行透析纯化，随后将金属螯合剂加入透析产物中，调节pH至7～9，透析纯化后得到具有靶向能力的锰铁氧体纳米颗粒；所述金属螯合剂为大环螯合剂NOTA-NHS-ester。
优选地，靶向短肽、金属螯合剂与羧基活化后的纳米颗粒按质量体积比为1mg：20mg：20mg。
更优选地，调节pH的方法为：用1M氢氧化钠水溶液调pH至7～9之间，室温摇床反应24h。
更优选地，所述透析纯化的方法为：用3kDa透析袋透析48小时。
以上所述锰铁氧体纳米颗粒为超小锰铁氧体纳米颗粒，简称为UMFNPs，尺寸为2～4nm；所述PET/MR双模态影像纳米探针，简称为68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu，尺寸为10～20nm，弛豫率为8.18mM-1s-1，放化纯度为97％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明制备得到一种超小锰铁氧体纳米颗粒(UMFNPs)，尺寸为2～4nm；以超小锰铁氧体纳米颗粒为平台，选用前列腺癌靶向分子谷氨酸尿素类似物(Glu-urea-Lys)对其进行功能化修饰，最后通过特定的金属螯合剂NOTA-NHS-ester将放射性核素68Ga标记在锰铁氧体纳米颗粒上，既具备PET/MR双模态成像能力，同时又可利用特异性受体结合，提高对前列腺癌诊断的精确性。本发明使用超小尺寸的锰铁氧体纳米颗粒，在血液中循环时间长，可有效增加肿瘤部位的富集量，且与传统临床上的钆基T1磁共振对比剂相比，生物毒性低，安全性好。
(2)本发明制备的双模态影像纳米探针68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu具有较低的r2/r1值为2.9，以及较高的r1弛豫率为8.32mM-1s-1，是商用钆基T1对比剂的两倍。同时，其放化产率高达97％，在PBS和FBS溶液中放置4小时后，放化产率仍在90％以上，显示出良好的稳定性。本发明的影像纳米探针68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu可被PSMA高表达的LNCaP细胞大量吞噬，表现出良好的肿瘤细胞靶向作用。
(3)本发明所提供的主动靶向型双模态影像探针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)阳性的前列腺癌的探测具有较高的灵敏性及特异性，能够有效富集在前列腺肿瘤部位，提高肿瘤组织与正常组织的对比度，可作为一种新型PET/MRI双模态影像探针应用于临床前列腺癌的精确诊断。
附图说明
图1为实施例中68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu的合成示意图；
图2为实施例1中UMFNPs的表征鉴定结果图；A为油相UMFNPs的透射电子显微镜(TEM)图及其对应的粒径分布图；B为油相UMFNPs的XRD图；C为油相UMFNPs的VSM图；
图3为实施例2中NOTA-UMFNPs-Glu的表征鉴定结果图；A为修饰了Glu-urea-Lys和NOTA的水相纳米颗粒NOTA-UMFNPs-Glu的TEM图；B为NOTA-UMFNPs-Glu的水合粒径分析图；C为UMFNPs表面改性前后的红外光谱对比示意图(黑色曲线表示油相的UMFNPs，红色结果图；表示DHCA修饰后的水相UMFNPs-DHCA，蓝色结果图；表示靶向分子和金属螯合剂修饰后的水相NOTA-UMFNPs-Glu)；D为UMFNPs表面改性前后的热重曲线图(黑色表示UMFNPs-DHCA，蓝色表示DHCA修饰后的UMFNPs-Glu，红色表示靶向分子和金属螯合剂修饰后的NOTA-UMFNPs-Glu)；
图4为实施例2中NOTA-UMFNPs-Glu的特征结果图；A为NOTA-UMFNPs-Glu的T1磁共振二维成像图及r1弛豫率；B为NOTA-UMFNPs-Glu的r2弛豫率分析图；
图5为实施例2中NOTA-UMFNPs-Glu分别与前列腺癌(LNCaP)细胞(PSMA阳性)和PC3细胞(PSMA阴性)共培养0.5h后的荧光共聚焦成像图；
图6为实施例3中PET/MR双模态纳米影像探针的体外稳定性测试结果；A为68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu在不同时间点的纸层析色谱图；B为68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu的放射稳定性曲线图；
图7为实施例3中68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu的在体成像图；A为体内68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu的Micro-PET显像图；B为体内NOTA-UMFNPs-Glu的3T-MR显像图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1超小锰铁氧体纳米颗粒(UMFNPs)的制备及表征鉴定
一、实验方法
1、UMFNPs的制备
(1)准确称取六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)2.70g与芥酸10.20g，将其溶解在50mL甲醇溶液中，混合均匀加热至40℃以形成澄清透亮的溶液A，另取100mL烧杯加入1.2g氢氧化钠并用甲醇超声溶解无沉淀为止，将该溶液逐滴加入溶液A中，反应15分钟。
(2)反应结束后用甲醇和去离子水交替洗至无杂质析出，得到红棕色的沉淀即为芥酸铁配合物，将所得产物真空干燥后保存备用。
(3)准确称取四水合氯化锰2.0g与油酸5.7g，将其溶解在50mL甲醇溶液中，混合均匀加热至40℃以形成澄清透亮的溶液B，另取100mL烧杯加入0.8g氢氧化钠并用甲醇超声溶解无沉淀为止，将该溶液逐滴加入溶液B中，反应15分钟，得到油酸锰。
(4)准确称取1mmol(1.07g)芥酸铁配合物、1mmol(0.62g)油酸锰、2mmol(0.57g)油酸、6mmol(1.61g)油醇，加入50mmol(10g)苄醚超声溶解，将该混合物放置于50mL圆底三口烧瓶中，在氩气保护下加热到110℃，反应30分钟。进一步地，以5℃/min的反应速率将该体系升温至265℃，并回流保持30min，然后快速冷却至室温，得到棕色产物。
(5)将所得棕色产物分散在三氯甲烷中，用1：1体积的无水乙醇作为沉淀剂反复离心3次(8000r/min，10min)，弃去上清液，最后，用三氯甲烷重新分散即得到超小锰铁氧体纳米颗粒(UMFNPs)，储存在4℃备用。
2、UMFNPs的表征鉴定
使用透射电子显微镜(TEM)对UMFNPs表征：用去离子水将UMFNPs稀释至0.3～15mg/ml，30～80W超声分散5～10分钟后将其滴加在铜网上，烘干后使用TEM观察UMFNPs的形态。使用振动样品磁强计检测UMFNPs的磁化率、磁化强度。二、实验结果
结果如图2所示，图2A是UMFNPs的TEM图，可以观察到颗粒的形貌为球形，呈单分散状，用Image J对样品的不同区域进行统计分析，得到颗粒的尺寸约为3.1±0.2nm；图2B是UMFNPs的XRD图，其峰位分别对应锰铁氧体标准卡片(JCPDS 10-0319)中的(111)，(220)，(311)，(400)，(422)，(511)，(440)，(622)晶面，表明所制备的样品为尖晶石相锰铁氧体，结晶度高，无其他杂质峰出现；图2C是UMFNPs的磁滞回线，可以看出其磁化强度值随外加磁场的增加而升高，当外加磁场到达20000Oe时，接近样品的饱和磁化强度值为22.2emu/g，且从图中可以看出室温下撤去外加磁场时，颗粒无明显剩磁及矫顽力存在，显示出超顺磁性。
实施例2 NOTA-UMFNPs-Glu的制备及表征鉴定
一、实验方法
1、NOTA-UMFNPs-Glu的制备
制备的大概流程图如图1所示，具体步骤如下：
(1)首先，取实施例1制备得到的20mg油相锰铁氧体纳米颗粒(UMFNPs)溶于1mL四氢呋喃中，作为溶液A。
(2)进一步地，准确称取50mg 3,4-二羟基苯基丙酸(DHCA)溶于6mL四氢呋喃，在氩气氛围下打开磁力搅拌并缓慢升温至50℃，待DHCA完全溶解后，将溶液A逐滴加入DHCA溶液中，回流保持3h。
(3)反应结束后待其冷却至室温，向其中滴加0.5mL(0.5mM)氢氧化钠溶液以沉淀纳米粒子，5000r/min离心10min，收集沉淀产物并重新分散在2mL去离子水中待用，记为UMFNPs-DHCA。
(4)称取20mg修饰DHCA后的UMFNPs-DHCA纳米颗粒加入到2mL PBS中，接着向其中加入2mL(20mM)新配制的EDC溶液，充分混合15min，使羧基活化。
(5)向步骤(4)的溶液中加入2mL(24mM)新配制的NHS溶液与1mg的Glu-urea-Lys，待其混合均匀后，加入1.2mL(10mM)的乙二胺，室温摇床反应4h。
(6)步骤(5)的反应结束后产物用3kDa透析袋透析48h以除去未反应的小分子化合物。
(7)准确称取20mg NOTA-NHS-ester(西安凯新生物科技有限公司)溶于2ml去离子水中，将该溶液加入步骤(6)的透析产物中，用1M氢氧化钠水溶液调pH至7～9之间，室温摇床反应24h。
(8)反应结束后产物用3kDa透析袋透析48h，收集产物NOTA-UMFNPs-Glu。
2、NOTA-UMFNPs-Glu的表征鉴定
取NOTA-UMFNPs-Glu纳米粒子1～2滴悬液，滴在覆有支持膜的铜网上。待样品自然干燥后，在透射电子显微镜(TEM)下观察纳米粒子的表面形态和粒径；使用傅里红外光谱和热重分析纳米颗粒表面修饰情况。分别将1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、0.07mM和0mM的纳米粒子置于3.0T MRI成像设备中，使用T1及T2加权成像序列检测NOTA-UMFNPs-Glu纳米颗粒的T1及T2磁豫率。
3、NOTA-UMFNPs-Glu的细胞可吞噬性
将人前列腺癌(LNCaP)细胞(PSMA+)及PC3细胞(PSMA-)以3×104浓度接种于共聚焦培养皿中，过夜培养后用PBS清洗，然后分别与NOTA-UMFNPs-Glu纳米颗粒共培养30分钟；使用PBS小心清洗细胞，使用4％多聚甲醛固定细胞15分钟，DAPI染色；随后使用激光共聚焦荧光显微镜观察。
二、实验结果
图3A是NOTA-UMFNPs-Glu的TEM图，可以观察到转水(油溶性纳米颗粒转换为水溶性纳米颗粒)后颗粒的粒径及分散性无明显变化。图3B是两步功能化后颗粒的水动力学直径的变化，第一步修饰DHCA后的粒径是7.1nm，经过EDC/NHS反应修饰上Glu-urea-Lys和NOTA后，超小锰铁氧体纳米颗粒的水动力学直径增加至13.4nm，间接证明Glu-urea-Lys和NOTA的成功修饰，从光学照片中可以观察到分散在水溶液中的锰铁氧体纳米颗粒澄清透明。图3C是UMFNPs表面改性前后的红外光谱对比示意图，其中三条曲线分别对应油相UMFNPs，DHCA修饰后的水相UMFNPs以及谷氨酸尿素和NOTA修饰后的水相UMFNPs，在油相UMFNPs的曲线中，2925cm-1和2851cm-1处出现两个尖锐的吸收峰，它们分别对应油酸中-CH2的非对称和对称伸缩振动峰，经过配体交换反应转为水相后可以看到，-CH2伸缩振动的两个特征吸收峰的明显减弱，表明DHCA成功替换掉颗粒表面的油酸分子。在NOTA-UMFNPs-Glu的谱图中可以看到1682cm-1，1556cm-1，1039cm-1处有新的峰出现，分别来源于C＝O(酰胺I键)，N-H(酰胺II键)和C-N伸缩振动，表明NOTA和Glu-urea-Lys成功修饰在超小锰铁氧体纳米颗粒表面。图3D是NOTA-UMFNPs-Glu的热重结果分析，谷氨酸尿素修饰的超小锰铁氧体比DHCA修饰的超小锰铁氧体热失重增多了8.1％，NOTA-UMFNPs-Glu比UMFNPs-Glu热失重增多了7.5％，经计算可知平均每个超小锰铁氧体颗粒表面大约修饰了17个谷氨酸尿素以及14个NOTA分子。
图4A的上方是NOTA-UMFNPs-Glu在不同浓度下的T1加权二维成像图，可以看到相比于空白水溶液，随着样品浓度的升高，图像的亮信号逐渐变强，下方是NOTA-UMFNPs-Glu的r1弛豫率表征，经线性拟合得到其r1弛豫率为8.32mM-1s-1；图4B是NOTA-UMFNPs-Glu的T2弛豫率测试，由测量的T2强度绘制拟合曲线可知该探针的r2弛豫率为23.75mM-1s-1，对于T1磁共振对比剂的性能评价，除r1值以外，r2与r1的比值是另一个重要的参数，这里r2/r1的值为2.9，远小于5，展现出NOTA-UMFNPs-Glu优异的T1对比性能。
图5是NOTA-UMFNPs-Glu分别与LNCaP细胞(PSMA阳性)和PC3细胞(PSMA阴性)共培养0.5h后的荧光共聚焦成像图；其中图A为LNCaP细胞，图B为PC3细胞，其中绿色均代表染了FITC荧光素的纳米颗粒，蓝色均代表染了DAPI的细胞核，可以观察到LNCaP细胞中的绿色荧光远强于PC3细胞，说明NOTA-UMFNPs-Glu可通过PSMA有效被LNCaP细胞吞噬。
实施例3 PET/MR双模态影像纳米探针的测定及在体成像
一、实验方法
1、PET/MR双模态影像纳米探针的制备
取实施例2制备的1mg(1mg/ml)的NOTA-UMFNPs-Glu加入到180～200MBq 68GaCl3溶液中，随后向其中加入150μl(1.0mol/L)的醋酸钠水溶液将其pH调至3～3.5，70℃油浴避光反应10分钟。待反应冷却至室温后，采用PD-10脱盐柱进行纯化操作，即得到PET/MR双模态纳米影像探针68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu。
2、PET/MR双模态影像纳米探针的体外稳定性
使用纸层析法测定纳米颗粒的核素标记率及体外稳定性，使用计数仪检测其放射性比活度。
(1)PBS缓冲液(pH 7.4)中的稳定性测试：取0.5mL(约100μCi)的68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu置于0.4mL的PBS缓冲液中，在37℃下恒温孵育0.5h，1h，1.5h，2h，4h后，分别用毛细管吸取1μL标记产物利用纸层析法进行点样，然后用γ-计数器进行放化产率测试，观察其在PBS缓冲液中的稳定性变化，每组重复3次。
(2)胎牛血清(FBS)中的稳定性测试：取0.5mL(约100μCi)的68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu置于0.4mL的FBS溶液中，在37℃下恒温孵育0.5h，1h，1.5h，2h，4h后，分别用毛细管吸取1μL标记产物利用纸层析法进行点样，然后用γ-计数器进行放化产率测试，观察其在胎牛血清中的稳定性变化。
4、小鼠前列腺癌肿瘤部位的成像
选取20g左右的雄性NOD-SCID小鼠对68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu双模态探针进行体内PET/MR成像应用，所有的动物研究均是在中山大学动物保护和使用委员会的批准下进行的。
(1)PET成像：首先使用4％的水合氯醛溶液对小鼠进行麻醉(10mL/kg)，然后经小鼠尾静脉注射68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu纳米探针(约100μCi或2.7MBq)，分别在注射后的第10min，20min，30min，40min分别采用西门子Iveon micro PET/micro CT扫描仪进行横断位图像采集，所得图像在西门子工作站进行分析处理。
(2)MRI成像：首先使用4％的水合氯醛溶液对小鼠进行麻醉(10mL/kg)，然后经小鼠尾静脉注射68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu(5mg[Fe+Mn]/kg)，分别在注射后的第10min，20min，30min，40min采用临床3T磁共振扫描仪进行横断位图像采集，具体参数如下：TR＝2250ms；TE＝13ms；matrix size＝256×256；NEX＝1。
二、实验结果
图6A是PET/MR双模态纳米影像探针的体外稳定性测试结果，采用纸层析法通过临床PET扫描仪对其进行不同时间点样品的放射化学产率测定，可以观察到在相同的层析时间下，游离的68Ga3+随流动相的展开分布于层析滤纸的上端，而与锰铁氧体纳米颗粒螯合后的68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu随时间延长仍停留在点样处未发生移动，证明了68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu的成功制备。图6B是图6A量化曲线，采用γ-计数器对不同时间点样品的放射性计数进行测定，可以观察到结果显示该探针在0.01mol/L的PBS(pH 7.4)和10％FBS中37℃下共孵育4小时后，放化产率仍大于90％，上述实验结果表明68Ga标记的NOTA-UMFNPs-Glu在血清中具有良好的体外稳定性。
图7A为模型小鼠经尾静脉注射68Ga-NOTA-UMFNPs-Glu纳米探针后的Micro-PET横断位显像图，可以看到随着时间推移，肿瘤部位的放射性信号明显增强，30min后达到峰值，表明该放射性示踪剂对前列腺癌有着优异的靶向效果。同时，还研究了上述探针对小鼠尾静脉注射前后肿瘤部位MRI T1成像的增强效果：结果如图7B所示，注射该纳米探针后，肿瘤部位的亮度明显增强，清晰的勾勒出肿瘤边界，注射纳米探针30min后肿瘤部位MRI增强效果达到最佳，与PET成像结果相符，表明此纳米探针具有良好的选择性PET和MRI双模态增强成像能力；对50只雄性NOD-SCID小鼠进行成像，检出率达90％，检出周缘区前列腺癌的的敏感性和特异性分别为92.68％、84.37％。。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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