具体实施方式

本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。此类技术是本领域熟知的并且在方法学论文中详细描述，例如Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel etal.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992(定期更新)。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。分子生物学术语的普遍理解的定义可见，例如，Rieger et al.,Glossary of Genetics:Classical and Molecular,5th Edition,Springer-Verlag:New York,1991,and Lewin,Genes V,Oxford University Press:New York,1994。

冠词“一个”和“一种”(a，an)在本文中用于指冠词针对的一个或更多个(即，至少一个)语法对象。例如，“一个(an)要素”是指一个要素或多于一个要素。

术语“包含”、“包括”和“具有”以包括的、开放的意义使用，表示可以包括附加要素。本文使用的术语“例如”是非限制性的并且仅用于说明目的。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

除非上下文另有明确指示，否则本文所用的术语“或”应理解为“和/或”。

术语“试剂(agent)”在本文中用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子、或由生物材料制成的提取物。

术语“癌症”或“肿瘤”是指受试者中的任何肿瘤生长，包括初始肿瘤和任何转移。癌症可以是液体肿瘤或实体肿瘤类型。液体肿瘤包括血液来源的肿瘤，包括，例如，骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、白血病(例如，Waldenstrom综合征、慢性淋巴细胞白血病、其他白血病)、和淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)。实体瘤可以源于器官并且包括肺癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌和肝癌。

术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”可以指以异常(即增加)速率分裂的细胞。癌细胞包括但不限于癌(carcinoma)，例如鳞状细胞癌、非小细胞癌(例如，非小细胞肺癌)、小细胞癌(例如，小细胞肺癌)、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、未分化癌、支气管癌、黑色素瘤、肾细胞癌、肝癌、肝细胞癌、胆道癌(bile ductcarcinoma)、胆管癌(cholangiocarcinoma)、乳头状癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精索瘤(semonoma)、胚胎癌、乳腺癌、胃肠癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌以及头颈部区的鳞状细胞癌；肉瘤，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤和间皮肉瘤；血液系统癌症，例如骨髓瘤、白血病(例如，急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、粒细胞白血病、单核细胞白血病、淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(例如，滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、网状细胞肉瘤或霍奇金病)，以及神经系统肿瘤，包括胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤和室管膜瘤。

如本文所用的关于核酸(例如DNA或RNA)或氨基酸的术语“分离的”是指分别与其他DNA或RNA、多肽或蛋白分离的分子，这些分子存在于大分子的天然来源中。如本文所用，术语分离的还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料或培养基，或化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”或“分离的肽”意在包括核酸片段或肽片段，它们不是以片段天然存在的并且不会以天然状态被发现。

术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及在合适的情况下，核糖核酸(RNA)。该术语还应理解为包括，作为等同物，由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物，以及，作为适用于所描述的实施方案，单链(有义或反义)和双链多核苷酸。

术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”在本文中也可互换使用。

短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用的”是本领域公认的术语，并且包括除肠内和局部施用以外的施用方式，例如注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、胸膜内、血管内、心包内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内和胸腔内注射和输液。

术语“患者”、“受试者”、“哺乳动物宿主”等在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，包括人和兽类受试者。

术语“多肽”是指由与天然存在的结构变体相关的氨基酸残基组成的聚合物，和通过肽键或修饰的肽键(即，肽等排体(peptide isosteres))连接的合成的非天然存在的类似物，相关的天然存在的结构变体，及其合成的非天然存在的类似物，糖基化多肽，以及所有“模拟物”和“肽模拟物”多肽形式。合成多肽可以合成，例如，使用自动多肽合成仪。该术语可指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或指任何这些的片段、部分或亚基。术语“蛋白质”通常是指大多肽。术语“肽”通常是指短多肽。

多肽或蛋白质的“部分”是指该多肽的至少约三个连续氨基酸残基。应理解的是，多肽的一部分可以包括多肽的每个氨基酸残基。

多肽(或编码其的DNA)的“突变体”、“衍生物”和“变体”是可以在一个或更多个氨基酸(或一个或更多个核苷酸)中发生修饰或改变的多肽，使得肽(或核酸)与野生型序列不具有同一性，但与野生型多肽(或核酸)具有同源性。

多肽(或编码其的DNA)的“突变”是一个或更多个氨基酸(或一个或更多个核苷酸)发生修饰或改变，使得肽(或核酸)与本文所述的序列不具有同一性，但与野生型多肽(或核酸)具有同源性。

如本文所用，“重组”是指蛋白质源自原核或真核表达系统。

如本文所用，短语“全身施用”、“全身施用的”、“外周施用”和“外周施用的”是指将化合物、试剂或其他材料以并非直接施用于待治疗的受试者的特定组织、器官或区域(例如，大脑)的方式施用以使得其进入动物的系统，并因此经历新陈代谢和其他类似过程，例如，皮下施用。

术语“野生型”是指分别编码蛋白质或其部分，或者蛋白质序列或其部分的天然存在的多核苷酸序列，正如它通常在体内存在的那样。

在整个说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，预期组合物也可基本上由所述组分组成，或由其组成。类似地，在方法或过程被描述为具有、包括或包含特定过程步骤的情况下，过程也可基本上由所述过程步骤组成，或由其组成。此外，应当理解的是，只要本文所述的组合物和方法保持可操作，步骤的顺序或进行某些动作的顺序是无关紧要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

本文所述的实施方案涉及针对肿瘤和/或癌症细胞外基质中的癌蛋白的肽正电子发射断层扫描(PET)/单光子发射计算机断层扫描(SPECT)探针，其可用于检测、监测和/或成像在受试者中的癌症分布和/或位置和/或癌细胞转移、迁移和/或侵袭，检测和/或监测受试者中的癌细胞侵袭性和/或恶性程度，和/或确定和/或监测向有需要的受试者施用的癌症治疗和/或癌症疗法的疗效。

本文所述的PET/SPECT探针包括具有与癌胎纤连蛋白(onfFN)同种型、结构域外B纤连蛋白(EDB-FN)或结构域外A(EDA-FN)纤连蛋白特异性结合和/或络合的肽序列的靶向肽。癌症，尤其是恶性癌症，具有独特的肿瘤微环境，其可促进癌细胞存活、增殖和转移。已在多种人癌症类型(包括前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌)中发现存在onfFN。onfFN、EDB-FN和/或EDA-FN的高表达与癌症侵袭性相关，并与患者生存期成反比。发现包括与EDB-FN和/或EDB-FN特异性结合的靶向肽的PET/SPECT探针可用于检测、监测和/或成像受试者组织中的癌细胞以及确定癌细胞侵袭性、恶性程度、转移、迁移、扩散和/或侵袭。

包括靶向肽的PET/SPECT探针可以全身施用于受试者，例如通过静脉内或肠胃外施用，并且容易地靶向细胞外基质蛋白EDB-FN和/或EDA-FN以明确受试者中的癌细胞位置、分布和/或侵袭性以及肿瘤细胞边缘。

在一些实施方案中，PET/SPECT探针可以包括下式：

P-L-C

其中P是靶向肽，C是PET/SPECT造影剂；并且L是任选的接头，其共价连接肽与造影剂。

在一些实施方案中，靶向肽可以特异性结合EDB-FN。特异性结合EDB-FN的靶向肽可以包括具有以下氨基酸序列的线性肽：TVRTSAD(SEQ ID NO:1)、NWGDRIL(SEQ ID NO:2)、NWGKPIK(SEQ ID NO:3)、SGVKSAF(SEQ ID NO:4)、GVKSYNE(SEQ ID NO:5)、IGKTNTL(SEQ IDNO:6)、IGNSNTL(SEQ ID NO:7)、IGNTIPV(SEQ ID NO:8)和LYANSPF(SEQ ID NO:9)，具有以下氨基酸序列的环肽：CTVRTSADC(SEQ ID NO:10)、CNWGDRILC(SEQ ID NO:11)、CNWGKPIKC(SEQ ID NO:12)、CSGVKSAFC(SEQ ID NO:13)、CGVKSYNEC(SEQ ID NO:14)、CIGKTNTLC(SEQID NO:15)、CIGNSNTLC(SEQ ID NO:16)、CIGNTIPVC(SEQ ID NO:17)或CLYANSPFC(SEQ IDNO:18)，具有以下氨基酸序列的带有半胱氨酸接头的线性肽：CTVRTSAD(SEQ ID NO:42)、CNWGDRIL(SEQ ID NO:43)、CNWGKPIK(SEQ ID NO:44)、CSGVKSAF(SEQ ID NO:45)、CGVKSYNE(SEQ ID NO:46)、CIGKTNTL(SEQ ID NO:47)、CIGNSNTL(SEQ ID NO:48)、CIGNTIPV(SEQ IDNO:49)、CLYANSPF(SEQ ID NO:50)，或具有其线性肽的逆-反氨基酸序列的逆-反肽。

在其他实施方案中，靶向肽可特异性结合EDA-FN。特异性结合EDA-FN的靶向肽可以包括具有以下氨基酸序列的线性肽：WNYPFRL(SEQ ID NO:19)、SNTSYVN(SEQ ID NO:20)、SFSYTSG(SEQ ID NO:21)、WSPAPMS(SEQ ID NO:22)、TREHPAQ(SEQ ID NO:23)或ARIIDNA(SEQ ID NO:24)，具有以下氨基酸序列的环肽：CWNYPFRLC(SEQ ID NO:25)、CSNTSYVNC(SEQID NO:26)、CSFSYTSGC(SEQ ID NO:27)、CWSPAPMSC(SEQ ID NO:28)、CTREHPAQC(SEQ IDNO:29)或CARIIDNAC(SEQ ID NO:30)，具有以下氨基酸序列的带有半胱氨酸接头的线性肽：CTVRTSAD(SEQ ID NO:51)、CNWGDRIL(SEQ ID NO:52)、CNWGKPIK(SEQ ID NO:53)、CSGVKSAF(SEQ ID NO:54)、CGVKSYNE(SEQ ID NO:55)、CIGKTNTL(SEQ ID NO:56)、CIGNSNTL(SEQ IDNO:57)、CIGNTIPV(SEQ ID NO:58)和CLYANSPF(SEQ ID NO:59)，或具有其线性肽的逆-反氨基酸序列的逆-反肽。

靶向肽可以经历各种变化、取代、插入和缺失，其中此类变化为其使用提供了某些优势。在这点上，与EDB-FN和/或EDA-FN结合和/或络合的靶向肽可以与所述肽的序列基本上同源，而不是具有同一性，其中进行一个或更多个变化并且它保留与EDB-FN和/或EDA-FN特异性结合和/或络合的能力。

靶向肽可以是多种形式的多肽衍生物中的任一种，包括酰胺、与蛋白质的缀合物、环化多肽、聚合多肽、逆-反肽、类似物、片段、化学修饰的多肽等衍生物。

逆-反肽是线性肽，其氨基酸序列是逆向的并且氨基酸亚基的a-中心手性也被反转。这些类型的肽设计为在逆向序列中包含D-氨基酸，以助于保持与原始L-氨基酸肽相似的侧链拓扑结构，并使它们具有更强的抗蛋白水解降解能力。D-氨基酸代表生物系统中存在的天然蛋白质中的天然L-氨基酸的构象镜像。含有D-氨基酸的肽比仅含有L-氨基酸的肽具有优势。通常，这些类型的肽不易被蛋白水解降解并且使用时有效时间更长。此外，在选定的序列区域中插入D-氨基酸作为仅含有D-氨基酸或居间(in-between)L-氨基酸的序列块，可实现设计具有生物活性和增加的生物利用度以及对蛋白水解具有抗性的靶向肽。此外，如果设计适当，逆-反肽可以具有与L-肽类似的结合特性。

术语“类似物”包括与本文具体显示的序列具有基本同一性的氨基酸残基序列的任何肽，其中一个或更多个残基被功能相似的残基保守置换，并且与本文所述的EDB-FN和/或与EDA-FN特异性结合/络合。保守置换的实例包括一个非极性(疏水性)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)置换另一个，一个极性(亲水性)残基置换另一个，例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间，一个碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)置换另一个，或一个酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)置换另一个。

短语“保守置换”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，前提是此类肽显示出必要的结合活性。

“化学衍生物”是指具有通过功能侧基反应化学衍生的一个或更多个残基的主题肽(subject peptide)。此类衍生分子包括例如其中游离氨基已衍生形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可衍生形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可被衍生以形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-苄基组氨酸。还包括作为化学衍生物的那些多肽，其含有二十种标准氨基酸的一种或更多种天然存在氨基酸的衍生物。例如：4-羟脯氨酸可以置换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以置换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以置换组氨酸；高丝氨酸可以置换丝氨酸；以及鸟氨酸可以置换赖氨酸。本文所述的肽还包括相对于本文显示其序列的肽的序列具有一个或更多个残基添加和/或缺失的任何肽，只要保持必需的结合特异性或活性即可。

术语“片段”是指与本文中显示其氨基酸残基序列的多肽的氨基酸残基序列相比，氨基酸残基序列更短的任何主题肽。

任何多肽或化合物还可以以药学上可接受的盐的形式使用。能够与多肽形成盐的酸包括无机酸，例如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等。

能够与多肽形成盐的碱包括无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等；以及有机碱，例如单烷基、二烷基和三烷基以及芳基-胺(例如，三乙胺、二异丙基胺、甲胺、二甲胺等)和任选取代的乙醇胺(例如，乙醇胺、二乙醇胺等)。

靶向肽可以通过多肽领域技术人员已知的任何技术合成，包括重组DNA技术。因纯度、抗原特异性、不含非期望副产物、易于生产等原因可以使用合成化学技术，例如固相Merrifield型合成。许多可用技术的总结可见Steward et al.,"Solid Phase PeptideSynthesis",W.H.Freeman Co.,San Francisco,1969；Bodanszky,et al.,"PeptideSynthesis",John Wiley&Sons,Second Edition,1976；J.Meienhofer,"HormonalProteins and Peptides",Vol.2,p.46,Academic Press(New York),1983；Merrifield，Adv.Enzymol.，32:221-96,1969；Fields et al.,int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214,1990；和美国专利号4,244,946关于固相肽合成，以及Schroder et al.,"ThePeptides",Vol.1,Academic Press(New York),1965关于经典溶液合成，其各自通过引用并入本文。可用于此类合成的适当保护基如上文和J.F.W.McOmie,"Protective Groups inOrganic Chemistry"，Plenum Press,New York,1973所述，其通过引用并入本文。

通常，考虑的固相合成方法包括将一个或更多个氨基酸残基或适当保护的氨基酸残基顺序添加到不断延长的肽链中。正常情况下，第一个氨基酸残基的氨基或羧基由合适的、可选择性去除的保护基保护。对含有活性侧基(例如赖氨酸)的氨基酸使用不同的、可选择性去除的保护基。

以固相合成为例，受保护或衍生的氨基酸可以通过其未受保护的羧基或氨基连接到惰性固体支持物上。然后可以选择性地去除氨基或羧基的保护基，并且将具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中下一氨基酸混入并在适合与已连接到固体支持物的残基形成酰胺键的条件下反应。然后可以从这个新添加的氨基酸残基中去除氨基或羧基的保护基，然后添加下一个氨基酸(适当保护)，依此类推。在所有期望氨基酸以正确的顺序连接后，任何剩余的末端和侧基保护基(和固体支持物)可以被顺序或同时去除，以提供最终的线性多肽。

此外，本文所述的靶向肽可用作开发具有相似配体结合能力的更高亲和力的小分子、肽、抗体和/或抗体片段的起点。可以容易地使用例如计算机筛选从肽的药效团开发和筛选小分子，并且可以容易地使用本文描述的测定法针对靶向肽筛选此类识别的分子的结合亲和力以选择小分子试剂。

还可以在肽的任一末端添加另外的残基，以提供“接头”，通过该“接头”可以方便地将肽连接和/或固定到其他多肽、蛋白、可检测部分、标记、固体基质或载体。

氨基酸残基接头通常是至少一个残基并且可以是40个或更多个残基，更常见的是1至10个残基。用于连接的典型氨基酸残基是甘氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。此外，主题靶向肽试剂可因通过末端-NH₂酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、通过末端-羧基酰胺化(例如，用氨、甲胺等末端修饰)修饰的序列而不同。众所周知，末端修饰可用于降低蛋白酶消化的敏感性，因此有助于延长多肽在溶液中的半衰期，尤其是在可能存在蛋白酶的生物流体中。在这点上，多肽环化也是一种有用的末端修饰，并且也是特别优选的，因为环化形成稳定的结构，并且考虑到如本文所述的对此类环肽所观察到的生物活性。

在接头是肽接头的情况下，可以使用常规分子生物学/重组DNA方法以单一重组多肽产生多肽-接头。

例如，靶向肽可以包括能够与含羰基的基团(例如酸酐或酰基卤)或包含良好离去基团(例如卤化物)的烷基反应的赖氨酸。靶向肽还可以包括通过硫醇选择性化学(例如，马来酰亚胺活化的化合物)促进化学偶联的半胱氨酸。此外，靶向肽可以包括酪氨酸，其可以使用重氮偶联反应进行修饰。在示例性实施方案中，氨基酸残基接头是半胱氨酸-甘氨酸(CG)接头。

在其他实施方案中，可以使用化学结合基团。结合基团可用于增加靶向肽或与靶向肽结合的化合物或分子上的取代基的化学反应性，从而增加偶联效率。结合化学物质可以包括马来酰亚胺基结合基团，其可用于结合硫醇基团，异硫氰酸酯和琥珀酰亚胺基(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))结合基团，其可结合游离胺基团，重氮基团，其可用于结合苯酚，以及胺，其可用于使用碳二亚胺活化与游离酸(例如羧酸基(carboxylate groups))结合。

基于存在的具体氨基酸，靶向肽上存在有用的官能团，并且可以设计另外的基团。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以使用多种双官能或多官能反应试剂，同官能和异官能反应试剂(例如在Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.的目录中描述的那些)，作为结合基团。例如，可以通过氨基团、羧基基团、巯基基团或氧化的碳水化合物残基实现偶联。

也可以使用其他类型的结合化学物质。例如，将多糖与肽缀合的方法示例但不限于如下：通过α-氨基或ε-氨基与NaIO₄活化的寡糖偶联(Bocher et al.,J.Immunol.Methods27,191-202(1997))，使用方酸二酯(1,2-二乙氧基环丁烯-3,4-二酮)作为偶联剂(Tietze et al.Bioconjug Chem.2:148-153(1991))，通过肽结合基团偶联，其中多糖具有还原性末端且不含羧基基团(美国专利号5,342,770)，并与源自人热休克蛋白hsp65的合成肽载体偶联(美国专利号5,736,146)。用于将多糖、蛋白质和脂质与肽缀合的其他方法如美国专利号7,666，624所述。

在一些实施方案中，该接头是非肽接头。该非肽接头可以是非肽的脂肪族接头、杂脂肪族接头、环接头和/或杂环接头。该非肽接头可以包括，例如，共价连接该肽和造影剂的亚烷基接头、亚烷基氧化物接头、亚芳基接头、或亚烷基亚芳基接头。

在其他实施方案中，该接头可以是PEG分子接头。PEG分子可具有多种长度和分子量，包括，例如，PEG 200、PEG 1000、PEG 1500、PEG 4600、PEG 10,000，或其组合。

PET/SPECT造影剂可以与靶向肽直接缀合或通过接头与靶向肽连接。造影剂的作用是通过使包含靶向肽的PET/SPECT探针与EDB-FN和/或EDA-FN结合形成的络合物的可视化来促进检测或诊断方法的检测步骤。可选择造影剂以使其产生一信号，该信号可被测量并且其强度与结合到待分析组织的PET/SPECT探针的量相关(优选成比例)。

在某些实施方案中，造影剂包括螯合剂和金属离子。螯合剂通常具有能够与接头形成共价键的一个或更多个基团。本领域已知的多种不同螯合剂可用于本文。一方面，螯合剂包含无环化合物或环状化合物，其包含具有能够与成像剂配位的孤对电子的至少一个杂原子(例如氧、氮、硫、磷)。金属螯合剂可以包括，例如，以下项中的至少一种：二乙撑三胺五乙酸盐(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂十二烷四乙酸盐(DOTA)、1,4，7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三乙酸盐(D03A)、乙二胺四乙酸盐(EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十三烷四乙酸(TRITA)、l，4，8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,7,10-四氮杂十二烷四甲基乙酸盐(DOTMA)、1,4,7,10-四氮杂十二烷-1,4,7-三甲基乙酸盐(D03MA)、N,N',N",N"'-四膦酸甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DOTP)、1,4，7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(甲撑甲基膦酸)(DOTMP)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四(甲撑苯基膦酸)(DOTPP)、N,N'-乙撑二-L-半胱氨酸、1,4,7-三氮杂环壬烷-1.4.7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)、N,N'-双(2-羟基-5-(乙撑-β-羧基)苄基)乙二胺N,N'-二乙酸(HBED-CC)，及其衍生物。术语“衍生物”在本文中定义为螯合剂的相应盐和酯。

金属离子的选择可以根据检测技术(例如，PET或SPECT)而变化。可用于PET和SPECT成像的金属离子可以包括⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、^99mTc、¹¹¹In、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、¹⁵³Sm或⁸⁹Sr。

在一些实施方案中，PET/SPECT探针可以具有下式：

其中：

P¹包括选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、WNYPFRL(SEQ ID NO:19)、SNTSYVN(SEQ ID NO:20)、SFSYTSG(SEQ ID NO:21)、WSPAPMS(SEQID NO:22)、TREHPAQ(SEQ ID NO:23)、ARIIDNA(SEQ ID NO:24)；和其逆-反氨基酸序列。

R¹是任选的，并且如果存在，其包括亚烷基接头、亚烷基氧化物接头、亚芳基接头、或亚烷基亚芳基接头，例如：

-(CH₂)n-、-(OCH₂CH₂)n或亚芳基，其中n为1至18的整数；以及

M是金属，该金属选自由⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、^99mTc、¹¹¹In、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、¹⁵³Sm或⁸⁹Sr组成的组；或其盐。

在其他实施方案中，PET/SPECT探针可以具有下式：

或任何其他间隔基(spacer)，

M＝⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,⁶⁴Cu,^99mTc，¹¹¹In,⁸⁹Zr,⁹⁰Y,¹⁵³Sm,⁸⁹Sr。

在其他实施方案中，PET/SPECT探针可以具有下式：

以及PET/SPECT放射性核素，其选自由⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、^99mTc、¹¹¹In、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、¹⁵³Sm或⁸⁹Sr组成的组；或其盐。

本文所述的PET/SPECT探针可以通过例如全身、局部和/或肠胃外施用方法向受试者施用。这些方法包括，例如，注射、输注、沉积、植入或局部施用，或期望通过分子探针进入组织的任何其他施用方法。在一个实例中，分子探针的施用可以通过将分子探针静脉内注射入受试者进行。可以给予探针的单次或多次施用。如本文所用，“施用”是指以有效标记受试者中的癌细胞的量和一段时间提供或递送分子探针。

包含本文所述靶向肽的PET/SPECT探针可以以用于患者的可检测量的含有分子探针或其药学上可接受的水溶性盐的药物组合物施用于受试者。

“可检测量”是指施用的分子探针的量足以能够检测探针与由癌细胞或癌细胞微环境中其他细胞表达的EDB-FN和/或EDA-FN的结合或络合。“成像有效量”是指施用的PET/SPECT探针的量足以能够成像分子探针与由癌细胞或癌细胞微环境中其他细胞表达的EDB-FN和/或EDA-FN的结合或络合。

待施用的PET/SPECT探针的制剂将根据所选施用途径而变化(例如溶液、乳液、胶囊等)。合适的药学上可接受的载体可以含有不会过度抑制化合物生物活性的惰性成分。药学上可接受的载体应该是生物相容的，例如，无毒、无炎症、无免疫原性并且在施用于受试者时未发生其他非期望反应。可以使用标准的药物制剂技术，例如Remington'sPharmaceutical Sciences中描述的那些，同上。适用于肠胃外施用的药物载体包括，例如，无菌水、生理盐水、抑菌盐水(含约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水、Hank溶液、Ringer乳酸盐等。

含有溶解或分散在其中的活性成分的药理学组合物的制备是本领域公知的。通常，此类组合物被制备为液体溶液或混悬剂形式的注射剂，然而，还可以制备使用前呈液体形式的、适用于溶液或混悬剂的固体形式。制剂将根据选择的施用途径而变化(例如，溶液、乳液、胶囊)。

任何多肽或化合物还可以以药学上可接受的盐的形式使用。能够与多肽形成盐的酸包括无机酸，例如三氟乙酸(TFA)、盐酸(HCl)、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸乙酸(phosphoric acetic acid)、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、对氨基苯磺酸等。

能够与多肽形成盐的碱包括无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾等；以及有机碱，例如单烷基、二烷基和三烷基以及芳基-胺(例如，三乙胺、二异丙基胺、甲胺、二甲胺等)和任选取代的乙醇胺(例如，乙醇胺、二乙醇胺等)。

本文所述的PET/SPECT探针可用于检测和/或确定受试者的器官、组织或身体区域中表达EDB-FN和/或EDA-FN的癌细胞的存在、位置和/或分布的方法中。探针在动物组织(例如前列腺组织)中的存在、位置和/或分布可以可视化(例如，使用上述的体内成像模态)。如本文所用，“分布”是散布在区域或体积上的空间特性。在这种情况下，“癌细胞的分布”是癌细胞散布在动物组织(例如前列腺组织)中包括的区域或体积上的空间特性。然后可以将分子探针的分布与组织中癌细胞的存在或不存在相关联。分布可以决定癌细胞的存在或不存在，或者可以由本领域技术人员结合其他因素和症状以明确检测在受试者中存在或不存在癌细胞迁移或扩散、癌症转移或定义肿瘤边缘。

一方面，可以向受试者施用PET/SPECT探针以评估受试者中恶性或转移性癌细胞的分布并将该分布与特定位置相关联。外科医生通常在手术切除中使用立体定向技术和术中MRI(iMRI)。这使他们能够从肿瘤的不同区域(例如肿瘤边缘或肿瘤中心)特异性地识别和采样组织。通常，他们还对肿瘤边缘以外的肿瘤边缘组织区域进行采样，这些区域看起来非常正常，但在基于组织学检查发现浸润有扩散的肿瘤细胞。

与恶性或转移性细胞相关的EDB-FN和/或EDA-FN特异性结合和/或络合的PET/SPECT探针可用于术中成像技术，以指导手术切除并消除外科医生对肿瘤边缘位置的“有根据的猜测”。先前的研究已经确定，更广泛的手术切除可以改善患者的生存期。因此，用作诊断分子成像剂的探针有可能提高患者的生存率。

在一些实施方案中，为了识别和促进癌细胞的去除，显微镜术中成像(IOI)技术可以域本文所述的全身施用或局部施用的PET/SPECT探针组合。PET/SPECT探针在施用于受试者后可以靶向和检测和/或确定在患者的器官或身体区域中癌细胞(即，与EDB-FN和/或EDA-FN表达相关的癌细胞)的存在、位置和/或分布。在一个实例中，探针可以与IOI组合以识别在肿瘤边缘已经浸润和/或开始浸润的恶性细胞。该方法可以在手术过程中实时进行。该方法可以包括局部或全身应用包括可检测部分(例如PET或SPECT造影剂)的PET/SPECT探针。然后可以使用成像模态来检测并随后收集图像数据。所得图像数据可用于至少部分地确定手术和/或放射治疗。可选地，该图像数据可用于至少部分地控制自动化手术器械(例如，激光、手术刀、微型机器)或辅助手术的手动指导。此外，图像数据可用于计划和/或控制治疗剂的递送(例如，通过微电子机器或微型机器)。

本文描述的另一个实施方案涉及确定受试者中癌细胞的侵袭性或恶性程度的方法。发现PET/SPECT探针与癌症的结合强度与癌症侵袭性相关。增强的结合与更具侵袭性的癌症相关，而较低或降低的结合与侵袭性较低或良性肿瘤相关。在一个实例中，探针与前列腺肿瘤切片的结合与基于肿瘤侵袭性的Gleason评分相关，其中分子探针的增强结合强度与侵袭性或恶性前列腺癌相关，并且其与良性前列腺增生不同，后者表现出较低的探针结合强度。本文所述的方法和分子探针可用于在施用癌症治疗剂或癌症疗法之前、施用期间或治疗方案后监测和/或比较受试者中癌症的侵袭性。

本文所述的另一个实施方案涉及监测向受试者施用的癌症治疗剂或癌症疗法的疗效的方法。本文所述的方法和PET/SPECT探针可用于在施用癌症治疗剂或癌症疗法之前、施用期间或治疗方案后监测和/或比较受试者中癌症的侵袭性、侵袭、迁移、扩散和转移。

如本文所用，“癌症治疗剂”或“癌症疗法”可以包括能够对动物中的癌症产生消极影响的任何试剂或治疗方案，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的生长速度、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、减少肿瘤或癌细胞的血液供应、促进对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展、或延长患有癌症的动物的寿命。癌症疗法可以包括一种或更多种疗法，例如但不限于化疗、放疗、激素疗法和/或生物疗法/免疫疗法。例如，受试者中癌症体积、生长、迁移和/或扩散的减少可以指示给定疗法的疗效。这可以提供癌症治疗剂的直接临床疗效终点测量。因此，在另一方面，提供了监测癌症治疗剂的疗效的方法。更具体地，本申请的实施方案提供了监测癌症疗法的疗效的方法。

监测癌症治疗剂的疗效的方法可以包括如下步骤：向动物体内施用本文所述的PET/SPECT探针，然后使探针在动物中的分布可视化(例如，使用本文所述的体内成像模态)，然后将探针的分布与癌症治疗剂的疗效相关联。考虑了施用步骤可以在治疗方案过程之前、期间和之后发生，以确定所选治疗方案的疗效。评估癌症治疗剂的疗效的一种方法是比较癌症疗法之前和之后探针的分布。

在一些实施方案中，检测受试者中与EDB-FN和/或EDA-FN结合和/或络合的PET/SPECT探针以检测和/或提供受试者中癌细胞的侵袭性、位置和/或分布。然后可以将受试者中癌细胞的侵袭性、位置和/或分布与对照进行比较以确定癌症治疗剂和/或癌症疗法的疗效。对照可以是在施用癌症治疗剂和/或癌症疗法之前受试者中癌细胞的位置和/或分布。在施用癌症治疗剂和/或癌症疗法之前，受试者中癌细胞的位置和/或分布可以通过在施用癌症治疗剂和/或癌症疗法之前向受试者施用探针并检测与受试者中癌细胞结合和/或络合的探针来确定。

在某些实施方案中，本文所述的方法和PET/SPECT探针可用于测量向受试者施用的治疗剂用于治疗转移性或侵袭性癌症的疗效。在该实施方案中，可以在施用治疗方案之前、期间或之后向受试者施用探针，并且可以对癌细胞的分布进行成像以确定治疗方案的疗效。在一个实例中，治疗方案可以包括转移性癌症的手术切除，并且探针可以用于限定手术前和手术后转移性癌症的分布以确定手术切除的疗效。任选地，该方法和探针可用于术中外科手术，例如外科肿瘤切除术，以在手术期间更容易地界定和/或成像癌细胞块或体积。

在其他实施方案中，靶向肽可与治疗剂缀合并施用于受试者以治疗癌症，例如转移性癌症。在该实施方案中，可以将与治疗剂缀合的靶向肽施用于受试者并且可以用治疗剂靶向转移细胞。

治疗剂可以包括抗增殖剂，其直接在肿瘤细胞上发挥抗瘤形成、化学治疗、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤发生和/或免疫治疗作用，例如防止瘤形成细胞(neoplastic cell)的发展、成熟或扩散，例如，通过细胞生长抑制或杀细胞作用，而不是通过生物反应修饰等机制间接实现。有大量抗增殖剂可用于商业用途、临床评价和临床前开发。为便于讨论，抗增殖剂分为以下类别、亚型和种类：ACE抑制剂、烷化剂、血管生成抑制剂、血管抑制素、蒽环类/DNA嵌入剂、抗癌抗生素或抗生素类药物、抗代谢物、抗转移化合物、天冬酰胺酶、双膦酸盐/酯、cGMP磷酸二酯酶抑制剂、碳酸钙、环氧合酶-2抑制剂、DHA衍生物、DNA拓扑异构酶、内皮抑素、表鬼臼毒素、染料木黄酮、激素抗癌剂、亲水性胆汁酸(URSO)、免疫调节剂或免疫试剂、整联蛋白拮抗剂、干扰素拮抗剂或试剂、MMP抑制剂、杂类抗瘤形成剂、单克隆抗体、亚硝基脲、NSAID、鸟氨酸脱羧酶抑制剂、pBATT、放射/化学增敏剂/保护剂、类视色素、内皮细胞增殖和迁移的选择性抑制剂、硒、溶基质素抑制剂、紫杉烷、疫苗和长春花生物碱。

一些抗增殖剂的主要类别包括抗代谢剂物、烷化剂、抗生素类试剂、激素类抗癌剂、免疫剂、干扰素类试剂和杂类抗瘤形成试剂。一些抗增殖剂通过多种或未知机制起作用，因此可以分为多于一类。

在一些实施方案中，靶向肽可以使用连接分子与治疗剂偶联。连接分子可以是接头。可选地，连接分子可以是非肽接头。

实施例

实施例1

我们开发了ZD2 ⁶⁴Cu-DOTA缀合物作为EDB-FN的PET探针，并评价了其对携有侵袭性PC3和缓慢生长的LNCaP人前列腺肿瘤异种移植物的小鼠进行PET成像的疗效。我们发现EDB-FN在侵袭性PC3肿瘤中高表达，而在生长缓慢和非转移性LNCaP肿瘤中的表达可忽略不计。使用EDB-FN靶向造影剂ZD2-Gd(HP-D03A)的MRI在PC3肿瘤中显示出比在LNCaP肿瘤中更强的造影增强。⁶⁴Cu的使用特别有吸引力，因为它的半衰期为12.74h，为前列腺中的癌症检测提供了延长的成像时间范围，而背景干扰最小，尤其是对于膀胱。PET探针通过将ZD2肽与大环配体DOTA缀合，然后与⁶⁴CuCl₂络合进行合成。在携有PC3和LNCaP肿瘤的小鼠中评价PET探针在癌症检测和肿瘤侵袭性表征中的能力。

材料和方法

ZD2-PEG-DOTA和螯合物的合成

除非另有说明，否则用于化学合成的试剂均购自Sigma-Aldrich(Saint Louis,MO,USA)。Fmoc保护的氨基酸和2-氯三苯甲基氯树脂购自Chem-Impex International,Inc.(Wood Dale,IL)。间隔基：Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(Fmoc-NH-(CH₂CH₂O)₂-CH₂COOH)购自Chempep(Wellington，EL)。1,4，7,10-四氮杂-环十二烷-1,4,7-乙酸三叔丁酯-10-乙酸(DOTA-tris(z-Bu))购自TCI America(Portland,OR)。

前体ZD2-DA-DOTA含有ZD2肽(序列：TVRTSAD)、两重复NH2-(CH₂CH₂O)₂-CH₂COOH和DOTA，使用标准Fmoc-肽化学在固相树脂上通过依次添加相应的保护氨基酸Fmoc-NH-(CH₂CH₂O)₂-CH₂COOH和t-Bu-DOTA。然后使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/H₂O(96.5:1:2.5)从树脂上裂解产物并在室温下搅拌3h并在乙醚中沉淀以得到粗产物。在配备半制备型C18柱(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)的Agilent 1100HPLC系统上使用制备型HPLC纯化最终产物。ZD2-PEG-DOTA在Voyager DE-STR光谱仪(PerkinElmer,Waltham,MA)上以线性模式通过MALDI-TOF质谱法表征，以R 2,5-二羟基苯甲酸为基质(M+1：1425.8，观察值；1425.7，计算值)。

细胞培养和动物模型

动物研究已获得凯斯西储大学(CWRU)机构动物护理和使用委员会的批准，并且所有受试者均签署了知情同意书。PC3和LNCaP细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)并在维持在37℃和5％CO2的湿润培养箱中在补充10％胎牛血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的Roswell Park Memorial Institute培养基(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)中培养。雄性无胸腺裸鼠(4-6周龄)获自凯斯综合癌症中心(Cleveland,OH,USA)并饲养在CWRU动物核心机构中。使用高浓度Matrigel(Coming,Tewksbury,MA)中的三百万个细胞进行肿瘤接种。LNCaP细胞被皮下接种在小鼠的左侧腹(flank)。4周后，将PC3细胞接种在同一只小鼠的右侧腹进行PET成像。

放射性标记

放射性同位素⁶⁴Cu(II)购自威斯康星大学麦迪逊分校(Madison,WI)。ZD2-PEG-DOTA与Cu(II)的螯合首先在0.1N HCl水溶液中用冷CuCl₂在与放射性标记相同的条件下进行检测。将在PBS缓冲液(pH 7.4)中的等摩尔ZD2-DA-DOTA与CuCl₂溶液混合并在45℃下搅拌30min。ZD2-DA-(Cu-DOTA)的形成通过MALDI-TOF质谱法证实(M+1：1487.8，观察值；1486.04，计算值)。对于放射性标记，将10mCi ⁶⁴Cu(II)溶解于200μL的0.1N HCl中。将20微升⁶⁴Cu(II)溶液(约1mCi)与480μL的ZD2-DA-DOTA(0.05mg/mL，大量过量，PBS)在1.5mL微量离心管中混合。然后保持容器在间歇振荡下在45℃下加热30min。注射前使用NaOH溶液将溶液的最终pH值调节至中性。

PET成像

所有体内成像研究均根据CWRU动物研究委员会批准的方案和指南进行。小鼠用2％异氟醚(氧气中)麻醉，并通过尾静脉注射约200μCi[约7.4MBq]ZD2-DA-⁶⁴Cu(DOTA)。在4h和22h摄取期PET扫描(Inveon microPET，Siemens Medical Solutions USA Inc.)后，对小鼠进行10min静态PET扫描。使用具有3D直方图和1.0缩放系数的3D-OSEM重建图像(两次迭代，然后是18次迭代的MAP)。CT扫描(Siemens Medical Solutions USA Inc.)在PET程序后进行解剖配准。AMIDE 1.0.557版和AMIRA软件用于分析PET/CT图像g。绘制PC3和LNCaP肿瘤的ROI，以计算特异性与非特异性(肌肉)结合的比率。

生物分布

在注射后22h进行末次微型PET/CT成像后，将三只小鼠实施安乐死，收集器官和血液并称重，并在伽马计数器中测定活性。使用含有2％注射剂量的标准计算每克组织的注射剂量百分比。

组织学分析

图像采集后，将小鼠实施安乐死。收获肿瘤，包埋在最佳切割温度培养基中，在-80℃下冷冻，在5pm时进行冷冻切片，并用冷丙酮透化。组织在室温下用PBS中的牛血清白蛋白(1％)封闭1h。将抗EDB-FN BC1抗体(Abeam，Cambridge，MA)与PC3和LNCaP肿瘤的组织切片一起孵育。充分洗涤后，孵育抗小鼠Alexa Fluor 488二抗1小时。组织切片用含4’,6-二脒基-2-苯基-吲哚(Thermo Fisher,Waltham,MA)的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂复染。染色的组织在Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜上成像。

结果

ZD2 ⁶⁴Cu-DOTA缀合物通过使用固相肽化学将ZD2肽与大环螯合物DOTA缀合，然后与⁶⁴CuCl₂络合进行合成(图1)。在肽和螯合剂之间引入具有两重复8-氨基-3,6-二氧辛酸的短间隔基。靶向配体ZD2-DA-DOTA通过制备型高效液相色谱(HPLC)纯化，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱[m/z＝1425.8(M+1)，观察值；1425.5，计算值]表征。通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)中的等摩尔ZD2-DA-DOTA和在稀盐酸(0.1N)中的冷CuCl₂在用于放射性标记的相同条件下于45℃下络合30min来展示靶向PET探针的制备。ZD2-DA-(Cu-DOTA)的形成通过MALDI-TOF质谱[m/z＝1487.8(M+1)，观察值；1486.04，计算值]证明。

然后在携有PC3和LNCaP人前列腺癌异种移植物的雄性裸鼠中研究ZD2-DA-(⁶⁴Cu-DOTA)对前列腺癌PET成像的疗效。此前，我们显示了EDB-FN在侵袭性PC3肿瘤中高表达，而在生长缓慢和非转移性LNCaP肿瘤中的表达可忽略不计。肿瘤模型用于代表高风险和低风险前列腺肿瘤，并测试探针检测和分层侵袭性前列腺癌的能力。通过将20μL的⁶⁴Cu(II)溶液(0.1N HCl，约1mCi或37MBq)与480μL的ZD2-DA-DOTA(0.05mg/mL，大量过量，PBS，pH＝7.4)在1.5mL微量离心管中混合进行放射性标记，并在45℃下保持30min并间歇振荡。然后用PBS以1:2的比例稀释反应混合物并用pH试纸测试以确保用于静脉内注射的中性pH。放射性示踪剂以每只小鼠7.4MBq(200μCi)的剂量静脉内注射。在注射后4h和22h，在一组四只携有PC3和LNCaP肿瘤异种移植物的小鼠中获得小鼠的PET图像。

图2显示了在注射ZD2-DA-(⁶⁴Cu-DOTA)后4h和22h时两只携瘤小鼠的代表性三维(3D)体绘制和轴向PET/计算机断层扫描(CT)图像。与在缓慢生长的LNCaP肿瘤中相比，在侵袭性PC3肿瘤中可见更强的信号。PC3肿瘤的位置和大小在PET图像中被清楚地描绘出。在4h和22h对感兴趣区域(ROI)中的示踪剂摄取或信号强度进行定量分析。如图3所示，与LNCaP肿瘤相比，ZD2-DA-(⁶⁴Cu-DOTA)在PC3肿瘤中导致更高的探针摄取。在22h时，与侵袭性较低的LNCaP肿瘤(3213±1511Bq/mL)相比，PET显示在高度侵袭的PC3肿瘤(7711±1994Bq/mL)中PET示踪剂的蓄积高两倍(N＝4，P＜0.05，双尾Student t检验)。显示大量放射性示踪剂摄取的其他器官是肝脏、胃和肾脏，表明放射性示踪剂通过肝脏和肾脏途径被清除。

在注射后24h划破小鼠后测量放射性示踪剂的生物分布(图4)。生物分布模式与PET成像中的Ending一致，在肿瘤、肝脏和肾脏中有强摄取。其他器官，例如大脑和肌肉，表现出较低的放射性示踪剂摄取，这是放射性示踪剂的理想特性。PC3和LNCaP肿瘤中放射性示踪剂摄取的比较表明，PC3中放射性示踪剂的蓄积(l.⁶⁴ID％/g)高于LNCaP肿瘤(0.86ID％/g)(N＝3，P＝0.32，双尾Student t检验)，这证实了探针优先在更具侵袭性的PC3肿瘤中蓄积，而不是在非转移性LNCaP肿瘤中。

EDB-FN在前列腺肿瘤中的表达通过PET成像后用抗EDB-FN单克隆抗体BC1对PC3和LNCaP肿瘤的组织切片进行免疫荧光染色来确定。Alexa Fluor 488缀合的抗小鼠抗体用于染色BC1抗体和EDB-FN。图5为Olympus FV1000共聚焦激光扫描显微镜获得的肿瘤切片荧光图像。在PC肿瘤切片中可见强荧光染色，而在LNCaP肿瘤中观察到很少染色。一致地，我们先前已经表明LNCaP细胞中的EDB mRNA水平低于PC3细胞中的水平。两种不同前列腺肿瘤中的EDB-FN表达水平与PET分子成像观察结果密切相关。结果表明，ZD2-DA-(⁶⁴Cu-DOTA)对于前列腺癌中EDB-FN表达的灵敏且定量可视化是有效的。

我们在本实施例中显示了使用肽探针ZD2-DA-(⁶⁴Cu-DOTA)对ECM癌蛋白EDB-FN进行PET成像以检测和表征前列腺癌的潜力。先前，我们已经表明EDB-FN在快速生长的PC3肿瘤中高表达，而在生长缓慢的LNCaP肿瘤中低表达。与在LNCaP肿瘤中相比，ZD2肽靶向MRI造影剂能够在PC3肿瘤中产生强信号增强。用ZD2-DA-(⁶⁴Cu-DOTA)PET分子成像EDB-FN的结果，特别是在注射后22h，与使用ZD2肽靶向MRI造影剂的MR分子成像一致。当比较肿瘤中的探针摄取时，与缓慢生长的LNCaP肿瘤相比，在具有高EDB-FN表达的快速生长的PC3肿瘤中检测到更强的PET信号。然而，在PET图像的LNCaP肿瘤中仍然观察到显著的信号强度。这可能归因于⁶⁴Cu-DOTA单酰胺相对较低的螯合稳定性。已经表明，在动物模型中螯合物释放的游离⁶⁴Cu(II)可以在前列腺肿瘤中蓄积。LNCaP肿瘤中相对较高的信号强度可归因于探针释放的游离⁶⁴Cu(II)的蓄积。尽管如此，探针的ZD2肽的靶向作用仍然导致PC3肿瘤中的信号强度显著高于LNCaP肿瘤。与MR分子成像相比，PET成像可对前列腺癌中的EDB-FN表达水平进行灵敏和定量可视化和测量，从而提供更准确的侵袭性前列腺癌风险分层。

通常，由于成像窗口有限，对于前列腺中的原发性肿瘤成像，使用相对较短半衰期的探针进行的PET成像受到来自膀胱的显著信号干扰。相对较长半衰期⁶⁴Cu允许有足够的时间排空膀胱并最大限度地减少来自膀胱的潜在信号干扰，这对于早期检测前列腺中的原发性肿瘤至关重要。注射后22h，肿瘤中仍可见大量信号，而膀胱中几乎没有信号。用ZD2-DA-(⁶⁴Cu-DOTA)，在肝脏中观察到显著信号强度，这也可能归因于Cu-DOTA单酰胺相对较低的稳定性。自螯合物中游离⁶⁴Cu-(II)的释放可能导致放射性同位素在肝脏中的非特异性蓄积。

已开发靶向EDB-FN的抗体和抗体片段，用于检测癌症，包括前列腺癌。该研究表明，EDB-FN特异的小肽靶向PET探针也具有用于前列腺癌成像的潜力。与基于抗体的探针相比，小肽PET探针具有数个优点，包括生产成本效益高、通过扩散和灌注更好地穿透肿瘤以及从循环中快速排泄未结合的探针。

实施例2

我们显示了EDB-FN在人胰腺癌(PaCa)标本和来自小鼠PaCa模型的PaCa组织中高表达，并在二者任何一种情况下均无在正常胰腺组织中的表达。PaCa肿瘤ECM中EDB-FN的存在将实现快速和特异性结合靶向示踪剂，用于灵敏的分子成像和PaCa诊断。EDB片段的肽序列在所有哺乳动物物种中均是保守的。

我们识别了与EDB-FN特异性结合的肽ZD2(Thr-Val-Arg-Thr-Ser-Ala-Asp)。ZD2肽对高级别前列腺肿瘤表现出强结合亲和力，对低级别肿瘤表现出弱结合亲和力，在正常组织中不结合。在本实施例中，我们显示了ZD2肽可用于开发PET探针，其用于EDB-FN的灵敏和定量分子成像，用于胰腺癌的准确检测和风险分层。我们通过使用接头6-氨基己酸将NOTA与ZD2肽缀合，设计并合成了ZD2肽靶向的Ga(III)PET探针。我们评价了靶向Ga(III)示踪剂在携有侵袭性和快速生长PC3和缓慢生长LNCaP前列腺癌异种移植物的雄性裸鼠中进行PET成像的疗效。

实验

材料

用于肽合成的保护氨基酸购自Novabiochem(Burlington,MA,USA)。N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)购自MP Biomedical LLC(Santa Ana，CA，USA)。O-苯并三唑-N,N,N'，N'-四甲基-脲阳离子-六氟磷酸盐(HBTU)购自Anaspec Inc(Fremont,CA,USA)。Fmoc-6-氨基己酸购自Chem-IMPEX International(WD,IL,USA)。溴乙酸叔丁酯购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。所有其他化学试剂均购自Thermo Fisher。¹H-NMR光谱在500MHz Varian InovaNMR光谱仪(供应商和地址)上获得，使用TMS作为内标。基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱在Voyager DE-STR光谱仪(PerSeptive BioSystems)上以线性模式获得，以2，5-二羟基苯甲酸为基质。配备ZORBAX 300SB-C18柱半制备型HPLC的Agilent 1100用于在以下条件下纯化配体：洗脱液A，H₂O/TFA(0.1％)；B，MeCN/TFA(0.1％)；0％B 15min，0-50％B 30min，50％B 5min，50％-100％B 2min，100％B 5min，流速2mL/min，UV检测在210nm。Ga获自⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生器(ITG同位素技术Garching GmbH，德国)，用0.1M HCl洗脱。

合成

1,4-双(叔丁氧基羰基甲基)-1,4,7-三氮杂壬烷的合成

在冰浴中将1,4,7-三氮杂环壬烷(1.5g,11.62mmol)溶解在无水CHCl₃(15mL)中，在1.5h内缓慢加入在CHCl₃(30mL)中的溴乙酸叔丁酯(4.98g,25.56mmol)。将混合物在室温下搅拌24h并除去溶剂。残余物用DI水(15mL)处理并通过1M HCl调节至pH 3并用乙醚(50mL×2)萃取。除去有机相，用1M NaOH将水相的pH值调节至8～9，再次用CH₂Cl₂(25mL×3)萃取。最后，蒸发有机相得到产物。收率：36％，¹H NMR(500MHz,CDCl₃)：δ＝1.48(s,18H),2.79(s,4H),3.03～3.07(m,4H),3.24(s,4H),3.37(s,4H),9.46(s,H)。

NOTA-双(叔丁酯)的合成

将l,4-双(叔丁氧基羰基甲基)-1,4,7-三氮杂壬烷(0.3g,0.84mmol)和溴乙酸(0.415g,3mmol)溶解在甲醇(3mL)中，加入在水(3mL)中的K₂CO₃(0.53g,3.84mmol)。混合物在室温下搅拌过夜并浓缩。然后将残余物溶解在水中并通过1M HCl调节至pH 4。通过旋转蒸发除去水，并通过快速色谱法(甲醇:乙酸乙酯6.5:3.5)纯化产物。收率：64％，¹H NMR(500MHz，D₂O):δ＝1.48(s,18H),2.84(s,4H),3.08(m,4H),3.35(s,4H),3.47(s,4H)。

ZD2-HA-NOTA的合成

ZD2-HA使用固相化学合成。在肽合成(0.5mmol肽)结束时，将6-氨基己酸(1.5eq.)、HBTU(1.5eq.)、DIPEA(1.5eq.)在10mL无水DMF中的混合物加入树脂中并振荡直至茚三酮未变色(Kaiser检测)。然后使用DMF(10mL×3)和DCM(10mL×3)洗涤树脂。随后使用TFA:H₂O:TIBS(96.5:2.5:1)混合物(cocktail)将ZD2-HA从树脂上裂解3小时。ZD2-HA在冷乙醚中析出、离心并冻干。产物通过MALDI-TOF质谱法表征：[M]的m/z计算值，C₄₇H₈₃N₁₅O₁₈，1146.25；发现值(M+H⁺)，1147.56。

冷Ga-ZD2-HA-NOTA的合成

向溶解在10mLNaAc-Ac缓冲溶液(0.1M，pH 5.5)中的ZD2-HA-NOTA(0.11g，0.1mmol)的溶液中加入Ga(N03)3(0.076g，0.3mmol)。将溶液在室温下搅拌过夜，最后使用制备型HPLC纯化产物并冻干，得到蓬松的白色粉末。收率：43％。产物通过MALDI-TOF质谱法表征：[M]的m/z计算值，C₄₇H₈₁GaN₁₅O₁₈，1212.51；发现值(M+H⁺)，1213.54。

结果和讨论

化学和放射化学

ZD2-HA-NOTA的合成如图6所示。NOTA-双(叔丁酯)由TACN作为起始材料通过两次取代制备。然后使用固相肽通过用NOTA-双(叔丁酯)和ZD2-HA缀合成功合成前体ZD2-HA-NOTA，并通过RP-HPLC纯化。纯化的ZD2-HA-NOTA通过MALDI-TOF(m/z＝1147.56)和HPLC(纯度：约98％)表征。还制备了^NatGa-ZD2-HA-NOTA，并通过MALDI-TOF(m/z＝1213.54)和RP-HPLC(纯度：约96％)进行表征。

首先根据图6中描述的程序合成冷ZD2-(Ga-NOTA)。使用大环配体NOTA是因为它可以在相对温和的条件下易于与⁶⁸Ga(III)形成稳定的螯合物，这对于保留肽的结合特性至关重要。使用标准固相肽合成法合成ZD2肽，然后将6-氨基己酸(HA)缀合到肽的N末端作为间隔基。NOTA-双(叔丁酯)最终与树脂上的氨基结合，通过用TFA:H₂O:TIBS(96.5:2.5:1)混合物处理树脂，获得靶向配体ZD2-NOTA。最终产物通过制备型HPLC纯化。纯化的ZD2-NOTA通过MALDI-TOF表征(m/z＝1147.56[M+1],观察值；1146.25,计算值)，纯度为约98％(HPLC)，图7A,B。然后通过在r.t.下在乙酸盐缓冲液(0.1M，pH5.5)中配体与过量的GaCl₃反应来制备ZD2-(^NatGa-NOTA)。ZD2-(^NatGa-NOTA)使用制备型HPLC进行纯化，并通过MALDI-TOF(m/z＝1213.54[M+1],观察值；1212.51,计算值)进行表征，纯度为约96％(HPLC)，图43C，D。肽和ZD2-(^NatGa-NOTA)具有高水溶性，这是最小化非特异性组织结合的有利特征。

放射性示踪剂ZD2-(⁶⁸Ga-NOTA)在克利夫兰大学医院(UH)的cGMP放射性药物实验室中与Avril博士合作，通过在乙酸钠缓冲溶液(0.1M，pH 5.5)中将ZD2-NOTA与GaCL在90℃下反应15min来放射合成。最后用NaOH调节反应溶液的pH值。通过配备放射性检测器和Zorbax Eclipse C 18柱的HPLC(水+0.1％TFA/乙腈+0.1％TFA的梯度，在220nm下UV)测定，放射化学收率为约77％。在成像之前，使用配有C-18柱的反相HPLC纯化放射性标记的示踪剂。ZD2-(⁶⁸Ga-NOTA)的HPLC色谱图如图8所示，产物参数总结在表3中。对于放射性标记的肽产物，通常观察到主峰周围的小峰，这可能是由于⁶⁸Ga(III)与肽的络合。放射性标记收率与临床示踪剂的收率相当。产物的纯度也相当于临床级产品。

表3-ZD2-(⁶⁸Ga-NOTA)的产物规格

EDB-FN在人胰腺癌细胞和肿瘤异种移植物中的表达

EDB-FN的表达首先在4种不同的人胰腺癌细胞系(包括BXPC3、Capan-1、Pane10.05和Panc-1细胞)中采用蛋白质印迹法进行展示。这些人PaCa细胞系通常用于在临床前研究中开发小鼠PaCa癌症模型。所有测试的癌细胞系均具有EDB-FN的高表达，图9A。根据ATCC的说明，通过将癌细胞皮下植入雌性裸鼠的侧腹来构建肿瘤模型。使用BC-1抗EDB-FN单克隆抗体的免疫荧光染色，在人PaCa细胞的肿瘤异种移植物中展示了EDB-FN的表达。如图9B所示，在所有四种PaCa亚型中均观察到EDB-FN的大量表达，而在正常胰腺和肌肉中未观察到表达，与报道的结果一致。在PaCa肿瘤的ECM中观察到EDB-FN的高表达。结果表明，EDB-FN在PaCa细胞和肿瘤中高表达，并且是用于PaCa分子成像和检测的有前途的癌蛋白靶标。

在PaCa肿瘤中ZD2 nentide与EDB-FN的结合

根据报道的方法合成ZD2肽(Thr-Val-Arg-The-Ser-Ala-Asp)靶向荧光示踪剂ZD2-Cy5.5，以评估该肽与PaCa肿瘤中EDB-FN的结合。ZD2肽与胰腺癌中EDB-FN的结合特异性已通过将ZD2-Cy5.5与上述肿瘤异种移植物的肿瘤切片孵育来检测。如图10所示，在所有4个检测的肿瘤组织中观察到ZD2-Cy5.5(红色)的强结合，与图9B中的免疫荧光染色类似。未观察到ZD2-Cy5.5与正常胰腺和肌肉的显著结合。ZD2-Cy5.5与PaCa中EDB-FN的强结合被BC-1抗EDB-FN单克隆抗体(BC-1/ZD2)阻断。用BC-1抗体预孵育继之以ZD2-Cy5.5(BC-1/ZD2)的PaCa标本观察到很少的红色荧光染色。结果表明，ZD2-Cy5.5和BC-1均与肿瘤组织中相同的EDB-FN蛋白靶标特异性结合。ZD2肽是一种有前途的靶向剂，用于在PaCa肿瘤中特异性结合EDB-FN。

EDB-FN在人PaCa肿瘤中的表达

EDB-FN在人胰腺癌中的表达通过用ZD2-Cy5.5对人胰腺癌标本进行染色来展示。如图11所示，在人PaCa标本中观察到强红色荧光，在正常胰腺中几乎没有荧光，而在癌前胰腺上皮内瘤形成中观察到一些荧光强度。所述荧光强度表明EDB-FN在PaCa中高表达，在癌前组织中低表达，在正常胰腺中不表达。

使用ZD2-(⁶⁸Ga-NOTA)对PaCa进行PET成像

在携有Capan1和BXPC3人PaCa异种移植物的小鼠模型中在microPET/CT上评估ZD2-(⁶⁸Ga-NOTA)对EDB-FN灵敏分子成像和PaCa检测的有效性。肿瘤模型在雌性裸鼠中的开发类似，如C.1。使用上述方法合成的示踪剂以每只小鼠300μCi的剂量静脉内注射。图12显示了代表性2D冠状PET/CT图像，显示了注射示踪剂后1小时和2小时的肿瘤。在这两个时间点均在肿瘤和膀胱中观察到示踪剂的强吸收。在注射后1小时，在正常组织和器官中几乎未观察到摄取，特别是在脑、肝和肺中。注射后2小时背景噪音略有增加，可能是由于放射性降低和扫描时间延长。在注射后1小时和2小时，这两种肿瘤中的信号强度约是肌肉中信号强度的5倍。3D PET图像也显示肿瘤中有强摄取，除肾脏和膀胱外，在周围正常组织和器官中的非特异性摄取很少，图13。肾脏和膀胱中的高信号强度表明示踪剂主要经肾脏滤过排泄。这些结果展示了ZD2-(⁶⁸Ga-NOTA)对EDB-F分子成像和PaCa早期检测具有有效性和高特异性，并进一步验证了EDB-FN在PaCa中的特异性表达。ZD2肽靶向的⁶⁸Ga螯合物有望在临床实践中灵敏地早期检测胰腺癌。

实施例3

ZD2-HBED-CC的合成

ZD2肽使用标准固相化学合成。然后将HBED-CC-三(叔丁基)酯缀合到树脂上ZD2肽的N末端。之后，使用TFA/水/TIBS(96.5/2.5/1)的混合物从树脂上裂解。产物在乙醚中析出，通过制备型HPLC纯化、冻干，并通过MALDI-TOF质谱法表征。(M+1)m/z，1264.02，观察值；1264.32，C55H82N12O22计算值。

ZD2-AH-HBED-CC的合成

ZD2肽使用标准固相化学合成。然后将Fmoc-6-氨基己酸缀合到树脂上ZD2肽的N末端。之后，HBED-CC-三(叔丁基)酯与肽反应，然后使用TFA/水/TIBS(96.5/2.5/1)的混合物从树脂上裂解。产物ZD2-AH-HBED-CC在乙醚中析出，通过制备型HPLC纯化、冻干，并通过MALDI-TOF质谱法表征。(M+1)m/z，1377.1，观察值；1377.48，C61H93N13O23计算值。

ZD2-(Ga-HBED-CC)的合成

无接头的ZD2-HBED-CC配体和硝酸镓在PBS中于90℃下混合2min。然后通过制备型HPLC纯化产物ZD2-(Ga-HBED-CC)并通过MALDI-TOF质谱法表征。(M+1)m/z，1329.8观察值；1329.47，C55H79GaN12O22计算值。

ZD2-AH-(Ga-HBED-CC)的合成

带接头的ZD2-HBED-CC配体和硝酸镓在PBS中于90℃下混合2min。然后产物ZD2-AH-(Ga-HBED-CC)通过制备型HPLC纯化并通过MALDI-TOF质谱法表征。(M+1)m/z，1442.9观察值；1442.55，C61H90GaN13O23计算值。

携瘤小鼠的PET成像

所有体内成像研究均按照CWRU动物研究委员会批准的方案和指南进行。携有BxPC3或Capan-1人胰腺异种移植物的小鼠用2％异氟醚(在氧气中)进行麻醉。示踪剂ZD2-(⁶⁸Ga-HBED-CC)或ZD2-AH-(⁶⁸Ga-HBED-CC)以100-300μCi[5.3-13.0MBq]的剂量通过尾静脉注射。然后在30min或60min摄取期后，对小鼠进行10min或20min静态PET扫描(InveonmicroPET，Siemens Medical Solutions USA Inc.)。所有PET程序均进行CT扫描以进行解剖学联合配准(co-registration)。使用Inveon Research Workplace 3.0版和Horos软件分析PET/CT图像。针对肿瘤、主要器官和肌肉，对感兴趣区域(ROI)进行绘制，以计算特异性和非特异性组织摄取的比率。使用具有两次迭代的3D-OSEM和具有18次迭代的MAP，以1.0的缩放系数对图像进行3D重建处理。

在携有Capan-1和BxPC3人胰腺癌异种移植物的小鼠模型中在microPET/CT上评估ZD2-(⁶⁸Ga-HBED-CC)对EDB-FN灵敏分子成像和胰腺癌检测的有效性。附图显示了在注射后30min或60min时携瘤小鼠的代表性2D和3D全身PET/CT图像。如全身PET图像所示，在注射后30min或60min时，在肿瘤、肾脏和膀胱中观察到示踪剂的强摄取。这两种肿瘤中示踪剂的摄取均显著高于正常器官和组织，包括大脑、心脏、肝脏和肌肉。肾脏和膀胱中的高信号强度表明示踪剂主要通过肾脏过滤排出。

定量分析显示，在注射后30min或60min，BxPC3和Capan-1肿瘤的摄取均显著高于正常组织，包括脑、心脏、肝脏和肌肉。对于ZD2-AH-(⁶⁸Ga-HBED-CC)，在注射后60min，BxPC3和Capan-1肿瘤的肿瘤摄取分别是肌肉摄取的约18.3倍和13倍(p＜0.01)。对于没有接头的ZD2-(⁶⁸Ga-HBED-CC)，在注射后60min，BxPC3和Capan-1肿瘤的肿瘤摄取分别是肌肉摄取的约10.2倍和7.3倍(p＜0.01)。在这两种肿瘤模型中，肿瘤摄取均保持显著高于正常组织(p＜0.05)。这些结果表明，ZD2-(⁶⁸Ga-HBED-CC)和ZD2-AH-(⁶⁸Ga-HBED-CC)对胰腺癌肿瘤具有高特异性，而在正常组织(包括肝脏)中的摄取极少。

基于本发明的上述描述，本领域技术人员将意识到改进、变化和修改。本领域技术范围内的这种改进、变化和修改旨在由所附权利要求覆盖。本申请中引用的所有参考文献、出版物和专利均通过引用以其全文并入本文。