假重组嵌合黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统及其应用

文档序号：183857 发布日期：2021-11-02 浏览：33次 >En<

阅读说明：本技术 假重组嵌合黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统及其应用 (Pseudo-recombinant chimeric cucumber mosaic virus-mediated gene silencing system and application thereof ) 是由刘玉乐李焕改于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统及其在植物目的基因沉默中的应用。本发明的基因沉默系统是通过改造一种假重组嵌合体黄瓜花叶病毒侵染性克隆所获得,这种侵染性克隆可高效侵染植物且又不产生严重的病症。本发明的基因沉默系统具有多种优势,可高效沉默目的基因,基因沉默持续时间长,有助于大规模进行植物基因功能组学研究,操作方法简单且不依赖于专门的设备,具有重大的应用前景。(The invention provides a cucumber mosaic virus mediated gene silencing system and application thereof in plant target gene silencing. The gene silencing system is obtained by modifying a pseudo recombinant chimera cucumber mosaic virus infectious clone, and the infectious clone can infect plants efficiently and does not produce serious diseases. The gene silencing system has multiple advantages, can efficiently silence target genes, has long gene silencing duration, is beneficial to large-scale plant gene functional omics research, has simple operation method, does not depend on special equipment, and has great application prospect.)

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及假重组嵌合黄瓜花叶病毒沉默载体的构建及其在植物目的基因沉默中的应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一种基于植物体内RNA 介导的抗病毒防御机制发展起来的技术，已被广泛应用于植物基因功能的研究以及功能基因的筛选鉴定中。通过将植物基因序列插入到病毒中，随着病毒在植物体内的复制和运动，实现植物内源基因RNA的特异性降解。与其它诱导基因缺失的方法相比，VIGS具有以下优点：简单、快速、高效地引起基因沉默；不需要稳定的植物转化过程；VIGS可应用于正向和反向遗传学研究，从而架起基因型和表型之间的桥梁；VIGS可实现同时沉默多个不同基因或同一基因家族的多个成员；VIGS可对不同物种或单一物种不同背景下的基因功能进行快速有效的差异性分析。因此，VIGS技术在植物功能基因组学研究中具有良好的应用前景。

玉米是一种重要的经济作物和模式植物，目前已获得多个玉米株系的全基因组序列，但由于目前研究技术手段的局限，对其基因功能的研究及开发相对滞后，因而对有效技术和工具(例如VIGS)的开发和应用有迫切的需求。目前，已报道的可应用于玉米的VIGS 载体共有6个：1)雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus，BMV)介导的VIGS载体最早应用于玉米中进行目的基因的沉默，由于该病毒在植株体内会引起明显的病症以及插入片段易丢失的特点，限制了BVM-VIGS载体的广泛应用；2)黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus， CMV)介导的VIGS载体以一种天然侵染玉米的CMV分离物CMV-ZMBJ为材料进行改造，通过针刺玉米种子的方法将VIGS载体导入种胚内，进而实现多个玉米基因的沉默。该VIGS 载体依赖于低温才可获得较好的沉默效果，但在该环境条件下不利于玉米的生长发育；3) 通过基因枪技术可将狗尾草花叶病毒(Foxtail mosaic virus，FoMV)介导的VIGS载体导入玉米叶片细胞内，实现内源基因的沉默，但该技术造价昂贵且依赖于专门的设备，不利于广泛的推广和使用；4)大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)介导的VIGS 载体在大麦、小麦和水稻等中具有良好的应用，但该VIGS载体在玉米应用中具有侵染率低且基因沉默效果差的缺点；5)烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)介导的VIGS 载体采用一种新型的病毒接种手段，通过真空辅助农杆菌渗入及共培养的方法，可沉默小麦和玉米内源基因，但该方法的有效性还需要进一步的研究进行验证；6)玉米雷亚多非纳病毒(Maizerayado fino virus，MRFV)介导的VIGS载体可在玉米整个生长周期内实现基因沉默，但与其他借助针刺接种方法的VIGS载体类似，其在玉米上的侵染率不甚理想。鉴于目前的VIGS载体在玉米研究中应用的局限性，开发一种新的稳定、高效且易于操作的VIGS载体具有重要的意义。

CMV以其宿主范围广而著名，可侵染100多个家族1200种以上的单子叶和双子叶植物。CMV基因组含有3条正义单链RNA分子，编码5个蛋白，RNA1编码复制酶1a，RNA2 编码复制酶2a和RNA沉默抑制子2b，RNA3编码运动蛋白MP(movement protein)和外壳蛋白CP(coatprotein)。不同的CMV株系，在生物学和分子特性上具有差异，通过假重组和/或构建嵌合体病毒，可改变病毒本身的特性，产生具有不同侵染力和宿主侵染范围的新病毒。在过去的100年，从各种宿主植物中分离到了大量的CMV株系，为病毒假重组和/或构建嵌合体病毒提供了大量的资源，目前尚未有在玉米上应用的基于假重组联合嵌合体的CMV病毒开发的VIGS载体。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了一种黄瓜花叶病毒侵染性克隆、病毒介导的基因沉默系统、宿主菌组合物、试剂盒及其应用和沉默植物中目的基因的方法，黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统基于一种侵染性克隆改造而来，该侵染性克隆是通过体外假重组和构建嵌合体的方式所获得，可高效侵染植物但又不产生严重的病症，适用于VIGS载体的开发。本发明提出的黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统，可实现目的基因的高效沉默，且基因沉默持续时间长，有助于大规模进行植物基因功能组学研究，具有重大的应用前景。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种黄瓜花叶病毒侵染性克隆。根据本发明的实施例，所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆包括：pCMVF1载体、pCMVZ2载体和pCMVFZ3载体。本发明通过体外假重组和构建嵌合病毒RNA载体，获得了一种Pr CMV侵染性克隆，其可高效侵染植物，实现目的基因的沉默，且基因沉默持续时间长，但又不产生严重的病症，适用于VIGS载体的开发，有助于大规模进行植物基因功能组学研究，具有重大的应用前景。

根据本发明的实施例，上述黄瓜花叶病毒侵染性克隆还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述pCMVF1载体、pCMVZ2载体和pCMVFZ3载体中的病毒序列来源于不同的黄瓜花叶病毒株系，所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆是通过假重组和构建嵌合体的方式所获得。

根据本发明的实施例，所述pCMVFZ3载体是通过将pCMVF3载体中的至少部分序列和pCMVZ3载体中的至少部分序列进行嵌合所获得的。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种病毒介导的基因沉默系统。根据本发明的实施例，所述病毒介导的基因沉默系统包括：pCMVZ2_2bN81载体或pCMVZ2_2bN81-LIC载体、pCMVF1载体和pCMVFZ3载体；其中，所述pCMVZ2_2bN81载体和pCMVZ2_2bN81-LIC载体是通过将前面所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆中的pCMVZ2载体进行改造而获得的。通过将黄瓜花叶病毒侵染性克隆中的pCMVZ2载体进行改造，获得两套VIGS载体系统Pr CMV VIGS和Pr CMV-LICVIGS，在这两套VIGS载体系统中外源基因可被插入到pCMVZ2_2bN81载体或pCMVZ2_2bN81-LIC载体上，实现目的基因的沉默，且基因沉默持续时间长，但又不产生严重的病症。

根据本发明的实施例，所述基因沉默系统进一步包括外源基因，所述外源基因通过酶切连接的方法插入到pCMVZ2_2bN81载体中，或通过不依赖于连接反应的克隆方法插入到pCMVZ2_2bN81-LIC载体中。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种宿主菌组合物。根据本发明的实施例，所述宿主菌组合物包括：第一宿主菌，所述第一宿主菌含有前面所述病毒介导的基因沉默系统中的pCMVF1载体；第二宿主菌，所述第二宿主菌含有前面所述病毒介导的基因沉默系统中的pCMVZ2_2bN81或pCMVZ2_2bN81-LIC载体或其衍生载体；第三宿主菌，所述第三宿主菌含有前面所述病毒介导的基因沉默系统中的pCMVFZ3载体。由此，根据本发明实施例的宿主菌组合物可实现病毒高效侵染植物，实现目的基因的沉默，且基因沉默持续时间长，但又不产生严重的病症。

根据本发明的实施例，所述第一宿主菌、第二宿主菌或第三宿主菌选自农杆菌或大肠杆菌。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述病毒介导的基因沉默系统或者前面所述宿主菌组合物。利用上述基因沉默系统或宿主菌组合物可以实现黄瓜花叶病毒高效侵染植物并介导目的基因的有效沉默，且基因沉默持续时间长，沉默效率高。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆、病毒介导的基因沉默系统、宿主菌组合物、试剂盒在沉默植物中目的基因中的应用。由此，采用前面所述黄瓜花叶病毒病毒介导的基因沉默系统、宿主菌组合物、试剂盒可实现病毒高效侵染植物，有效沉默目的基因，且基因沉默持续时间长，但又不产生严重的病症。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种沉默植物中目的基因的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：通过农杆菌介导的方法，将含有植物目的基因序列的宿主菌组合物侵染植物，以便沉默所述植物中的目的基因表达。前面所述的宿主菌组合物可实现基因的沉默，基因沉默效率高且沉默持续时间长，但又不产生严重的病症。

根据本发明的实施例，所述植物选自双子叶植物。

根据本发明的实施例，所述植物选自单子叶植物，将所述宿主菌组合物侵染植物之前，先将所述宿主菌组合物侵染双子叶植物，再将所得侵染后的双子叶植物对所述单子叶植物进行摩擦接种。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1A为侵染性克隆结构示意图；

图1B为pCMVZ2_2bN81载体结构示意图；

图1C为pCMVZ2_2bN81-LIC载体结构示意图，图中的LIC接头序列以下划线表示；

图2为利用Pr CMV VIGS系统沉默玉米ZmIspH基因的分析示意图，其中A表示接种Pr CMV::ZmIspH后引起的基因沉默表型，包括接种后第14天(14dpi)第一片系统侵染叶片(first systemic leaf，1SL)到105天(105dpi)第13SL的沉默表型，以接种Pr CMV::LUC 的玉米植株叶片作为对照，图中标尺为2cm；B表示玉米接种病毒后第105天的植株表型，以PrCMV::LUC侵染的植株作为对照，图中标尺为10cm；C表示RT-qPCR检测Pr CMV::ZmIspH和PrCMV::LUC侵染后玉米叶片中ZmIspH基因mRNA水平的相对表达量，实验以ZmEF1α为内参基因，图中***表示P<0.001；

图3为玉米叶片中ZmIspH插入片段在Pr CMV::ZmIspH载体中的稳定性检测分析示意图；

图4为利用Pr CMV VIGS系统沉默本氏烟NbPDS基因的分析示意图；

图5为利用Pr CMV VIGS系统沉默玉米ZmIspH、ZmChlH和ZmPDS基因分析示意图；其中，A表示玉米叶片接种Pr CMV-LIC::ZmIspH、Pr CMV-LIC::ZmChlH或Pr CMV-LIC::ZmPDS第21天(21dpi)时的沉默表型，对照为接种Pr CMV-LIC::LUC；B表示RT-qPCR分别检测侵染Pr CMV-LIC::ZmIspH、Pr CMV-LIC::ZmChlH或Pr CMV-LIC::ZmPDS的植物叶片中ZmIspH、ZmChlH和ZmPDS mRNA水平的相对表达量， ZmEF1α为内参基因，图中***表示P<0.001。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明提出了一种黄瓜花叶病毒侵染性克隆。根据本发明的实施例，所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆括：pCMVF1载体、pCMVZ2载体和pCMVFZ3载体。

本发明中涉及两种侵染玉米的CMV株系，分别为CMV-ZMBJ和CMV-Fny。其中， CMV-ZMBJ的全长侵染性克隆由三种质粒组成，由中国农业大学处获得，本发明以 pCMVZ1、pCMVZ2和pCMVZ3命名，病毒RNA的cDNA序列构建在植物双元表达载体 pCass-Rz上。CMV-Fny的全长侵染性克隆由浙江理工大学处获得，在本发明中以pCMVF1、 pCMVF2和pCMVF3代称，病毒RNA的cDNA序列构建在植物双元表达载体pCB301上 (图1A)。这些质粒均可通过农杆菌(Agrobacterium)介导的方法将病毒序列导入植物细胞体内，并在胞内完成病毒序列的转录和翻译。

本发明以上述两种CMV病毒为基础，通过体外假重组和构建嵌合体，获得了一种新病毒Pr CMV，可高效侵染玉米，但又不产生严重的病症，适用于VIGS载体的开发。Pr CMV 侵染性克隆由pCMVF1、pCMVZ2和pCMVFZ3组成，分别对应基因组RNAs 1，2和3。其中RNA1来源于CMV-Fny；RNA2来源于CMV-ZMBJ；RNA3是通过将pCMVF3载体中的至少部分序列和pCMVZ3载体中的至少部分序列进行嵌合所获得的，即为Fny-RNA3 和ZMBJ-RNA3的嵌合体，5’UTR和MP基因序列来源于Fny-RNA3(1-1256nt)，而 CP基因和3’UTR序列来源于ZMBJ-RNA3(1259-2218nt)，构建在植物双元表达载体 pCB301上。

pCMVF1载体具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：

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pCMVZ2载体具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：

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pCMVFZ3载体具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列：

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需要说明的是，本发明所使用的术语“假重组”是指来源于不同株系的黄瓜花叶病毒的多条RNA进行组合，但不改变病毒RNA的序列；“嵌合体”是指将来源于不同病毒株系同一种RNA上的病毒序列进行重组，形成的新的病毒RNA序列。

前面所述黄瓜花叶病毒侵染性克隆中pCMVZ2载体经过改造用于外源基因片段的插入，改造方式有两种，可分别获得pCMVZ2_2bN81载体或pCMVZ2_2bN81-LIC载体，由此，构建了两套VIGS载体系统Pr CMV VIGS和Pr CMV-LIC VIGS。

具体地，Pr CMV VIGS系统由载体pCMVF1、pCMVZ2_2bN81和pCMVFZ3组成。pCMVZ2_2bN81载体由中国农业大学处获得，在pCMVZ2_2bN81载体中2b蛋白的第82-111位氨基酸对应的氨基酸序列(2659-2752nt)被多克隆位点(multiple cloning site，MCS)所取代，MCS含有KpnI、NheI、StuI和XbaI四个酶切位点序列，通过传统的酶切连接方法将外源目的基因片段插入载体中，用于后续基因沉默实验(参见图1B)。

pCMVZ2_2bN81载体具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列：

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Pr CMV-LIC VIGS系统由载体pCMVF1、pCMVZ2_2bN81-LIC和pCMVFZ3组成。pCMVZ2_2bN81-LIC载体由pCMVZ2_2bN81改造而来，pCMVZ2_2bN81中MCS除KpnI外的其他序列被LIC相关序列所取代，外源目的基因片段通过不依赖于连接反应的克隆 (ligation-independentcloning，LIC)方法插入到pCMVZ2_2bN81-LIC载体中(参见图1C)。

需要说明的是，本发明所采用的术语“不依赖于连接反应的克隆方法(ligation–independent cloning，LIC)”是基于同源重组的基本原理，利用T4 DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性在待插入片段以及线性载体的末端产生单链突出，通过序列之间的互补配对在体内完成载体的成环，达到基因克隆目的。对于具体的克隆方法，可以参考[Aslanidis C,DeJong PJ(1990)Ligation-independent cloning of PCR products(LIC-PCR).NucleicAcids Research 18:6069-6074]，具体条件可以根据实际需要灵活选择。

pCMVZ2_2bN81-LIC载体载体具有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列：

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在本发明的又一方面，本发明提出了一种宿主菌组合物。根据本发明的实施例，所述宿主菌组合物包括：含有pCMVF1载体的第一宿主菌；含有pCMVZ2_2bN81或 pCMVZ2_2bN81-LIC载体或其衍生载体的第二宿主菌；含有pCMVFZ3载体的第三宿主菌。含有第一宿主菌、第二宿主菌和第三宿主菌的宿主菌组合物侵染植物，可实现病毒高效侵染植物，引起目的基因的沉默，沉默效率高且基因沉默持续时间长。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种沉默植物中目的基因的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：通过农杆菌介导的方法，将含有植物目的基因序列的宿主菌组合物侵染植物，以便沉默所述植物中的目的基因表达。宿主菌组合物可实现病毒高效侵染植物但又不产生严重的病症，进而引起目的基因的沉默，沉默效率高且基因沉默持续时间长。

需要说明的是，前面描述的两套基因沉默系统Pr CMV VIGS和Pr CMV-LIC VIGS在构建含有目的基因片段载体的方法上有所区别，在进行基因沉默的实际操作中没有显著差别。针对双子叶植物采用宿主菌组合物浸润本氏烟等双子叶植物的方法接种病毒；针对单子叶植物，采用农杆菌组合物浸润后的本氏烟等双子叶植物叶片作为毒源，使用摩擦接种的方法将病毒导入单子叶植物体内。

根据本发明的具体实施例，沉默植物中目的基因的方法的具体步骤如下：

(1)将构建好的含有目的基因片段的病毒载体转化农杆菌；

(2)将分别含有三种病毒RNA序列载体的农杆菌培养物按一定比例(如等比例)混合，得到农杆菌组合物，以注射的方式使菌液浸润本氏烟叶片；

如果目的基因片段来源于本氏烟等双子叶植物，则在农杆菌组合物浸润叶片后在一定时期内，直接进行基因沉默表型的观察和沉默效率的检测。若目的基因片段来源于玉米等单子叶植物，则继续进行以下实验：

(3)4-7天后取注射过的本氏烟叶片均浆液作为毒源，对2-3叶期的玉米植株进行机械摩擦接种；

(4)接种后的植株进行黑暗处理48h；

(5)在25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养植物，进行基因沉默后相关生物学特性的观测与检验。

本发明中涉及的植物包括但不限于本氏烟和玉米。

本发明构建的Pr CMV VIGS和Pr CMV-LIC VIGS系统可对本氏烟和玉米植株内源基因高效沉默，适用于植物基因功能的研究。本发明利用Pr CMV VIGS载体，在玉米整个生长期内(大于105天)成功下调ZmIspH(isopentenyl/dimethylallyl diphosphatesynthase)基因表达，是目前已报道的VIGS载体在玉米植株上实现的最长沉默持续时间；利用Pr CMV-LIC载体，成功沉默本氏烟NbPDS(phytoene desaturase)基因和玉米ZmIspH基因、 ZmChlH(magnesium chelatase subunit H)基因和ZmPDS基因。本发明的Pr CMV VIGS和 Pr CMV-LIC VIGS系统操作方法简单，不依赖于专门设备，在植株内可快速且高效地实现目的基因的沉默，且基因沉默持续时间长，适用于玉米整个生长周期内基因功能的研究。此外，Pr CMV-LIC VIGS系统在载体构建过程中简化了实验操作，极大地削减了基因克隆的时间和成本，是大规模进行植物基因功能组学研究的有力工具，具有重大的应用价值。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 Pr CMV介导的VIGS载体的构建

1、pCMVFZ3载体的构建

(1)以质粒pCMVF3为模板，采用PF1和PR1进行PCR扩增，获得包含Fny-RNA3 序列1-1288nt的DNA片段I(1288bp)；以质粒pCMVZ3为模板，采用PF2和PR2进行 PCR扩增，获得包含ZMBJ-RNA3序列1271-2218nt的DNA片段II(957bp)；

表1构建pCMVFZ3载体使用的引物序列

PCR反应体系(50μL)如下：

PCR反应程序为：

(2)上述扩增出的DNA片段I和II以摩尔比1:1混合，并以此为模板，采用PF1和 PR2为引物进行重组PCR扩增，获得全长DNA片段III(2225bp)；

(3)对DNA片段III使用BamHI进行酶切，插入到使用StuI和BamHI双酶切的 pCB301载体中；

酶切反应体系(50μL)如下：

质粒DNA或PCR产物	1～3μg
		10×CutSmart Buffer	5μL
限制性内切酶	各1μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至50μL
总体积	50μL

37℃孵育1～3h，酶切反应产物切胶回收，进行后续连接反应。连接反应体系(10μL) 如下：

室温孵育2～3h，连接产物采用热激法转化大肠杆菌DH5α。热激法转化大肠杆菌的具体实施步骤如下：

A.取100μL-80℃保存的DH5α感受态细胞，于冰浴中融化，加入连接产物，轻轻混匀；

B.冰浴放置15～30min；

C.42℃水浴热激90sec，然后快速转移至冰浴中放置2min；

D.在超净台中加入800μL无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm中培养45min，使细菌复苏；

E.12000rpm离心1min，保留100～200μL上清，轻轻吹打重悬菌体，取适量菌液均匀涂布于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。

F.将平板置于37℃倒置培养12h。

(4)挑取阳性克隆进行序列鉴定，序列正确的载体命名为pCMVFZ3。

(5)采用液氮冻融法将pCMVFZ3转化到农杆菌GV3101中。质粒DNA转化农杆菌GV3101(液氮冻融法)的具体步骤如下：

A.取-80℃保存的GV3101感受态细胞于冰浴中融化；

B.无菌条件下，向30μL感受态细胞中加入100～500ng质粒DNA，轻轻混匀，冰浴放置5min；

C.液氮速冻5min后，37℃水浴热激5min，然后快速转移至冰浴中放置5min；

D.加入800μL无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于28℃，200rpm 中培养2-3h，细菌复苏；

E.6000rpm离心1min，保留100～200μL上清，重悬细胞后，均匀平涂在含50mg/L 卡那霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上。

F.将平板置于28℃倒置培养2天。

2、pCMVZ2_2bN81-LIC载体的构建

(1)从中国农业大学获得的pCMV201-2b_N81载体在此重命名为pCMVZ2_2bN81，并以此质粒DNA为模板，使用PF3和PR3、PF4和前述PR2引物进行PCR扩增，分别获得DNA 片段IV(2678bp)和V(324bp)；以pJG045(本实验室保存)为模板，使用PF5和PR5 进行PCR扩增，获得DNA片段VI(1771bp)，该片段依次含有LIC1接头序列、氯霉素抗性基因、ccdB基因以及LIC2接头序列；

表2构建pCMV2_2bN81-LIC载体使用的引物序列

(2)上述DNA片段IV、V和VI以1:1:3摩尔比混合，并以此为模板，进行重组PCR 扩增，获得DNA片段VII(4722bp)；

(3)对DNA片段VII使用MluI和AvrII进行双酶切，连接到同样使用MluI和AvrII 进行双酶切的pCMVZ2_2bN81载体中，并转化大肠杆菌DB3.1；

(4)经测序验证正确的载体命名为pCMVZ2_2bN81-LIC。

实施例2 Pr CMV VIGS系统在玉米中的应用

1、pCMVZ2_2bN81::LUC载体的构建

(1)以质粒pQLC1454(本实验室保存)为模板，采用PF6和PR6进行PCR扩增，获得含有LUC(firefly luciferase)基因片段(219bp)的PCR产物，其5‘端带有XbaI酶切识别位点，3’端带有KpnI酶切识别位点；

表3构建pCMVZ2_2bN81::LUC载体使用的引物序列

(2)使用KpnI和XbaI对PCR产物进行双酶切，连接到同样使用KpnI和XbaI双酶切的pCMVZ2_2bN81载体中，转化大肠杆菌DH5α，操作方法同上所述；

(3)挑取阳性克隆进行序列鉴定，序列正确的载体命名为pCMVZ2_2bN81::LUC，并转化到农杆菌GV3101中，操作方法同上所述。

2、应用Pr CMV VIGS系统下调玉米ZmIspH基因的表达

(1)从中国农业大学获得的载体pCMV201-2b_N81-IspH215在此重命名为pCMVZ2_2bN81::ZmIspH，并用于后续Pr CMV介导的基因沉默实验，pCMVZ2_2bN81::LUC作为对照使用；

(2)将含有质粒pCMVF1、pCMVFZ3、pCMVZ2_2bN81::ZmIspH、pCMVZ2_2bN81::LUC 的农杆菌分别接种LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)，28℃，200 rpm振荡培养过夜；

(3)次日收集菌体，将含有CMV RNA1s 1，2和3序列的菌体等比例混合，6000rpm 离心5min，去上清，菌体用初始菌液等体积的侵染缓冲液(10mM MgCl2，10mM MES pH 5.6，200μM乙酰丁香酮)重悬，涡轮振荡混匀，混匀后的菌液分别命名为Pr CMV::ZmIspH 和PrCMV::LUC，室温下放置3h；

(4)5～6周生长良好的本氏烟可用于病毒扩繁，选取上部完全展开的2～3片叶片进行农杆菌悬浮液注射。用注射器的针头在叶片背部扎孔，以不完全透过叶片为宜，然后用不带针头的1mL注射器将农杆菌悬浮液通过所扎孔洞以及气孔压入叶片细胞间隙中，使菌液浸润整个叶片。农杆菌浸润后的本氏烟放置25℃，16h光照/8h黑暗的温室正常生长；

(5)农杆菌浸润本氏烟后的第4～7天，可进行玉米植株的病毒接种。收集本氏烟浸润接种叶片，加入4倍体积(w/v)20mM磷酸缓冲液(Ph 7.2)，完全研磨至匀浆液中无明显叶片组织，此匀浆液可作为接种毒源；

(6)选取2～3叶期的玉米幼苗进行病毒接种。在病毒接种前，需事先在叶片上铺满摩擦介质(Sigma-Aldrich公司)，使用无菌棉球完全吸收本氏烟匀浆液，反复涂抹玉米叶片，力道要轻柔，以对叶片不造成明显的伤害为宜；

(7)病毒接种后的玉米植株使用塑料盖覆盖，以增加环境湿度，放置25℃黑暗条件下处理48h，黑暗处理后的玉米植株移至25℃，16h光照/8h黑暗的温室环境下正常生长；

(8)病毒接种后的第3天起，开始观察并记录叶片表型变化；

(9)接种后第5天，部分植株的第一片系统侵染叶片(上部未接种叶片)开始出现ZmIspH基因沉默表型，叶片散布ZmIspH基因沉默后的白花条纹或斑点。接种后第7-10天，所有植株均出现ZmIspH基因沉默表型；

(10)接种14天左右，可观察到玉米叶片完全白化(图2A)。自接种后14天至玉米生长期结束，每隔7天，对植物叶片进行表型的观察和记录(图2A和2B)，并收取叶片进行沉默效率(图2C)和ZmIspH插入片段稳定性的检测(图3，收集到的样品进行RT-PCR 检测，其中载体pCMVZ2_2bN81::ZmIspH和pCMVZ2_2bN81分别作为阳性和阴性对照，样品中 RT-PCR扩增出的病毒CP基因片段作为上样对照)：

a)Pr CMV VIGS系统基因沉默效率的检测

(i)Trizol法提取植物叶片总RNA，具体实施步骤如下：

A.新鲜或-80℃冻存的植物叶片约0.1g，放入RNase-free的2mL离心管，液氮中预冷，使用SPEX Geno/Grinder 2010组织研磨机处理叶片样品；

B.根据叶片量加入500～1000μL TransZol Up试剂(TransGen公司)，涡轮振荡30sec 后室温放置5min；

C.加入1/5体积氯仿，涡轮振荡30sec，室温放置3min；

D.4℃，12000rpm离心15min；

E.吸取上层水相，转移至新的RNase-free的离心管中，操作要小心，不要触碰到中间有机相；

F.加入等体积的冰预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置30min以上；

G.4℃，12000rpm离心10min，弃去上清，此时RNA在管测和管底呈胶状沉淀；

H.加入与TransZol Up等体积的75％的乙醇，将沉淀轻轻弹起；

I.4℃，12000rpm离心3min，弃去上清；

J.4℃，12000rpm短暂离心，用200μL枪头轻轻吸取剩余液体；

K.室温晾干沉淀(约5min)，勿放置太长时间，以免影响RNA溶解；

L.加入50μL RNase-free的ddH₂O，使沉淀充分溶解；

M.使用Epoch微孔板分光光度计(BioTek公司)测定样品中RNA的浓度；

(ii)使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒 (TransGen公司)进行反转录反应，20μL反应体系如下：

轻轻混匀，42℃孵育30min，85℃加热5sec，使gDNA Remover和TransScript RT/RIEnzyme失活，从而获得cDNA；

(iii)上述cDNA稀释4倍后，用于实时荧光定量PCR反应(RT-qPCR)。使用引物 PF7和PR7进行目的基因ZmIspH的检测，引物PF10和PR10进行内参基因ZmEF1α的检测；

表4 RT-qPCR中使用的引物序列

RT-qPCR反应体系(总体积20μL)如下：

cDNA	2μL
		正向引物	0.4μL
反向引物	0.4μL
		2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(with Tli RNaseH)	10μL
ddH<sub>2</sub>O	7.2μL
		总体积	20μL

RT-qPCR扩增程序：

预变性 95℃，30sec

PCR扩增 95℃，5sec→60℃，30sec，40个循环

融解曲线 65℃→95℃，每5s增加0.5℃

(iv)RT-qPCR结果分析：以ZmEF1α为内参基因，使用2^-ΔΔCt法计算各个样本中ZmIspH基因的相对表达量。与对照(接种Pr CMV::LUC)相比，接种Pr CMV::ZmIspH 14 天后，叶片中ZmIspH基因表达量下调87.3％；在接种21、28、35、42、49、56天后，ZmIspH 基因表达量分别下调81.6％、80.4％、82.6％、72.6％、75.3％、70.0％；在玉米生长末期，接种105天后，ZmIspH基因表达量下调59.4％(图2C)。上述实验结果表明，Pr CMV VIGS 系统成功在玉米整个生长期高效沉默ZmIspH基因，可用于玉米基因功能研究。

b)Pr CMV VIGS系统中外源基因片段的稳定性检测

(i)以玉米叶片总RNA为模板，使用PR2进行反转录反应获得病毒RNA2和RNA3 的cDNA，并用于后续PCR反应。引物PF11和PR11位于外源基因片段插入位点两端的外侧，用于含外源基因序列片段的扩增。电泳上样对照使用引物PF12和PR12扩增出的病毒 CP基因片段；

表5 Pr CMV VIGS系统外源基因片段稳定性检测使用的引物序列

(ii)外源基因片段稳定性结果分析：在病毒接种14、21、28天后，病毒序列中的外源基因片段完整保留，尚未发生可被检测到的片段丢失；接种35天后，部分样品中开始检测到外源片段的丢失；在接种105天后，完整外源基因片段只有痕量被检测到，大部分病毒带有部分缺失片段。

实施例3 Pr CMV-LIC VIGS系统在本氏烟中的应用

1、pCMVZ2_2bN81-LIC::NbPDS和pCMVZ2_2bN81-LIC::LUC载体的构建

(1)Trizol法提取本氏烟叶片总RNA，使用Oligo(dT)₁₈进行反转录反应获得本氏烟总基因组cDNA，操作方法同上所述；

(2)以上述cDNA为模板，使用带有LIC接头序列的引物PF13和PR13进行PCR扩增，获得本氏烟NbPDS基因片段(195bp)，该基因片段两侧分别含有LIC1和LIC2接头序列；作为对照的LUC基因片段，以pQLC1454(本实验室保存)为模板，使用PF17 和PR17进行PCR扩增，获得带有LIC序列接头的LUC基因片段(202bp)；

表6目的基因扩增使用的引物序列

^*LIC接头序列使用下划线标记；植物基因组序列使用斜体标记。

(3)采用LIC方法将上述基因片段插入到载体pCMVZ22bN81-LIC中，LIC克隆方法实施步骤如下：

A.载体处理：取5μg pCMVZ2_2bN81-LIC载体，由ApaI进行酶切反应，25℃孵育2h 后，纯化载体，溶于73μL ddH2O中；使用T4 DNA Polymerase处理载体，反应体系(100 μL)如下：

载体DNA	73μL
		5×Reaction Buffer	20μL
100mM dTTP(Promega公司)	5μL
		T4 DNA Polymerase(Thermo Scientific公司)	2μL
总体积	100μL

37℃孵育30min后，75℃处理20min，使T4 DNA Polymerase失活；

B.PCR产物处理：纯化后的PCR产物使用T4 DNA Polymerase处理，反应体系(5μL)如下：

PCR产物	3.5μL
		5×Reaction Buffer	1μL
100mM dATP(Promega公司)	0.25μL
		T4 DNA Polymerase(Thermo Scientific公司)	0.25μL
总体积	5μL

37℃孵育30min后，75℃处理20min；

C.取3μL T4 DNA Polymerase处理后的载体，加入5μL T4 DNA Polymerase处理的PCR产物，充分混合后，进行LIC反应：70℃处理10min，22℃孵育30min；

D.上述反应液直接转化大肠杆菌DH5α，操作方法同上所述；

E.挑取阳性克隆，进行测序验证；

(4)测序正确的载体分别命名为pCMVZ2_2bN81-LIC::NbPDS和 pCMVZ2_2bN81-LIC::LUC，并转化农杆菌GV3101，操作方法同上所述。

2、使用Pr CMV-LIC系统下调本氏烟NbPDS基因表达量

(1)将含有质粒pCMVF1、pCMVFZ3和pCMVZ2_2bN81-LIC::NbPDS或 pCMVZ22bN81-LIC::LUC的农杆菌过夜培养后等体积混合，使用侵染缓冲液重悬，获得Pr CMV-LIC::NbPDS和PrCMV-LIC::LUC，室温下放置3h，操作方法同上所述；

(2)选取4-5周生长良好的本氏烟进行基因沉默实验，选取上部完全展开的2-叶片进行农杆菌悬浮液注射。在每片叶片的主叶脉两侧进行直径为15mm左右的菌液浸润注射。农杆菌浸润后的本氏烟放置25℃，16h光照/8h黑暗的温室内正常生长；

(3)接种4天后开始每天观察并记录本氏烟叶片的表型变化。接种第七天的本氏烟植物开始出现表型变化；

(4)接种Pr CMV-LIC::NbPDS的本氏烟在未接种的系统侵染叶片上出现白化表型，而接种Pr CMV-LIC::LUC的植物则无任何比较明显的表型变化(图4)。

实施例4 Pr CMV-LIC VIGS系统在玉米中的应用

1、pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmIspH、pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmChlH和 pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmPDS载体的构建

(1)以玉米叶片总RNA模板，使用Oligo(dT)₁₈进行PCR反应，获得玉米全基因组cDNA，操作方法同上所述；

(2)以上述cDNA为模板，进行PCR扩增，获得带有LIC接头序列的玉米ZmIspH(215bp)、ZmChlH(201bp)和ZmPDS基因片段(234bp)，操作方法同上所述；

(3)采用LIC方法将上述基因片段分别插入到载体pCMVZ2_2bN81-LIC中，转化大肠杆菌DH5α后进行序列鉴定，操作方法同上所述；

(4)测序正确的载体分别命名为pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmIspH、 pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmChlH、pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmPDS和pCMVZ2_2bN81-LIC::LUC，并转化农杆菌GV3101，操作方法同上所述。

2、使用Pr CMV-LIC系统下调玉米ZmIspH、ZmChlH和ZmPDS基因表达量

(1)将含有质粒pCMVF1、pCMVFZ3和pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmIspH、或 pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmChlH、或pCMVZ2_2bN81-LIC::ZmPDS或pCMVZ2_2bN81-LIC::LUC的农杆菌过夜培养后等体积混合，并用侵染缓冲液重悬，获得Pr CMV-LIC::ZmIspH、Pr CMV-LIC::ZmChlH、Pr CMV-LIC::ZmPDS和Pr CMV-LIC::LUC，室温下放置3h，操作方法同上所述；

(2)选取5-6周生长良好的本氏烟进行农杆菌悬浮液浸润注射，以便病毒扩繁，操作方法同上所述；

(3)农杆菌浸润本氏烟后的第4-7天，进行玉米幼苗的病毒接种。病毒接种方法同上所述；

(4)接种后第3天起，开始观察并记录叶片表型变化；

(5)接种后第6天，所有实验组中部分植株的1SL开始出现基因沉默表型；

(6)接种21天时，Pr CMV-LIC::ZmIspH侵染的植物叶片几乎完全白化；Pr CMV-LIC::ZmChlH侵染的植物叶片表现出典型的黄化表型；Pr CMV-LIC::ZmPDS侵染的植株叶片上出现明显的光漂白表型(图5A)；

(7)收集病毒接种21天的植物叶片进行目的基因沉默效率的检测，操作方法同上所述。与对照植物相比，病毒接种21天后，沉默ZmIspH的植物体内ZmIspH基因表达量下调78.0％；沉默ZmChlH的植物体内ZmChlH基因表达量下调66.6％；沉默ZmPDS的植物体内的ZmPDS基因表达量下调65.9％。上述实验结果表明，Pr CMV-LIC VIGS系统成功下调玉米ZmIspH、ZmChlH和ZmPDS基因表达量，进而可作为高通量玉米基因组功能研究的重要工具和手段。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 假重组嵌合黄瓜花叶病毒介导的基因沉默系统及其应用

<130> BI3210953

<160> 38

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7956

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 1

<400> 1

aagcttgcat gcctgcagtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60

tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag 180

aaaaggaaga tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaaa 240

gaatgcctct accgacagtg gtcccaaaga tggacccccc acccacgagg aacatcgtgg 300

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg 360

agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg 420

ctattgagac tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 480

tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat ggcttctaca aatgccatca 540

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga atgcctctac cgacagtggt cccaaagatg 600

gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 660

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 720

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagagggtt tatttacaag 780

agcgtacggt tcaatccctg cctcccctgt aaaactaccc tttgaaaacc tctctttctt 840

aatcttttct ttgtaattcc tatggcgacg tcctcgttca acatcaatga attggtagcc 900

tcccacggcg ataaaggact actcgcgacc gccctcgttg ataagacagc tcatgagcag 960

ctcgaggagc aattacagca tcaacgtaga ggccgtaagg tctacatccg gaacgttttg 1020

ggtgtaaagg attccgaggt catccggaat cggtatggag gaaagtacga cctccatctt 1080

acccagcagg agtttgctcc ccacggccta gctggtgccc tccgcttgtg tgaaactctc 1140

gattgtctag actctttccc ttcatcaggt ctgcggcagg acctcgtctt agacttcgga 1200

ggaagttggg tcacacatta cctccgcgga cataacgtac actgttgttc cccttgtttg 1260

ggtatccgcg ataagatgcg ccatgcggaa cgcttaatga acatgcgcaa gatcatcttg 1320

aacgatccac aacagttcga tggtcggcag ccggatttct gcactcaacc ggctgcggat 1380

tgcaaagtac aagcccactt tgctatatct attcatggag gttatgatat gggctttaga 1440

ggattatgtg aagcgatgaa tgctcacgga accactattt tgaagggaac gatgatgttc 1500

gatggtgcga tgatgtttga cgaccaaggt gtaatacccg aacttaattg tcagtggagg 1560

aagatcagga gtgctttctc cgaaactgaa gacgtcacac cactggttgg taagcttaat 1620

tccacagttt tctcccgcgt gcggaagttc aagacgatgg tagcttttga tttcatcaac 1680

gagtctacta tgtcttatgt tcatgattgg gagaatataa aatcttttct tacggaccag 1740

acttattcgt accgagggat gacttacggt atcgaacgct gcgttatcca cgctggtatt 1800

atgacgtaca agattatcgg tgtacctggg atgtgcccac ccgaactcat tcgacattgt 1860

atttggttcc cctctattaa agactatgtt ggtctaaaga tccccgcgtc gcaggatttg 1920

gttgagtgga aaacagtgcg gattttaacg tcaacattac gtgagactga agagattgct 1980

atgaggtgtt ataatgataa gaaagcgtgg atggaacagt tcaaggttat cctaggtgtt 2040

ctatccgcga aatcatctac cattgttatt aatggtatgt ccatgcaatc tggcgagcga 2100

atagacatta atgattatca ctacatcggt ttcgccattc ttcttcacac aaaaatgaag 2160

tacgaacaac ttggaaaaat gtatgatatg tggaatgctt cgagtatttc gaagtggttt 2220

gccgcgttga ctcgtccgct gcgtgtgttt ttctccagtg ttgttcacgc actattcccg 2280

actttgagac cccgcgagga aaaagaattt ttgatcaagc tctccacctt cgtgactttt 2340

aatgaagagt gctcatttga cggtggagag gaatgggacg tgatatcatc cgctgcatac 2400

gttgctacgc aggctgttac cgatgggaag attttggctg cgcagaaagc cgagaagctt 2460

gctgagaagc ttgcacaacc cgtgagtgag gtatcggaca gtcctgagac gtcatctcaa 2520

acgcctgatg atactgctga tgtttgtgga agggagcgag aggtttcgga actcgactcc 2580

ctatcagctc agacacgttc ccccatcact agagttgctg aaagggctac tgctatgtta 2640

gagtatgccg cttatgagaa acaattgcac gacactacag tgtctaattt aaaacgtatt 2700

tggaacatgg cgggcggtga tgacaaaaga aactccctcg agggtaattt gaagtttgtt 2760

ttcgatacgt actttaccgt tgatcctatg gtgaacattc atttctccac gggtcggtgg 2820

atgcgtcctg tgcccgaggg tattgtttat tctgtcggtt ataatgaacg cggtttaggt 2880

ccgaagtctg atggagagct ttacattgtc aatagtgaat gcgtgatctg taacagtgaa 2940

tctttatcca ctgtcacgcg ttctcttcaa gctccaaccg ggaccattag tcaagttgac 3000

ggagttgctg gttgtgggaa aaccacggca attaaatcca tttttgagcc gtccactgac 3060

atgatcgtta ccgcgaacaa gaagtccgcc caagatgtac gtatggcact tttcaaatcg 3120

tcggattcca aagaagcttg cacctttgtt cgaacagccg attctgtcct acttaatgaa 3180

tgtccgactg ttagtagggt tttggttgac gaggtcgttc tgctacactt tggtcaatta 3240

tgtgccgtca tgtctaagtt gaaggccgtg cgagctatat gttttgggga ttcggagcag 3300

attgcctttt cctcgcgtga tgcttcattt gacatgcgtt tctctaagat tattcctgat 3360

gaaactagtg atgctgacac cacattccgt agcccacaag atgttgtacc gcttgtgcgt 3420

ttaatggcta cgaaggccct tccgaaagga acccattcaa aatacacgaa atgggtttct 3480

caatctaaag tgaaaagatc tgttacatct cgtgccatcg ctagtgtgac attggttgac 3540

ttggattctt ccaggttcta tataacgatg acccaagctg ataaggcctc actgatttca 3600

agggcgaaag agatgaatct accaaagact ttctggaatg aaaggattaa aaccgtgcat 3660

gagtctcagg gtatctccga agaccacgtt actttggtaa gattaaagag tacaaaatgt 3720

gacctgttta aacagttttc ttattgtctc gttgcactga cgagacacaa ggtcacattc 3780

cgctacgagt actgtggtgt attgaacggc gatttaatcg ccgaatgtgt tgctcgtgct 3840

tagcggtctc cctcttcggg cgggatctga gttggcggta atctgcaaac cgtctgaagt 3900

cactaaacac attgtgtggt gaacgggttg tccatccagc taacggctaa aatggtcagt 3960

cgtggagaaa tccacgccag tagacttaca agtctctgag gcacctttga aaccatctcc 4020

taggtttctt cggaaggact tcggtccgtg tacttctagc acaacgtgct agtttcaggg 4080

tacgggtgcc ccccactttc gtgggggtct ctaaaaggag accaggatcc ccgggtcggc 4140

atggcatctc cacctcctcg cggtccgacc tgggcatccg aaggaggacg tcgtccactc 4200

ggatggctaa gggagagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 4260

ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 4320

gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 4380

attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 4440

taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggaattc agattgtcgt 4500

ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg taaacctaag 4560

agaaaagagc gtttattaga ataatcggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 4620

tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca ggagatctca gtaaagcgct ggctgaaccc 4680

ccagccggaa ctgaccccac aaggccctag cgtttgcaat gcaccaggtc atcattgacc 4740

caggcgtgtt ccaccaggcc gctgcctcgc aactcttcgc aggcttcgcc gacctgctcg 4800

cgccacttct tcacgcgggt ggaatccgat ccgcacatga ggcggaaggt ttccagcttg 4860

agcgggtacg gctcccggtg cgagctgaaa tagtcgaaca tccgtcgggc cgtcggcgac 4920

agcttgcggt acttctccca tatgaatttc gtgtagtggt cgccagcaaa cagcacgacg 4980

atttcctcgt cgatcaggac ctggcaacgg gacgttttct tgccacggtc caggacgcgg 5040

aagcggtgca gcagcgacac cgattccagg tgcccaacgc ggtcggacgt gaagcccatc 5100

gccgtcgcct gtaggcgcga caggcattcc tcggccttcg tgtaataccg gccattgatc 5160

gaccagccca ggtcctggca aagctcgtag aacgtgaagg tgatcggctc gccgataggg 5220

gtgcgcttcg cgtactccaa cacctgctgc cacaccagtt cgtcatcgtc ggcccgcagc 5280

tcgacgccgg tgtaggtgat cttcacgtcc ttgttgacgt ggaaaatgac cttgttttgc 5340

agcgcctcgc gcgggatttt cttgttgcgc gtggtgaaca gggcagagcg ggccgtgtcg 5400

tttggcatcg ctcgcatcgt gtccggccac ggcgcaatat cgaacaagga aagctgcatt 5460

tccttgatct gctgcttcgt gtgtttcagc aacgcggcct gcttggcctc gctgacctgt 5520

tttgccaggt cctcgccggc ggtttttcgc ttcttggtcg tcatagttcc tcgcgtgtcg 5580

atggtcatcg acttcgccaa acctgccgcc tcctgttcga gacgacgcga acgctccacg 5640

gcggccgatg gcgcgggcag ggcaggggga gccagttgca cgctgtcgcg ctcgatcttg 5700

gccgtagctt gctggaccat cgagccgacg gactggaagg tttcgcgggg cgcacgcatg 5760

acggtgcggc ttgcgatggt ttcggcatcc tcggcggaaa accccgcgtc gatcagttct 5820

tgcctgtatg ccttccggtc aaacgtccga ttcattcacc ctccttgcgg gattgccccg 5880

actcacgccg gggcaatgtg cccttattcc tgatttgacc cgcctggtgc cttggtgtcc 5940

agataatcca ccttatcggc aatgaagtcg gtcccgtaga ccgtctggcc gtccttctcg 6000

tacttggtat tccgaatctt gccctgcacg aataccagcg accccttgcc caaatacttg 6060

ccgtgggcct cggcctgaga gccaaaacac ttgatgcgga agaagtcggt gcgctcctgc 6120

ttgtcgccgg catcgttgcg ccacatctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata 6180

atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata 6240

ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt 6300

gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa 6360

gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt 6420

ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc 6480

gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc 6540

taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc 6600

cgcatacagc tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag 6660

gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag 6720

gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac 6780

atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc 6840

tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta 6900

tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct 6960

tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc 7020

aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg 7080

ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc acaattatgg 7140

gtgatgctgc caactcgaga gcgggccggg agggttcgag aagggggggc accccccttc 7200

ggcgtgcgcg gtcacgcgca cagggcgcag ccctggttaa aaacaaggtt tataaatatt 7260

ggtttaaaag caggttaaaa gacaggttag cggtggccga aaaacgggcg gaaacccttg 7320

caaatgctgg attttctgcc tgtggacagc ccctcaaatg tcaataggtg cgcccctcat 7380

ctgtcagcac tctgcccctc aagtgtcaag gatcgcgccc ctcatctgtc agtagtcgcg 7440

cccctcaagt gtcaataccg cagggcactt atccccaggc ttgtccacat catctgtggg 7500

aaactcgcgt aaaatcaggc gttttcgccg atttgcgagg ctggccagct ccacgtcgcc 7560

ggccgaaatc gagcctgccc ctcatctgtc aacgccgcgc cgggtgagtc ggcccctcaa 7620

gtgtcaacgt ccgcccctca tctgtcagtg agggccaagt tttccgcgag gtatccacaa 7680

cgccggcggc cgcggtgtct cgcacacggc ttcgacggcg tttctggcgc gtttgcaggg 7740

ccatagacgg ccgccagccc agcggcgagg gcaaccagcc cggtgagcgt ctagtggact 7800

gatgggctgc ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg 7860

ctggctggtg gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac 7920

acattgcgga cgtttttaat gtactggggt ggtttt 7956

<210> 2

<211> 13057

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2

<400> 2

aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt 60

ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt 120

ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat 180

ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttggca agctgctcta 240

gccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga 300

caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac 360

tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt 420

gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgacatg attacgaatt ctgaagcttg 480

catgcctgca ggtcaaatgg tggagcacga cactctcgtc tactccaaga atatcaaaaa 540

tacagtctca aaagaccaga gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa 600

cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc gaaaggacag tagaaaagga 660

agatggcttc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc 720

taccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg aacatcgtgg aaaaagaaga 780

cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat gccgcctgca ggtcaacatg 840

gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc agaagaccag 900

agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg attccattgc 960

ccagctatct gtcacttcat cgaaaggaca gtagaaaagg aagatggctt ctacaaatgc 1020

catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctaccgacag tggtcccaaa 1080

gatggacccc cacccacgag gaacatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca 1140

aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat 1200

ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag ggtttattta 1260

caagagcgta cggttcaacc cctgcctcct ctgtaaaact ccctagactt tctagtttct 1320

ttctatccta tggctttccc tgcccccgct ttctcactag ccaatctttt gaacggcagt 1380

tacggtgtcg acactcccga ggaagtggaa cgcgtgcgag ctgagcaacg cgaagaggct 1440

gctgcggcct gtcgtaatta caggccccta cccgctgtgg atgtcagcga gagtgtcaca 1500

gaggacgtac attccctccg aactccagac ggagctccct ccgaagaggt gtctgttgag 1560

tttgttactt atggtgctga ggattacctt gaaaaatccg atgatgagct ccttgtcgct 1620

tttgagacga tggtcaaacc catgcgtgtc ggacaatttt ggtgccctgc gtttaataaa 1680

catttgttta tttccagcat tgctatggcc agagctttgc tgtcggcacc tagaacatcc 1740

caccgaacca tgaagtgttt tgaagacctg gttgcggcta tttacactaa atccgatttc 1800

tattacgacg atgatgagtg tgaagccgac gacgttcaga tggatatctc gtctcgcgat 1860

gtacccggtt actctttcga accgtggtcc cgaacgtctg gatttgaacc accgcctatc 1920

tgtgaggcgt gtgacatgat catgtaccag tgcccttgtt ttgatttcaa tgctttaaag 1980

aaatcgtgcg ctgagaggac tttcgctgat gattatgtta tcgaaggttt agacggtgtt 2040

gttgacaacg cgactttatt gtcgaattta ggcccatttt tggtgcctgt gaaatgtcag 2100

tatgagaaat gtccgacacc taccatcgcg attcctccga gtttgaatcg tgctactgat 2160

cgtgttgata tcaatttagt tcaatccatt tgtgactcga ctctgcccac acatagcaac 2220

tatgacgact cttttcatca agtgtttgtc gaaagtgcag actattctat tgacctggac 2280

catgttaggt ttcggcaatc tgatctcatt gcaaaaattc cagagtcagg gcatatgata 2340

ccggttttga acaccgggag cggtcacaag agagtaggta cgacgaagga ggtccttaca 2400

gcaatcaaga aacgtaatgc tgacgttcca gagctaggtg attccgttaa tctgtccaga 2460

ttgagtaagg ctgtggctga gagatttttc atttcatata tcaatggtaa ctctctagca 2520

tccagcaact ttgttaatgt cgttagtaac ttccacgatt acatggaaaa atggaagtcc 2580

tcaggtctct cgtatgacga tcttccagat cttcatgctg agaatttgca gttttatgat 2640

cacatgataa aatctgatgt gaaacctgtt gtgagcgaca cactcaacat tgacagaccg 2700

gttccagcta ctataacgta tcataagaag agtataacct cccagttctc accattgttt 2760

actgcgctat ttgagcgttt ccagagatgc cttcgagaac gtatcgttct tcctgttgga 2820

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gatttgtcca aattcgacaa gtctcaaggt gaattccatt tgatgattca ggaacacatt 2940

ttgaatggtc taggatgccc agctccgata actaagtggt ggtgtgattt ccacagattc 3000

tcttacatta gagatcgtag agctggtatt ggtatgccta tcagtttcca gagacgaact 3060

ggtgatgcat tcacttattt tggcaatacc attgtcacca tggctgaatt tgcatggtgt 3120

tacgacaccg accaattcga aaagttgtta ttctcaggcg atgattctct aggattttca 3180

gtacttcccc ctgttggtga tccgagtaaa ttcacgactc tcttcaacat ggaagctaag 3240

gtgatggagc ctgcagtacc atatatttgt tcgaagttct tactctctga cgagttcggt 3300

aatacttttt ccgttccaga tccattgcgc gaggttcagc ggttgggaac aaagaagatc 3360

ccctattcag acaatgatga attcctgttt gctcacttca tgagctttgt tgatcgtttg 3420

aagtttttgg accgaatgac tcagtcttgt atcgatcaac tttcactctt tttcgagttg 3480

aaatacagga agtctggggc agaggctgct ttaatgttag gcgcctttaa gaaatacacc 3540

gctaatttcc aatcttataa agaactctac tattcagatc gtcgtcaatg cgaattgatc 3600

aattcgttta gttgtgtaga gtttaaggtt gagcgtttga attccactaa acagcgaaag 3660

aagaaagatg gaattgaacg aaggcgcaac gacaaacgtc gacctccaac tggctcgttt 3720

ggtggagggg aagagacaga gacgagggtc tcacaagaag aatcgacggg aacgaggtta 3780

caaaagtccc agcgagaggg cgcgttcaaa tctcagactg ctccgcttct taccattcta 3840

tcaggtagat ggttcggaat tgataaggat ataccaccat gcgaacgtgg tggaaatgtc 3900

cgagtctgag gccccttgtt ttacgttacc agcggaagaa gaccatgact ttgacgatac 3960

agattggttc gctggtaacg agtgggcgga agggtcgttt tgaacctccc cttcctaatc 4020

tccctccagt tctcttaggc gggagctgag ttggcagtat tgctataaac tgtctgaagt 4080

cattaaacgt tttacgatga acgggttgtc catccagcta acggctaaaa tggtcagtcg 4140

tagagaaatc tacgccggag gcttacaagt ctccgaggca cctttgaaac catctcctag 4200

gtttcttcgg aagggcttcg gtccgtgtac ttctagcaca agatgctagt tttagggtac 4260

gggtgccccc tcctgcgttg cgggggggtc tccaaaagga gaccggatcc gataccctgt 4320

caccggatgt gttttccggt ctgatgagtc cgtgaggacg aaacaggact gtcctgcagg 4380

agctcgaatt cggtacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctctatt 4440

ttctccataa ataatgtgtg agtagtttcc cgataaggga aattagggtt cttatagggt 4500

ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact 4560

tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc cagatcagct 4620

tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 4680

atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 4740

atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg 4800

atcagattgt cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt gtttgacagg atatattggc 4860

gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt agaataatcg gatatttaaa agggcgtgaa 4920

aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc 4980

aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc 5040

agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc 5100

tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg 5160

actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg 5220

cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg 5280

gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg 5340

ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc 5400

tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg 5460

gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt 5520

tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga 5580

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cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg 5700

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ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga acaagcatga aaccgcacca 5880

ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc 5940

cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc 6000

cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga 6060

gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc 6120

tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc 6180

gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc 6240

gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc 6300

cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg 6360

acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg 6420

ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg 6480

gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc tggtggagct ggttaagcag 6540

cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa 6600

ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt 6660

gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt 6720

cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt 6780

aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc 6840

taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag 6900

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cgcgtcggcc tatcgcggcc gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc 8700

taccagggcg cggacaagcc gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgccca catcaaggca 8760

ccctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 8820

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cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 9420

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gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 9540

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cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcattcta 9900

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<212> DNA

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