一种生物催化合成磷酸氟达拉滨的方法

文档序号：183887 发布日期：2021-11-02 浏览：53次 >En<

阅读说明：本技术 一种生物催化合成磷酸氟达拉滨的方法 (Method for synthesizing fludarabine phosphate through biocatalysis ) 是由张坤晓毛联岗侯学雯王媛王睿君杨玉梅于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：一种酶法制备磷酸氟达拉滨的方法,以氟达拉滨为原料,在无机盐和辅酶存在的条件下,通过酶催化反应制备磷酸氟达拉滨;其中,酶催化反应所用的酶选自磷酸转移酶、醛酮还原酶、醇氧化酶或醇脱氢酶中的至少一种;酶催化反应的pH为7.3-7.6,反应温度为37℃,反应1-4 h；辅酶选用ATP。本发明通过采用一种新的酶法工艺制备磷酸氟达拉滨,解决了一些现有化学工艺中存在的技术问题,较现有的酶法制备的工艺也有所改善；降低了生产成本；工艺环保,反应条件温和。(A method for preparing fludarabine phosphate by an enzyme method comprises the steps of taking fludarabine as a raw material, and preparing the fludarabine phosphate by an enzyme catalysis reaction in the presence of inorganic salt and coenzyme, wherein the enzyme used in the enzyme catalysis reaction is at least one of phosphotransferase, aldone reductase, alcohol oxidase or alcohol dehydrogenase, the pH value of the enzyme catalysis reaction is 7.3-7.6, the reaction temperature is 37 ℃, and the reaction is carried out for 1-4 hours; the coenzyme is ATP. The invention adopts a new enzyme method process to prepare the fludarabine phosphate, solves the technical problems existing in the existing chemical processes, and is also improved compared with the existing enzyme method preparation process; the production cost is reduced; the process is environment-friendly, and the reaction conditions are mild.)

一种生物催化合成磷酸氟达拉滨的方法

技术领域

本发明涉及化合物合成技术领域，特别涉及一种磷酸氟达拉滨的制备方法。

技术背景

磷酸氟达拉滨(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2-氟代腺嘌呤-5'-磷酸酯)，英文名称；fludarabine phosphate，分子式∶C₁₀H₁₃FN₅O₇P，分子量∶365.2117，其结构式为∶

是一种抗代谢的氟化嘌呤核苷类似物，于1991年首先在美国上市，是治疗白血病和淋巴瘤(包括慢性淋巴细胞性白血病，非霍奇金淋巴瘤，急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病)的化疗药物，通过静脉注射或口腔注射进行给药。本品进入体内后经去磷酸作用生成代谢物9-β-氟阿糖腺苷(F-Ara-A)，然后在磷酸化变成具抗肿瘤活性的F-Ara-ATP。本品的抗肿瘤机制涉及参入肿瘤细胞DNA或RNA链，使链停止延伸，以抑制DNA或RNA 得合成从而达到促进肿瘤细胞凋亡来提高疾病的缓解率的目的。其与阿糖胞苷、米托蒽醌等联用，可增强对肿瘤细胞的杀死作用。

磷酸氟达拉滨的制备可见于许多专利文献中，它们全都使用氟达拉滨作为起始原料进行制备。现有的专利及工业生产制备磷酸氟达拉滨方法大部分都是化学制备法，而这些化学法的制备方法通常步骤较多，操作相较复杂，反应条件苛刻，产生的副产物较难分离，成本较高。

如US5110919采用了磷酸三甲酯和三氯氧磷在0℃下进行反应的方法，后处理的方法是加入水和二氯甲烷，在搅拌下静置到两相分离，用倾析法除去二氯甲烷，得到浅黄色的胶状残留物，将其溶于50℃热水留待沉淀。所得到的粗品的表征是分解点(200℃-250℃)，用薄层色谱纯化，通过树脂回收二次产出物，将得到的固体用水重结晶。

这种方法的缺点是操作复杂，收率低，且其采用的方法仪器难于在工业上大规模实现。

如CN200480030273.5采用磷酸三乙酯和氟达拉滨放入-15/-20℃反应器中，将三氯氧磷用约一小时地时间滴加入，在-10/-15℃下反应48小时，加入冷甲苯使产物沉淀得粗品，再用树脂纯化，重结晶。

这种方法的缺点是，反应条件苛刻；操作复杂；使用三氯氧磷和甲苯，曾大危险性和毒性大，不利于工业化生产。

在CN201680078610.0中也采用酶法制备磷酸氟达拉滨，在四口烧瓶中，100ml 自来水加入乙酸铵，MgCl2·6H2O，乙酰磷酸二锂盐，ATP二钠盐，氟达拉滨后搅拌均匀，用NaOH调pH至8.0，升温至40℃，然后加入含酶的湿菌体溶液加入到反应体系中，保持温度在37-40℃，反应过程用NaOH控制pH在7.5-8.5，5h完成反应。

这种方法相较较化工合成方法在安全、操作和收率方面都有所提升；但仍有缺点，在催化的反应体系内添加的物料过多并需分步操作，反应时间也较长；且含酶湿菌体的制备复杂，成本较高。

发明内容

本发明要解决上述化学合成工艺存在的技术问题及系列缺点，提供一种氟达拉滨的酶法催化合成工艺，操作简单，反应条件温和，环保高效，满足磷酸氟达拉滨的合成需求。

本发明为解决上述合成磷酸氟达拉滨中存在的技术问题，采用的技术方案具体包括如下步骤：

第一步，原料与酶的选取；选取氟达拉滨为原料，选取序列表所示酶中的至少一种作为催化酶。

第二步，酶的表达提取，分离纯化；选取的酶成功构建后在大肠杆菌内进行表达，将菌裂解得含酶裂解液，35000g/min离心30min得上清液含酶，可做粗酶液进行反应；也可纯化上清液中所含酶，上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行透析，得纯化酶溶液。

第三步，磷酸氟达拉滨得催化合成；以氟达拉滨为原料，在磷酸盐缓冲溶液中加入MgSO₄、辅酶ATP和上步所得酶溶液，在PH 7.3—7.6、37℃的条件下，反应1-4h后制得磷酸氟达拉滨。

上述酶催化反应的反应式为：

本发明的制备方法是通过酶催化反应在辅酶ATP的存在下直接对氟达拉滨进行磷酸化来制备磷酸氟达拉滨。在本发明的制备方法中，通过酶催化反应能够以高转化率获得磷酸氟达拉滨产品。相比于许多现行的化工方法，本发明的制备方法操作简单，条件温和，产率高，选择性好，成本较低。

附图说明

图1为氟达拉滨的高效液相色谱图。

图2为磷酸氟达拉滨的高效液相色谱图。

图3为纯化的酶溶液的高效液相色谱图

图4为本发明的酶催化方法制备磷酸氟达拉滨过程中的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行做进一步详细说明，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。

实施例1

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在氨苄抗性的固体LB 平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCRMix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:1)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，得粗酶溶液；在100mL玻璃反应瓶中，加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨 (0.01mol/l)，再加入ddH₂O将反应体系补至10ml，最后加入1ml(14mg)粗酶溶液(SEQ ID NO:1)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；210nm波长进行检测，检测得转化率＞60％。

实施例2

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴3 0min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:2)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，得粗酶溶液；在100mL玻璃反应瓶中，加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3， 2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨 (0.01mol/l)，再加入ddH₂O将反应体系补至10ml，最后加入1ml(14mg)粗酶溶液(SEQ ID NO:2)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

实施例3

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴3 0min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:3)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，得粗酶溶液；在100mL玻璃反应瓶中，加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3， 2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨 (0.01mol/l)，再加入ddH₂O将反应体系补至10ml，最后加入1ml(14mg)粗酶溶液(SEQ ID NO:3)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

实施例4

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴3 0min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:4)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，得粗酶溶液；在100mL玻璃反应瓶中，加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3， 2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨 (0.01mol/l)，再加入ddH₂O将反应体系补至10ml，最后加入1ml(14mg)粗酶溶液(SEQ ID NO:4)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

实施例5

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:5)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，得粗酶溶液；在100mL玻璃反应瓶中，加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3， 2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨 (0.01mol/l)，再加入ddH₂O将反应体系补至10ml，最后加入1ml(14mg)粗酶溶液(SEQ ID NO:5)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

实施例6

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的20 μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性 15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:1)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入 ddH2O将反应体系补至10ml，最后加入5ml(7mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:1)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可达70％。

实施例7

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR 扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:2)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入 ddH2O将反应体系补至10ml，最后加入5ml(7mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:2)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达98.7％。

实施例8

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的20 μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性 15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:3)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入 ddH2O将反应体系补至10ml，最后加入5ml(7mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:3)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达98.8％。

实施例9

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的20 μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性 15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:4)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入 ddH2O将反应体系补至10ml，最后加入5ml(7mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:4)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达99.9％。

实施例10

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的20 μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性 15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:5)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入100μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，400μl ATP钠盐(0.1mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，3ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入 ddH2O将反应体系补至10ml，最后加入5ml(7mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:5)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达99.9％。

实施例11

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的20 μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性 15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:1)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入33μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，67μl ATP钠盐(0.1 mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，1ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入ddH2O 将反应体系补至3.3ml，最后加入1.6ml(3.5mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:1)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可达60％。

实施例12

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的20 μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性 15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:2)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入33μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，67μl ATP钠盐(0.1 mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，1ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入ddH2O 将反应体系补至3.3ml，最后加入1.6ml(3.5mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:2)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达95％。

实施例13

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴3 0min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR 扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:3)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入33μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，67μl ATP钠盐(0.1 mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，1ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入ddH2O 将反应体系补至3.3ml，最后加入1.6ml(3.5mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:3)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达95％。

实施例14

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的 20μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR 扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:4)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入33μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，67μl ATP钠盐(0.1 mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，1ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入ddH2O 将反应体系补至3.3ml，最后加入1.6ml(3.5mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:4)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达98％。

实施例15

选用序列表中所示核苷酸序列与载体pBAD-D连接，取20μl连接产物加入冰浴的200μl大肠杆菌TOP10感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60s，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，涂在氨苄抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含氨苄抗性的平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号，然后将牙签置于已加入引物中的20 μl PCR Mix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性 15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后在72℃，保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含目标酶序列(SEQ ID NO:5)的大肠杆菌菌株；酶在大肠杆菌内进行表达后将菌经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30 min后提取上清液，使上清液流经Ni柱后用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，随后再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCL)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到纯化的酶溶液；在 100mL玻璃反应瓶中，依次加入33μl磷酸盐缓冲液(PH＝7.3，2mol/l)，67μl ATP钠盐(0.1 mol/l)，40μl无水硫酸镁溶液(1mol/l)，1ml氟达拉滨(0.01mol/l)，再加入ddH2O 将反应体系补至3.3ml，最后加入1.6ml(3.5mg)纯化酶溶液(SEQ ID NO:5)。控制反应液温度37℃，控制反应液pH在7.3—7.6之间，搅拌均匀后反应3h。

上述反应完成后，将反应后的溶液进行离心处理，过0.22μm的滤膜。取10μl 上清液用高效液相色谱(液相条件∶色谱柱∶C18(4.6×250mm，5μm)；取3.4g磷酸二氢钾加水溶解并稀释至1000ml，用10％磷酸调pH至3.0，抽滤，配制成磷酸二氢钾：甲醇＝94:6的流动相；流速∶0.5ml/min；柱温∶25℃；进样量∶10μl；检测波长∶210nm；检测得转化率可高达98％。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 江苏海洋大学

连云港杰瑞药业有限公司

<120> 一种生物催化合成磷酸氟达拉滨的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> unknown

<400> 1

atgcatcatc atcatcacca tagcagcggc aacaactatg gcattccgca gaacgcgatt 60

attaccattg cgggcaccgt gggcgtgggc aaaagcaccc tgacccaggc gctggcggat 120

aaactgaact ttaaaaccag ctttgaaaac gtggaacata acccgtatct ggataaattt 180

tatagcgatt ttgaacgctg gagctttcat ctgcagattt attttctggc ggaacgcttt 240

aaagaacaga aacgcatgtt tgaatatggc ggcggctttg tgcaggatcg cagcatttat 300

gaagatgtgg atatttttgc gaaaatgcat gaagaagaag gcaccatgag caaagaagat 360

tttaaaacct atagcgatct gtttaacgcg atggtgatga ccccgtattt tccgaaaccg 420

gatgtgatga tttatctgga atgcaactat gatgaagtga ttgatcgcat tattgaacgc 480

ggccgcgaaa tggaaattaa caccgatccg gaatattgga aaaaactgtt taaacgctat 540

gatgattgga ttaacagctt taacgcgtgc ccggtggtgc gcattaacat taacgaatat 600

gatattcata aagatccgga tagcctgaac ccgatgattg ataaaattgc gcgcattatt 660

cagacctatc gccaggtgga tacccgctaa 690

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> unknown

<400> 2

atgcatcatc atcatcacca tagcagcggc accaccccga ttctgaacag cagcgtgccg 60

ggcaacaaca actatggcat tccgcagaac gcgattatta ccattgcggg caccgtgggc 120

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tttcatctgc agatttattt tctggcggaa cgctttaaag aacagaaacg catgtttgaa 300

tatggcggcg gctttgtgca ggatcgcagc atttatgaag atgtggatat ttttgcgaaa 360

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<210> 3

<211> 765

<212> DNA

<213> unknown

<400> 3

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gaaaacgtgg aacataaccc gtatctggat aaattttata gcgattttga acgctggagc 240

tttcatctgc agatttattt tctggcggaa cgctttaaag aacagaaacg catgtttgaa 300

tatggcggcg gctttgtgca ggatcgcagc atttatgaag atgatatttt tgcgaaaatg 360

catgaagaag aaggcaccat gagcaaagaa gattttaaaa cctatagcga tctgtttaac 420

gcgatgaccc cgtattttcc gaaaccggat gtgatgattt atctggaatg caactatgat 480

gaagtgattg atcgcattat tgaacgcggc cgcgaaatgg aaattaacac cgatccggaa 540

tattggaaaa aactgtttaa acgctatgat gattggatta acagctttaa cgcgtattgc 600

ccggtggtgc gcattaacat taacgaatat aaagatccgg atagcctgaa cccgatgatt 660

gataaaattg cgcgcattat tcagacctat cgccaggtgg atacccgcac ctttggcaac 720

ggcccgacca ccaacaaaat tattagcacc ccgaaagatc tgtaa 765

<210> 4

<211> 765

<212> DNA

<213> unknown

<400> 4

atgcatcatc atcatcacca tagcagcggc accaccccga ttctgaacag cagcgtgccg 60

ggcaacattc agaaaaaaag cctggaaggc acccatatta ccattgcggg caccgtgggc 120